Isolierung von Kardiomyozyten aus festen Herzen für die Immunzytochemie und Ploidie-Analyse

Zusammenfassung

Ziel dieser Arbeit ist es, eine Methode zu entwickeln, um Kardiomyozyten reproduzierbar vom Erwachsenenherz zu isolieren und DEN DNA-Gehalt und die Keimbildung zu messen.

Zusammenfassung

Das erwachsene Säugetierherz besteht aus verschiedenen Zelltypen, darunter Kardiomyozyten, Endothelzellen und Fibroblasten. Da es schwierig ist, Kerne von Kardiomyozyten auf histologischen Abschnitten zuverlässig zu identifizieren, verlassen sich viele Gruppen darauf, lebensfähige Kardiomyozyten vor der Fixierung zu isolieren, um eine Immunfärbung durchzuführen. Diese Live-Kardiomyozyten-Isolationstechniken erfordern jedoch eine Optimierung, um die Ausbeute, Lebensfähigkeit und Qualität der Proben zu maximieren, mit inhärenten Schwankungen von Probe zu Probe trotz maximaler Optimierung. Hier berichten wir über ein reproduzierbares Protokoll mit Fixierung vor der enzymatischen Verdauung des Herzens, das zu einer maximalen Ausbeute führt und gleichzeitig die In-vivo-Morphologie einzelner Kardiomyozyten beibehalte. Wir haben eine automatisierte Analyseplattform entwickelt, um die Anzahl der Kerne und den DNA-Gehalt pro Kern für einzelne Kardiomyozyten zu bestimmen. Nach der Entlarvung der Brusthöhle wurde das Herz in Diastole durch Perfusion mit 60 mM KCl in PBS verhaftet. Als nächstes wurde das Herz in 4% Paraformaldehyd (PFA) Lösung fixiert und dann mit 60 mg/ml Kollagenaselösung verdaut. Nach der Verdauung wurden die Zellen durch Trituration singuliert und die Kardiomyozytenfraktion wurde durch Differentialzentrifugation angereichert. Isolierte Kardiomyozyten wurden für Troponin T und α-Actinin gefärbt, um die Reinheit der erhaltenen Population zu beurteilen. Darüber hinaus haben wir eine Bildanalyseplattform entwickelt, um die Kardiomyozytenkernbildung und den Ploidie-Status nach DAPI-Färbung zu bestimmen. Bildbasierte Ploidy-Bewertungen führten zu konsistenten und reproduzierbaren Ergebnissen. So ist es mit diesem Protokoll möglich, die native Morphologie einzelner Kardiomyozyten zu erhalten, um Immunzytochemie und DNA-Gehaltsanalyse zu ermöglichen und gleichzeitig eine maximale Ausbeute zu erzielen.

Einleitung

Herzkrankheiten sind in den meisten westlichen Ländern seit vielen Jahrzehnten die häufigste Todesursache^1,2. Obwohl viele Verbesserungen bei der Behandlung von Herz-Kreislauf-Erkrankungen das Überleben verbessert haben, gibt es derzeit keine Behandlungen, die verlorene Kardiomyozyten ersetzen können. Daher, Studien im Zusammenhang mit Kardiomyozytenfunktion, Proliferation, Apoptose und Hypertrophie waren und sind ein Schwerpunkt der wissenschaftlichen Gemeinschaft. Da das erwachsene Säugetierherz eine sehr begrenzte Regenerationskapazität hat, mit einer geschätzten Kardiomyozytenerneuerungsrate von weniger als 1% pro Jahr, ist es von entscheidender Bedeutung, kardiomyozytenproliferative Ereignisse zuverlässig zu identifizieren^3,4. Die meisten Strategien, die proliferative Ereignisse messen, basieren entweder auf der Färbung für eingebaute DNA-Nukleotid-Analoga, um die vorherige oder aktuelle Proliferation zu bewerten, oder Flecken für kerntechnische Marker aktiver Proliferation⁵. Es ist besonders wichtig, kardiomyozyten proliferative Ereignisse zuverlässig zu identifizieren, da die Gesamtzahl der proliferativen Kardiomyozyten so niedrig ist^3,6. Zum Beispiel, basierend auf einer 1% Erneuerungsrate von endogenen Kardiomyozyten pro Jahr, kann man erwarten, zwischen 25 und 50 Kardiomyozyten zu einem bestimmten Zeitpunkt im erwachsenen Mausherz^7,8zu proliferativ zu finden. Ungenauigkeiten bei der Identifizierung von Kardiomyozytenkernen können zu falsch positiven Ergebnissen führen. Daher ist es wichtig, Kardiomyozytenkerne zuverlässig zu identifizieren, was sich aus den histologischen Abschnitten⁹als schwierig und unzuverlässig erwiesen hat. Die Identifizierung von Kardiomyozyten ist viel genauer von Einzelzellen als von Gewebeabschnitten, da es schwierig sein könnte, Kardiomyozyten von anderen Zelltypen zu unterscheiden, selbst wenn Marker wie α-Actinin verwendet werden, obwohl PCM1 ein zuverlässiger Marker von Kardiomyozytenkernen in histologischen Abschnitten¹⁰sein könnte.

Aktuelle Protokolle basieren auf der Isolierung von lebenden Kardiomyozyten vor der Fixierung, die bekanntermaßen zum Tod von mindestens 30% der Kardiomyozyten führt und zu einer unbeabsichtigten Auswahl bestimmter Populationen von Kardiomyozyten führen kann¹¹. Darüber hinaus sind diese Protokolle notorisch schwierig zu optimieren, um reproduzierbare Ergebnisse zu liefern. Selbst optimierte Isolationstechniken können in der Regel nicht mehr als 65 % lebende, stabförmige Kardiomyozyten mit unterschiedlichen Erträgen¹²produzieren.

