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  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

El objetivo de esta técnica es la visualización ex vivo de redes arteriales pulmonares de ratones postnatales y adultos tempranos a través de la inflación pulmonar y la inyección de un compuesto radioopaco a base de polímeros a través de la arteria pulmonar. También se discuten las posibles aplicaciones para los tejidos fundidos.

Resumen

Los vasos sanguíneos forman redes intrincadas en el espacio tridimensional. Por lo tanto, es difícil apreciar visualmente cómo interactúan y se comportan las redes vasculares observando la superficie de un tejido. Este método proporciona un medio para visualizar la compleja arquitectura vascular tridimensional del pulmón.

Para lograr esto, se inserta un catéter en la arteria pulmonar y la vasculatura se enjuaga simultáneamente de sangre y se dilata químicamente para limitar la resistencia. Los pulmones se inflan a través de la tráquea a una presión estándar y el compuesto del polímero se infunde en el lecho vascular a un caudal estándar. Una vez que toda la red arterial se llena y se le permite curar, la vasculatura pulmonar puede visualizarse directamente o ser imagen en un escáner de micro-CT .

Cuando se realiza con éxito, se puede apreciar la red arterial pulmonar en ratones que van desde edades posnatales tempranas hasta adultos. Además, mientras se demuestra en el lecho arterial pulmonar, este método se puede aplicar a cualquier lecho vascular con la colocación optimizada del catéter y puntos finales.

Introducción

El enfoque de esta técnica es la visualización de la arquitectura arterial pulmonar utilizando un compuesto a base de polímeros en ratones. Si bien se ha realizado un trabajo extenso en lechos vasculares sistémicos como el cerebro, el corazón y los riñones1,2,3,4,5, se dispone de menos información sobre la preparación y llenado de la red arterial pulmonar. El objetivo de este estudio, por lo tanto, es ampliar el trabajo anterior6,7,8 y proporcionar una referencia detallada escrita y visual que los investigadores pueden seguir fácilmente para producir imágenes de alta resolución del árbol arterial pulmonar.

Si bien existen numerosos métodos para etiquetar y tomar imágenes de vasculatura pulmonar, como la resonancia magnética, la ecocardiografía o la angiografía por TC9,10, muchas de estas modalidades no logran llenar y/o capturar adecuadamente los vasos pequeños, lo que limita el alcance de lo que se puede estudiar. Métodos tales como sección en serie y reconstrucción proporcionan alta resolución, pero son intensivos en tiempo/trabajo11,12,13. La integridad de los tejidos blandos circundantes se