Um diese Probleme zu überwinden, haben wir ein Protokoll entwickelt, das es Forschern ermöglicht, feste Kardiomyozyten zu isolieren. Da die Proben vor der Isolierung fixiert sind, wird die Ausbeute maximiert und die In-vivo-Morphologie gut erhalten. Darüber hinaus ist es mit diesem Protokoll möglich, Kardiomyozyten aus klinischen Proben zu isolieren, die in der Regel unmittelbar nach der Beschaffung fixiert werden. Darüber hinaus ist es bei der Identifizierung neu generierter Kardiomyozyten wichtig, den Keim- und Ploidiestatus einzelner Kardiomyozyten zu messen, da in der Regel nur diploide Kardiomyozyten als neu gebildet angenommen werden. Die Durchflusszytometrie kann Multinukleation und Polyploidie nicht unterscheiden und ist ein relativ zeit- und ressourcenintensives Protokoll. Die manuelle Umrissung und Messung von Kernen in Bildern ist sehr geringer Durchsatz und anfällig für menschliche Voreingenommenheit. Die automatisierte Quantifizierung von Bildern von festen, isolierten DAPI-befleckten Kardiomyozyten löst beide Probleme. Die bildgebende Bestimmung der Nukleation und der Ploidie-Verteilung kann mit einem Minimum an Zeit und Reagenzien mit Grundausstattung erreicht werden.

Protokoll

Alle Tierversuche wurden gemäß den Richtlinien der National Institutes of Health durchgeführt und vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der University of Minnesota genehmigt.

1. Vorbereitung der Lösungen und chirurgischen Geräte

1. Sterilisieren Sie vor der Isolierung die chirurgischen Geräte mit 70% Ethanollösung.
2. Fügen Sie 2,24 g KCl zu 500 ml Phosphatgepufferte Saline (PBS) Lösung hinzu, um eine Endkonzentration von 60 mM zu erhalten. KCl-PBS-Lösung bei Raumtemperatur aufbewahren. Verwenden Sie 3 ml KCl-PBS-Lösung pro Maus.
3. 32% Paraformaldehyd (PFA) Lösung mit PBS in eine Endkonzentration von 4% PFA verdünnen. Bereiten Sie 10 ml von 4% PFA in PBS pro Maus vor. Verdünnte PFA-Lösung kann bei 4 °C für 2-3 Wochen in einem Glasbehälter gelagert werden.
   HINWEIS: Vorbereitete 4% PFA-Lösung kann bei -20 °C für längere Zeit gelagert werden.
4. Bereiten Sie 1 ml Kollagennase-Lösung pro Maus vor, indem Sie 60 mg Kollagennase, Typ 2 pro 1 ml PBS hinzufügen.

2. Perfusion und Fixierung des Herzens

1. Anästhesisieren Sie das Tier mit 2-5% Isofluran mit einer Sauerstoffdurchflussrate von 1 l/min. Bestätigen Sie die Anästhesie, indem Sie Bewegungsmangel und eine niedrigere Atmungsrate bestätigen.
   HINWEIS: Die Injektion von Heparin (100-500 U/kg) vor der Euthanasie kann die Zellqualität und Ausbeute erhöhen, indem Blutgerinnsel verhindert werden, wodurch eine effizientere Durchblutung des Herzens mit fixativen ermöglicht wird.
2. Euthanisieren Sie das Tier nach zugelassenen Methoden.
   HINWEIS: Wir haben uns an die Richtlinien der American Veterinary Medical Association für die Euthanasie von Tieren und die lokale IACUC-Zulassung für Euthanasie befolgt.
3. Legen Sie das eingeschläferte Tier in Supine-Position, und band nach unten verlängerte Gliedmaßen.
4. Schneiden Sie durch die Brust, um das Herz mit stumpfen Ende Schere aussetzen. Schneiden Sie absteigende Aorta und minderwertige Kavalavene.
5. Durch Injektion von 3 ml KCl-PBS-Lösung durch die linke Herzkammer mit einer Durchflussrate von 3 ml/min mit einer peristaltischen Pumpe, die an einem Infusionsset mit einer 23 G Schmetterlingsnadel (26 G für Neonate) befestigt ist, durchdringen. Achten Sie darauf, nicht durch das Septum zu durchbohren.
   HINWEIS: Alternativ können Sie eine Nadel verwenden, die an einer Spritze befestigt ist, um Lösungen zu injizieren.
6. Durch Injektion von 10 ml 4% PFA-Lösung für 10 min mit einer peristaltischen Pumpe mit einer Rate von 1 ml/min.
7. Entfernen Sie das ganze Herz mit einer Schere. Nach dem Entfernen des Herzens ist es möglich, eine bestimmte Region des Herzens durch Einschneiden zu isolieren. Legen Sie das Herz oder ein Segment davon in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr, das 1 ml 4% PFA-Lösung enthält. Inkubieren Sie das Herz auf Rocker bei Raumtemperatur mit Schaukelgeschwindigkeit zwischen 20-30 Rpm für 1 h.

3. Isolierung von festen Kardiomyozyten

1. Legen Sie das Herz in eine Petrischale mit PBS-Lösung. Drücken Sie das Herz, um alle PFA loszuwerden, die in Ventrikeln verbleiben, und waschen Sie sie in PBS.
2. Setzen Sie das fixierte Herz in ein neues 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr mit Kollagennaselösung (60 mg/ml). Legen Sie die Röhre auf Dieb (20-30 U/min) bei 37 °C für die nächtliche Inkubation.
   HINWEIS: Verlängern Sie die Inkubationszeit auf 1 Woche und füllen Sie die Kollagenaselösung alle zwei Tage auf, um die mögliche Ertragsvariation zu reduzieren, wenn die Herzen voraussichtlich fibrotisch sind, was eine längere Zeit der Kollagenaseverdauung erfordern könnte, um extrazelluläres Kollagen zu verdauen.
3. Legen Sie Kollagenaselösung und das Herz in eine 35 mm Petrischale. Dissoziieren Sie das Herz in 1 mm Stücke mit Zangen oder Schere.
4. Verwenden Sie eine Transferpipette, um das dissoziierte Gewebe für 2 min weiter zu trituratieren. Wenn Gewebepartikel noch in der Schale verbleiben, verwenden Sie eine Transferpipette mit schmalerer Öffnung und setzen Sie die Triturierung fort. Fahren Sie fort, bis der Großteil des Gewebes abgebaut ist.
   HINWEIS: Über Trituration bewirkt, dass einzelne Kardiomyozyten brechen. Achten Sie darauf, nicht zu trituieren, indem Sie regelmäßig unter dem Mikroskop überprüfen.
5. Legen Sie ein 200-600 m Nylongewebe über die Öffnung des 15 ml Zentrifugenrohrs.
   HINWEIS: Für hypertrophierte Kardiomyozyten wird empfohlen, 400 m Nylongewebe anstelle von 200 m zu verwenden.
6. Fügen Sie der Petrischale, die dissoziierte Zellen enthält, 5 ml PBS hinzu und filtern Sie die Lösung durch Nylongewebe, einschließlich Gewebepartikel. Waschen Sie das Nylongewebe, indem Sie zusätzliche 4 ml PBS passieren.
7. Zentrifugieren Sie die gefilterte Lösung bei 10-100 x g für 1 min.
   HINWEIS: 100 x g Zentrifugation ergibt keine 100% reine Kardiomyozytenpopulation, und einige Nicht-Kardiomyozytenzellen werden wahrscheinlich einbezogen.
8. Entsorgen Sie den Überstand, es sei denn, man will auch Herzzellen ohne Kardiomyozyten färben/bewerten. Das Pellet in 10 ml PBS vor der Färbung wieder aufhängen.

4. Färbung von Kardiomyozyten

1. Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 100 x g für 1 min und fügen Sie 5 ml Permeabilisationslösung hinzu (z. B. 0,5% Triton X-100 in PBS). 20 min bei Raumtemperatur auf Wippe inkubieren.
   HINWEIS: Verwenden Sie für die Schritte 4.1, 4.2 und 4.4 15 ml Zentrifugenrohre, da es einfacher ist, den Überstand zu entfernen, ohne das Zellpellet im Vergleich zu 1,5 ml Mikrozentrifugenrohren zu stören.
2. Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 100 x g für 1 min, fügen Sie 5 ml Sperrpuffer hinzu (z. B. 3% Rinderserumalbumin [BSA] in PBS) und 30 min bei Raumtemperatur auf einer Wippe brüten.
3. Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 100 x g für 1 min und fügen Sie 1 ml primäre Antikörperlösung (in PBS) mit dem entsprechenden Verdünnungsverhältnis hinzu. Übertragen Sie die Lösung in 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr und inkubieren Sie Kardiomyozyten in Primärantikörperlösung unter optimierten Bedingungen (z. B. 4 °C über Nacht).
4. Transfer Cardiomyozyten mit Primärantikörperlösung auf ein 15 ml Zentrifugenrohr übertragen und 9 ml PBS hinzufügen. Inkubieren Sie die Kardiomyozyten für 10 min bei Raumtemperatur auf einer Wippe.
5. Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 100 x g für 1 min und fügen Sie 10 ml PBS hinzu. Inkubieren Sie die Kardiomyozyten für 10 min bei Raumtemperatur auf einer Wippe. Wiederholen Sie diesen Schritt noch einmal.
6. Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 100 x g für 1 min und fügen Sie die sekundäre Antikörperlösung, die DAPI enthält. 30 min bei Raumtemperatur auf einer Wippe inkubieren, gefolgt von der Wiederholung von Schritt 4,5 zweimal, um Kardiomyozyten zu waschen.
7. Legen Sie die Zellen entweder auf Abdeckungen oder mikroskopkompatible Platten und gehen Sie mit der Bildgebung fort.
   HINWEIS: Die im Manuskript enthaltenen Bilder wurden mit 10x- und 40x-Objektiven aufgenommen. Laser wurden verwendet: 405 nm für DAPI, 561 nm für Alpha Actinin und 640 nm für Edu.

5. Setup Imaging-Software

HINWEIS: Folgen Sie diesen Schritten mit Supplementary File 1-SoftwareScreenshots.pdf.

1. Laden Sie die Fidschi-Distribution von ImageJ herunter.
2. Öffnen Sie Fidschi. Klicken Sie auf Hilfe > Aktualisieren... > Update-Sites verwalten. Überprüfen Sie die Update-Sites "IJPB-plugins" und "Biomedgroup", um die Dependenncies Plugins Ellipse Split und Morpholibj herunterzuladen.
3. Klicken Sie auf Schließen. Fidschi sollte mit dem Herunterladen der Abhängigkeiten beginnen. Starten Sie Fidschi neu, wenn Sie fertig sind.
4. Laden Sie Rstudio herunter und öffnen Sie es.
5. Kopieren Sie install.packages( c ("ggplot2", "autothresholdr", "dplyr", "purrr", "jsonlite", "shiny")) in die Befehlszeile der R-Konsole und drücken Sie die Eingabetaste. c Geben Sie "y" als Antwort auf alle Eingabeaufforderungen ein, um alle R-Abhängigkeiten zu installieren (Screenshot 1 in Der Zusatzdatei 1).

6. Bildquantifizierung

1. Öffnen Sie Fidschi und ziehen Sie "AnalyzeNucleation.py" (als zusätzliche Codedatei geliefert) in die Statusleiste von Fidschi. Dadurch wird ein Skriptbearbeitungsfenster geöffnet. Klicken Sie in der linken unteren Ecke auf Ausführen, um sie zu starten (Screenshot 2 in Der Zusatzdatei 1).
2. Es erscheint ein Dialogfeld (Ergänzende Datei 1: Screenshot 3), in dem nach dem Speicherort des Ausgabedatenverzeichnisses gefragt wird. Alle Analysedaten, Zahlen und anderen Daten, die von dieser Software verwendet werden, werden in diesem Ordner gespeichert. Ein weiteres, größeres Dialogfeld wird angezeigt, in dem alle Einstellungen für die Bildanalyse angezeigt werden(Ergänzende Datei 1: Screenshot 4).
   1. Wählen Sie den Speicherort des Verzeichnisses aus, das zu analysierende Bilder enthält.
   2. Geben Sie das Bilddateinamenformat mithilfe regulärer Ausdrücke ein. Geben Sie das Bilddateinamenformat ein, das angibt, welche Teile des Dateinamens Zeilen-, Spalten-, Kanal- und (optional) Site in klammernden Ausdrücken entsprechen. Legen Sie keine Leerzeichen in die geschweiften Klammern. Umgeben Sie Variable Teile des Dateinamenformats in geschweiften Klammern. Die Art und Weise, wie Dateien gespeichert werden, hängt von der Imaging-Software ab, und dieser Schritt ruft relevante Informationen aus dem Bilddateinamen ab.
      ANMERKUNG: Z. B. die Formatzeichenfolge
      r" Platte 1-(? P[A-Za-z]+)(? P[0-9]+)-(? P[A-Za-z]+).tif"
      beschreibt einen Dateinamen, der mit "Platte 1-" beginnt, gefolgt von einem oder mehreren alphabetischen Buchstaben, die die Zeile anzeigen, gefolgt von einer oder mehreren Ziffern, die die Spalte angibt, gefolgt von "-", gefolgt von einem oder mehreren Buchstaben, die den Kanal ananzeigen, gefolgt von ".tif". Die Buchstaben innerhalb der spitzen Klammern wie "<>" sind Variablennamen und werden automatisch in die Daten kopiert, wenn sie gesammelt werden. Einer der Variablennamen muss "" sein.
   3. Geben Sie den Namen der Kanäle an, in denen der nukleare Fleck sichtbar ist und wo die Kardiomyozyten sichtbar sind. Diese Namen müssen genau so sein, wie sie sich in dem Teil befinden, der mit der Variable "" in den Dateinamen des regulären Ausdrucks übereinstimmt.
   4. Geben Sie an, wie die Bilder mit durch Kommas getrennten Variablennamen gruppiert werden sollen. Alle Bilder innerhalb einer bestimmten Gruppe werden in einem Stapel geöffnet und analysiert. Wenn die Bilder z. B. in Sätze für jeden Brunnen unterteilt sind und es für jede eindeutige Kombination aus Zeile und Spalte einen Brunnen gibt, schreiben Sie "Zeile, Spalte" in dieses Feld.
      HINWEIS: Diese Gruppierungsvariablen müssen eine Teilmenge der Variablen sein, die in der Formatzeichenfolge verwendet werden. Verwenden Sie "Kanal" nicht als Gruppierungsvariable, dies trennt die entsprechenden Kanalbilder voneinander.
   5. Geben Sie an, ob Bilder in einem Brunnenbild zusammengenäht oder für jede Site getrennt sind. Im ersten Fall sollte die Site nicht in der Dateinamenformatzeichenfolge angegeben werden.
   6. Wählen Sie aus, welche Schwellenwertmethode verwendet werden soll, um Kerne vom Hintergrund zu trennen. Alle Standard-Schwellenwertmethoden von Fidschi sind verfügbar. Testen Sie verschiedene Schwellenwertmethoden, um zu bestimmen, welche für den Bildsatz am besten funktioniert. Wählen Sie in diesem Beispiel die Otsu-Methode aus.
   7. Geben Sie an, ob der Schwellenwert für jedes Standortbild neu berechnet werden soll oder ob für jedes Bild in der Gruppe derselbe Schwellenwert verwendet werden soll. Geben Sie an, ob die Kardiomyozytenbilder hellfeldsind oder einen fluoreszierenden Marker verwenden.
   8. Geben Sie die Kardiomyozytenschwellenmethode an. Wenn im vorherigen Schritt hellfeld ausgewählt wurde, wird diese Schwellenwertmethode auf randgefilterte Hellfeldbilder angewendet. Geben Sie an, ob der Schwellenwert für jedes Standortbild neu berechnet werden soll oder ob für jedes Bild in der Gruppe derselbe Schwellenwert verwendet werden soll.
   9. Geben Sie die Anzahl der Zeilen von Standortbildern an, die jeden Brunnen abdecken. Geben Sie die Anzahl der Spalten von Website-Images an, die jeden Brunnen abdecken. Geben Sie den minimalen Bereich der Kerne in Pixelanteilen an. Verwenden Sie eine großzügig niedrige Mindestgröße, ein höherer und präziserer Schwellenwert wird im Analyseschritt berechnet. Geben Sie den Mindestbereich von Kardiomyozyten an.
   10. Nachdem Sie die gewünschten Einstellungen ausgewählt haben, klicken Sie auf OK.
3. Auf dem Bildschirm werden Bilder angezeigt, die denen in Abbildung 3 und Abbildung 4 ähneln und die verschiedenen Phasen der Analysepipeline zeigen. Überprüfen Sie diese Bilder, um sicherzustellen, dass Schwellenwerte und Segmentierung enden.
4. Der ausgewählte Ergebnisordner sollte nun mit Analysedaten gefüllt werden(Ergänzende Datei 1: Screenshot 5). Andere Dateien als Analysedaten können sicher in diesem Ordner gespeichert werden, solange ihre Namen nicht mit "cm_", "nuclei_" oder "nucleilink_" beginnen.

7. Datenanalyse

HINWEIS: Die erstellten csv-Dateien können manuell analysiert werden. Jede analysierte Bilduntermenge erzeugt ein Triplet von csv-Dateien mit dem Namen "nuclei(metadata).csv", "nucleilink(metadata).csv" und "cardiomyocytes(metadata),csv", wobei (Metadaten) durch eine Sequenz von Namens-Wert-Paaren der Form "_(name)=(value)" ersetzt werden, wobei (Name) und (Wert) Sequenzen von alphanumerischen Zeichen sind, die von Zeichenfolgen abgeleitet wurden, die zuvor von Zeichenfolgen abgeleitet wurden. (Wenn z. B. Zeile und Spalte in den Dateinamen angegeben wurden, sind Zeichenfolgen wie "_row=F" und "_column=8" vorhanden). Die unbenannte linke Spalte jeder Kern- und Kernlinkdatei ist eine Kern-ID-Nummer. Die "Min"-Spalte der Nucleilink-Datei ist die ID der Kardiomyozyten, die diesen Kern ganz oder 0 enthielt. Die Spalte "Max" der Kerne ist die ID der am höchsten nummerierten Kardiomyozyten, die diesen Kern teilweise enthielt, oder 0 sonst. Die Spalte "Mean" der Kardiomyozytendatei ist die Cardiomyozyten-ID-Nummer.

1. Öffnen Sie "AnalyzeMultinucleatedServer.R" in Rstudio (als zusätzliche Codedatei bereitgestellt).
2. Am Anfang dieser Datei befindet sich eine Variable mit dem Namen "folderName". Daneben befindet sich ein Dateipfad. Geben Sie hier den Pfad zum Ausgabedatenordner ein, der im letzten Schritt ausgewählt wurde, ohne den letzten Schrägstrich(Zusatzdatei 1: Screenshot 6).
3. In der oberen linken Ecke des Skriptbearbeitungsfensters sollte ein grüner Pfeil mit der Bezeichnung App ausführenangezeigt werden. Klicken Sie auf diesen Pfeil. Es kann einige Zeit dauern, bis die Daten geladen werden und die App angezeigt wird.
4. Zunächst werden drei Gating-Diagramme sichtbar sein, eine zur Angabe des minimalen gültigen Schwellenwerts für den kerntechnischen Bereich, eine zur Angabe des minimalen Schwellenwerts für die zulässige mittlere Intensität des Kernwerts und eine zur Angabe des maximalen gültigen Mindestdurchmessers für Kardiomyozyten. Verwenden Sie die Schieberegler, um diese Schwellenwerte festzulegen (Zusatzdatei 1: Screenshot 7).
   HINWEIS: In jedem dieser Graphen sollte ein großer, breiter Spitzenwert vorhanden sein, der gültigen Kernen oder Kardiomyozyten entspricht, flankiert von breiten Schwänzen, die Trümmer oder fehlerhafte segmentierte Kardiomyozyten darstellen. Verwenden Sie die Schwellenwerte, um einen Schwanz jedes der Peaks abzuschneiden.
5. Scrollen Sie nach unten. Klicken Sie auf die Schaltfläche Ausgewählte Schwellenwerte anwenden (unten in der Zusatzdatei 1: Screenshot 7).
6. Klicken Sie auf die Schaltfläche Plot Intensitätsverteilung. Dadurch wird die Kernintensitätsverteilung sowohl der gesamten Probe als auch separate Subplots für jede Gruppierungsvariable dargestellt.
   HINWEIS: Wenn z. B. und Gruppierungsvariablen in den regulären Ausdruck im Fidschi-Dialog eingegeben wurden, werden hier Diagramme angezeigt, die die Intensitätsverteilung nach Zeile und Spalte angeben (Ergänzende Datei 1: Screenshot 8). Wenn die Beleuchtungs- und Färbebedingungen in den verschiedenen Teilen der Probe konstant waren, sollten diese Diagramme alle deutlich zwei Intensitätsspitzen aufweisen, einen Dimmer, einen größeren für die diploiden Kerne und einen helleren, kürzeren für die tetraploiden Kerne.
7. Intrasample-Variation führt dazu, dass dieses Muster im gesamten Stichprobendiagramm nicht sichtbar ist und es eine große Vielfalt an der Position der diploiden und tetraploiden Spitzen nach Zeile, Spalte oder einer anderen Gruppierungsvariablen gibt. Im letzteren Fall scrollen Sie nach unten und aktivieren Sie das Kontrollkästchen Separatenach Gruppe normalisieren, um diese Variante zu berücksichtigen(Ergänzende Datei 1: Screenshot 9).
8. Klicken Sie auf die Schaltfläche Ploidy berechnen (Zusatzdatei 1: Screenshot 9). Klicken Sie auf die Schaltfläche Plot Estimated Ploidy Distribution. Diagramme werden in den leeren Fenstern auf der rechten Seite angezeigt. Im normalisierten Gesamtstichprobendiagramm sollte das Zwei-Spitzen-Muster sichtbar sein, wenn es vorher nicht war.
9. Wählen Sie Schwellenwerte aus, um die diploiden und tetraploiden Spitzen voneinander und Ausreißer mit den Schiebereglern zu isolieren (Ergänzende Datei 1: Screenshot 9). Scrollen Sie nach unten. Klicken Sie auf die Schaltfläche Ploidy und Nukleation berechnen (Zusatzdatei 1: Screenshot 10).
10. Klicken Sie auf die Schaltfläche Plotten und Speichern in Ergebnisordner. Das im ausgewählten Ergebnisordner gespeicherte Diagramm wird auch in diesem interaktiven Fenster angezeigt(Ergänzende Datei 1: Screenshot 10).

Ergebnisse

Cardiomyozyten wurden gemäß dem oben beschriebenen Protokoll isoliert. Mit dieser Methode erhalten wir in der Regel einheitlich singuläre Kardiomyozyten, die relativ rein sind, ohne nicht-kardiomyozyten Zellen zu kontaminieren (Abbildung 1A). Kardiomyozyten lassen sich unter der Hellfeldmikroskopie aufgrund ihrer charakteristischen Größe und Birefreringität leicht identifizieren. Diese Technik ist einfach zu implementieren und liefert konsistente Ergebnisse aus verschiedenen Isolationen mit vergleichbaren Kardiomyozytenausbeuten und Qualität (Abbildung 1B). Isolierte Kardiomyozyten können vor der weiteren Anwendung bei 4 °C gelagert werden.

Kardiomyozyten, die gemäß dem obigen Protokoll isoliert wurden, können für verschiedene nachgeschaltete Anwendungen verwendet werden, wie z. B. die Messung der Kardiomyozytengröße, der Kardiomyozytenploidie und der Immunzytochemie. Als repräsentatives Ergebnis zeigen wir, dass nach diesem Protokoll isolierte Kardiomyozyten mit Antikörpern und fluorchromekonjugierten Aziden für die Klickchemie gefärbt werden können, um die Lokalisierung bestimmter Proteine zu erkennen bzw. die DNA-Replikation von Kardiomyozyten zu erkennen. Zum Beispiel haben wir Kardiomyozyten mit Antikörpern gefärbt, die α-Aktinin erkennen, um das charakteristische Z-Linien-Färbemuster von Sarkomen zu zeigen (Abbildung 2A). In einem separaten Experiment verabreichten wir Mäusen das Thymidin-Analog-Analog-5-Ethynyl-2'-Deoxyuridin (EdU), bevor wir feste Kardiomyozyten isolierten. Nach der Kardiomyozytenisolierung färbten wir edU mit den Standardprotokollen¹³und konnten Kardiomyozyten, die die S-Phase durchlaufen hatten, entweder in mononukleierten, binucleierten und trinukleierten Kardiomyozyten erkennen (Abbildung 2B).

Um den Nutzen der Isolationsmethode weiter auszubauen, haben wir eine Pipeline entwickelt, die die Quantifizierung der Kardiomyozytenploidie auf Basis integrierter DNA-Färbung ermöglicht. Um den Ploidie-Status von Zellen oder Kernen messen zu können, mussten wir Kerne und Kardiomyozyten segmentieren. Abbildung 3 zeigt eine Darstellung der Strategie, die wir verwendet haben, um einzelne Kerne zu identifizieren. Zunächst wird das Originalbild DNA-gebeiztes Bild (Abbildung 3A) basierend auf der Intensität(Abbildung 3B) schwellenwertiert. Hier verwendeten wir DAPI, um DNA zu färben, aber jeder andere Kernfarbstoff, der eine lineare Korrelation mit dem DNA-Inhalt zeigt, würde funktionieren. Das Programm ermöglicht es, eine der Intensitätsschwellenmethoden von Fidschi zu wählen, aber in diesem Beispiel wurde Otsu-Methode verwendet. Kernmasken, die den Rand des Bildes berühren oder kleiner als der angegebene Schwellenwert für den Minimalpixelbereich sind, werden ausgeschlossen. Dann sind Ellipsen auf die Kernmasken abgestimmt und segmentieren einzelne Kerne. Abbildung 3C zeigt diese Ellipsen, die auf dem Originalbild überlagert sind. Als Nächstes werden Löcher in die Masken gefüllt, und die Pixel des Bildes werden dann in Gebiete partitioniert, basierend auf der Ellipse, die sie am proximalsten sind (Abbildung 3D). Die Grenzen dieser Gebiete werden dann verwendet, um Linien durch Kerncluster zu ziehen und den nuklearen Segmentierungsprozess zu beenden (Abbildung 3E).

Der nächste Schritt beinhaltet die Detektion von Kardiomyozyten. Bei Kardiomyozytenbildern, die auf der Grundlage fluoreszierend gefärbter Zellen gewonnen werden (Abbildung 4A), ist der Prozess dem für Kerne sehr ähnlich. Das Bild wird basierend auf einem Intensitätswert, der von der ausgewählten Schwellenwertmethode, in diesem Fall der Dreiecksmethode, berechnet wird, schwellenwertiert. Identifizierte Kardiomyozytenmasken, die die Grenze des Bildes berühren oder unter einer bestimmten Größe liegen, werden ausgeschlossen und Löcher werden in die Masken gefüllt, um richtig segmentierte Kardiomyozyten bereitzustellen (Abbildung 4B). Da Kardiomyozyten eine unregelmäßigere Form als Kerne haben, wird kein Versuch unternommen, Kardiomyozyten-Cluster zu segmentieren. Stattdessen werden diese Cluster aufgrund ihres hohen Minimaldurchmessers von Feret während des Analyseschritts ausgeschlossen. Die Segmentierung von Hellen Feldbildern verläuft etwas anders. Zunächst wird das ursprüngliche helle Feldbild (Abbildung 4C) mit einem Sobel-Kantenfilter verarbeitet. Dieser Filter berechnet den absoluten Wert des Farbverlaufs jedes Pixels innerhalb des Bildes. Pixel in Regionen mit schnellen Änderungen erhalten hohe Werte und Pixel in glatten Bereichen des Bildes erhalten niedrige Werte. Dieses kantengefilterte Bild wird dann mit der Triangle-Methode durch Intensität abgegrenzt, was zu maskierten Kardiomyozyten führt (Abbildung 4D). Diese hochgradig unregelmäßigen Masken werden dann geglättet und durch morphologisches Schließen mit einem Kreis mit einem Radius von 2 Pixeln miteinander verbunden, der alle weißen Bereiche im Bild ausfüllt, in denen der Kreis nicht passen kann, ohne einen schwarzen Bereich zu überlappen (Abbildung 4E). Schließlich werden Löcher in den Masken gefüllt, Bereiche, die den Rahmen berühren, ausgeschlossen und kleine Partikel entfernt, wodurch der Kardiomyozytensegmentierungsprozess abgeschlossen wird (Abbildung 4F).

Mit der skizzierten Segmentierungsstrategie können wir dann den Keimzustand einzelner Kardiomyozyten bestimmen. Mit diesem Ansatz ermittelten wir den Keimzustand von Kardiomyozyten, die aus Herzen von ausgezüchteten CD-1-Mäusen zu frühen postnatalen Zeitpunkten isoliert wurden. Die Herzen von neugeborenen Mäusen (erster Tag des Lebens) zeigten, dass die Mehrheit der Kardiomyozyten zu diesem Zeitpunkt mononukleiert sind(Abbildung 5: neonatal). Diese hohe Häufigkeit mononukleierter Kardiomyozyten ist bei jugendlichen Mäusen (2 Wochen alt) viel geringer, wo mononukleierte Kardiomyozyten etwa 25 % der gesamten Kardiomyozytenpopulation ausmachen(Abbildung 5: juvenile). Schließlich können wir den Ploidy-Status einzelner Kerne in Kardiomyozyten messen und feststellen, ob sie diploid oder tetraploid sind. Diese Ergebnisse zeigen eine höhere Häufigkeit von Tetraploidenkernen bei jugendlichen Mäusen (Abbildung 6).

Abbildung 1: Effizienz der Kardiomyozytenisolation nach Fixierung. (A) Repräsentatives Bild isolierter Kardiomyozyten, die mit DAPI gefärbt sind, um Kerne zu zeigen. (DAPI (blau), Hellfeld (grau)) (B) Ausbeute von Kardiomyozyten, die von verschiedenen Mäusen im Alter von 3 Monaten isoliert wurden. Skalenbalken = 50 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Immunzytochemie isolierter Kardiomyozyten. (A) Repräsentatives Bild von Kardiomyozyten, die für α-Actinin (α-Actinin (rot) und DAPI (blau)) gefärbt sind. (B) Kardiomyozyten für eingebaute EdU (rot) und DAPI (blau). Gezeigt werden repräsentative Kardiomyozyten, die mononukleiert (links), binucleated (Mitte) und trinukleiert (rechts) und EdU positiv sind. Skalenbalken = 50 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Strategie für die nukleare Segmentierung. (A) Original DAPI-Kanalbild. (B) Schwellenbild (in diesem Beispiel wurde die Otsu-Methode verwendet). (C) Masken, die anhand der auf dem ursprünglichen DAPI-Befleckten Bild überlagerten Schwellenwerte identifiziert wurden. (D) Voronoi Tessellation auf der Grundlage von Kernmasken. (E) Endsegmentierte Kerne, mit hervorgehobenen geteilten Clustern. Skalenbalken = 100 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Strategie für die Kardiomyozytensegmentierung. (A) Original fluoreszierendes Troponin I gefärbt Cardiomyozyten Bild. (B) Dreiecksschwellenbild, nach dem Füllen von Löchern und dem Ausschluss kleiner Objekte und der berührenden Rahmen. (C) Original helles Kardiomyozytenbild (D) Kantengefiltertes und dreiecksbeschnittenes Kardiomyozytenbild (E) Kantengefiltertes Bild nach morphologischem Schließen mit einem Radius von zwei Pixeln (F) Gleiches Bild nach dem Füllen von Löchern und dem Ausschluss kleiner Objekte und der erberührenden Rahmen. Skalenbalken = 100 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Klassifizierung von Kardiomyozyten basierend auf der Anzahl der Kerne. Neonatale Herzen (1 Tage alt) enthalten mehr mononukleierte Kardiomyozyten als jugendliche Herzen (14 Tage alt). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 6: Verteilung des Kardiomyozyten-DNA-Gehalts pro Zellkern. Bei Neonaten (links) sind 13,5 % der mononukleierten CM-Kerne tetraploid und 11,9 % der binucleierten CM-Kerne tetraploid. Bei Juvenilen (rechts) sind 33,9% der mononukleierten CM-Kerne tetraploid und 31,2% der binucleatierten CM-Kerne tetraploid. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Datei 1: Software-Screenshots. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei anzuzeigen (Rechtsklick zum Herunterladen).

Ergänzende Datei 2: AnalyzeNucleation.py. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei anzuzeigen (Rechtsklick zum Herunterladen).

Ergänzende Datei 3: AnalyzeMultinucleatedServer.R. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei anzuzeigen (Rechtsklick zum Herunterladen).

Diskussion

Da Kardiomyozyten in der Kultur nicht aufrechterhalten werden können, ist es wichtig, primäre Kardiomyozyten zu isolieren, um ihre Architektur und Funktion studieren zu können¹¹. Daher sind Kardiomyozyten-Isolationstechniken im Herzbereich weit verbreitet. Wenn das Ziel ist, funktionelle Aspekte von Kardiomyozyten zu bestimmen, ist es wichtig, lebensfähige Kardiomyozyten zu isolieren. Diese lebenden Kardiomyozyten können auch verwendet werden, um Immunfärbung auf isolierten Kardiomyozyten durchzuführen. Die Optimierung der Technik der Isolierung von lebenden Kardiomyozyten ist jedoch technisch anspruchsvoll, und selbst die besten Techniken ergeben in der Regel nur 60-65% lebende stabförmige Kardiomyozyten, und die verbleibenden Kardiomyozyten sind alle aufgeballt und sterbenoder oder tot^11,12. Hier haben wir eine Technik entwickelt, die es Forschern ermöglicht, zuerst das Herz zu reparieren und dann Kardiomyozyten effizient zu isolieren. Dieses neue Protokoll ermöglicht wesentlich höhere Erträge von stabförmigen Kardiomyozyten im Vergleich zu zuvor veröffentlichten Protokollen. Darüber hinaus haben wir eine bildgebende Analyseplattform entwickelt, um Kardiomyozyten automatisch basierend auf Keimbildung und Ploidie zu kategorisieren. Mit diesen neuen Methoden können Gruppen Kardiomyozyten für verschiedene Proteine färben und den Kardiomyozytenploidie- und Keimstatus als Ersatz für das regenerative Potenzial des Herzens untersuchen.

Das hier beschriebene Protokoll ist relativ einfach und kann ohne fortschrittliche Ausrüstung ausgeführt werden. Die Menge an Kollagenase und Inkubationszeit für die Verdauung kann je nach Kollagenase-Los und dem Unternehmen, das sie bereitstellt, variieren. Wir verwendeten Kollagenase Typ 2, da dies am häufigsten verwendet wird, um das Herz für die Gewinnung von lebenden Kardiomyozyten zu verdauen. Basierend auf unseren Beobachtungen haben wir festgestellt, dass die nächtliche Inkubation mit 60 mg/ml Kollagenase Typ 2 für fast alle Mausherzen unabhängig vom Fibrose-Niveau optimal ist. Wir hatten noch nie ein Problem der Überverdauung, da intrazelluläre Proteine fixiert sind und nicht so zugänglich sind wie extrazelluläres Kollagen. Wenn das Herz jedoch nicht richtig verdaut wird, kann eine kräftigere Triturierung erforderlich sein, die eine Zellfragmentierung aufgrund von Scherstress verursacht. Daher ist es wichtig, sicherzustellen, dass das Herz richtig verdaut wird, bevor sie zur Trituration übergeht. Die Steifigkeit des Herzens kann durch Drücken mit Zangen getestet werden, um den Grad der Verdauung zu beurteilen. Nach der Inkubation mit Kollagenase sollten Die Herzen weniger steif und leicht auseinander zu reißen sein. Andere Arten von Kollagenase können auch verwendet werden. In einem früheren Bericht wurde eine Kombination der Kollagenasen B und D¹⁴verwendet.

Darüber hinaus glauben wir, dass dieses Protokoll verwendet werden kann, um die Gesamtzahl der Kardiomyozyten im Herzen¹⁵zu bewerten. Wenn das Ziel jedoch darin besteht, alle Kardiomyozyten aus dem Herzen zu erhalten und zu quantifizieren, ist es wichtig, die Herzen für längere Zeit in der Kollagenaselösung zu bebrüten (z. B. 3-7 Tage), wo die Kollagenaselösung einmal täglich aufgefüllt werden sollte. Dadurch werden Inkonsistenzen in der Isolationseffizienz minimiert, da die Auswirkungen des Triturationsgrades auf die Kardiomyozytenausbeute eliminiert werden.

Die Verwendung von DNA-Inhalten zur Messung der Ploidie ist nicht neu und wird seit Jahrzehnten in der Durchflusszytometrie eingesetzt. Kürzlich wurde gezeigt, dass die Mikroskopie ähnlich verwendet werden kann, um den DNA-Gehalt pro Zellkern¹⁶zu schätzen. Hier haben wir diese Strategie umgesetzt, um die Ploidie von Kardiomyozytenkernen als Ersatz für neu gebildete Kardiomyozyten zu messen. Das Dogma auf dem Gebiet der Herzregeneration ist, dass nur mononukleierte, diploide Kardiomyozyten Zytokinese erleiden und neue Kardiomyozyten hervorrufen können. Da es sehr schwierig ist, die neue Kardiomyozytenbildung in vivo zu messen, wurde die Isolierung von Kardiomyozyten, die nach verabreichung eines DNA-Nukleotidanalogs gejagt wurden, und die Bestimmung des Niveaus mononukleierter, diploider Kardiomyozyten als Annäherung an die Fähigkeit des Herzens, neue Kardiomyozyten zu erzeugen,^{verwendet 17}. Hier stellen wir ein Makro für ImageJ zur Verfügung, das eine einfache Quantifizierung der Kardiomyozytenploidie ermöglicht. Mindestens 500 Kerne müssen gemessen werden, um eine genaue Schätzung der Lage des G1-Peaks zu erreichen. Wenn darauf geachtet wird, dass die Färbe- und Bildbedingungen in allen Brunnen der abgebildeten Platte konsistent sind, müssen nur 500 Kerne in der gesamten Probe abgebildet werden, andernfalls müssen 500 Kerne pro Bildgruppe^18,19vorhanden sein. Zu den Einschränkungen der bildgebenden Messung von Keimbildung und Ploidie gehört die Schwierigkeit, Kerne von anhaftenden Zellen von tatsächlichen Kardiomyozytenkernen zu unterscheiden, wenn zweidimensionale Bilder verwendet werden. Solche anhaftenden Zellen können zu einer Überschätzung der Menge an multinukleierten Zellen führen und die Genauigkeit der Messungen der tetraploiden Kardiomyozytenkernpopulation verringern. Eine mögliche Strategie, um dieses Problem zu lösen, wäre die Verwendung der Kardiomyozyten-Kernmarker PCM1^6,20. Wir hatten jedoch Schwierigkeiten, eine zuverlässige PCM1-Färbung an richtig fixierten Zellen oder Geweben zu erhalten.

Eine weitere mögliche Einschränkung ist, dass einige nukleare Fleckenbilder signifikante hintergrundzytoplasmatische Färbung haben könnten, um eine ordnungsgemäße Schwellenbildung mit den eingebauten Methoden der Fidschi-Inseln ohne umfangreiche Vorverarbeitung zu verhindern. Darüber hinaus verringert der unregelmäßige Beitrag dieser Hintergrundfluoreszenz zu ploidienmäßigen Schätzungen ihre Genauigkeit. Darüber hinaus bindet der Fluoreszenzfarbstoff nicht an die Sättigung innerhalb der Kerne, wenn die Zellen nicht ausreichend in der DNA-Färbungslösung verbleiben, und die Annahme einer linearen Beziehung zwischen nuklearintegrierter Intensität und DNA-Gehalt wird nicht mehr genau sein.

Es sollte beachtet werden, dass die Software Cardiomyozyten-Cluster nicht segmentieren kann und sie stattdessen aus der Analyse entfernt. Daher ist es von entscheidender Bedeutung, Kardiomyozyten mit einer relativ geringen Dichte (z. B. 1000 Zellen/cm²⁾auszusäen. Darüber hinaus kann die Software nicht zwischen zwei Cardiomyozyten unterscheiden, die durchundgehend aufgereiht sind, und langen, einzigartigen Kardiomyozyten. Diese Art von Clustern kann fälschlicherweise Multinukleationsschätzungen aufblähen.

Obwohl die beschriebene Methode die Erzielung lebensfähiger Kardiomyozyten nicht zulässt und daher nicht zur Messung dynamischer zellulärer Prozesse verwendet werden kann, wenn das Ziel darin besteht, eine Immunfärbung durchzuführen, glauben wir, dass die beschriebene Methode bestehenden Protokollen mit höheren Erträgen an Kardiomyozyten und einer besseren Qualität in Bezug auf Morphologie und Proteinlokalisierung überlegen ist. Schließlich könnte die beschriebene Methode verwendet werden, um Kardiomyozyten aus klinischen Proben^14,21zu isolieren. Wir glauben, dass die beschriebene Methodik verschiedenen Forschern helfen kann, hochwertige Kardiomyozyten zu erhalten und Keimbildung und Ploidie als Surrogate für neue Kardiomyozytenbildung zu messen.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 wells plate for imaging	Corning	3340	We use these plates as they are suitable for imaging, although glass bottom plates would be better for confocal imaging
Alpha actinin	Novus Biologicals	NBP1-32462	This antibody is used as a marker of cardiomyocyte sarcomeres
Blunt scissors	Fine Scissor Tools	14072-10	We prefer blunt scissors as the possibility of tearing heart tissue is lower when exposing the heart
C57BL/6J	The Jackson Laboratory	664	Used for imaging, assessing ploidy and nucleation in cardiomyocyte population
CD-1 mice	Charles river	22	Used for imaging, assessing ploidy and nucleation in cardiomyocyte population
Collagenase 2	Worthington	LS004177	For the purpose of this protocol, the batch to batch differences are minimal and don't affect overall yield and quality of the isolation
Copper (II) sulfate pentahydrate	Sigma-Aldrich	203165-10G	For edu staining
Cy5 Picolyl Azide	Click Chemistry Tools	1177-25	Azide used for edu staining
Cytation3	BioTek	-	Used for automated imaging for DNA analysis
DAPI	Life Technologies	D3571	DAPI used for DNA staining. Stocks were dissolved in distilled water.
donkey anti-mouse IgG-Alexa568	Life Technologies	A10037	Secondary antibody used to detect alpha actinin staining within cardiomyocytes
Forceps	ROBOZ	RS-5137	We use these curved, blunt forceps, although straight forceps could also be used
Hydrochloric acid	Fisher Scientific	A144212	To set pH of Tris-HCl buffer to pH 8.5
ImageJ	imagej.net/Fiji/Downloads	-	Used for analyzing images
L-ascorbic acid	Sigma-Aldrich	255564-100G	For edu staining
Needle for infusion	TERUMO	SV*23BLK	We use winged infusion sets throughout the protocol as it is easy to manipulate the position of the needle with these sets during injection
Nikon A1R HD25	Nikon	-	Used to take confocal images of alpha actinin staining
Nylon mesh 200 micron	Elko filtering	03-200/54	Mesh used for filtering regular cardiomyocytes (not hypertrophied)
Nylon mesh 400 micron	Elko filtering	06-400/38	Mesh used for filtering hypertrophied adult cardiomyocytes
Phosphate Buffered Saline (1X)	Corning	21-040-CV	This can also be prepared in the lab. Although sterility is important in this experiment, we think it is sufficient to prepare PBS and filtering it
Potassium chloride, Granular	Mallinckrodt	6858	Granular potassium chloride was preffered by us as it forms less aggregates when stored in room temperature
R	r-project.org	-	Used for data analysis of the measurements obtained from images
Tris Base	Fisher Scientific	BP152-5	Used to buffer EdU staining reaction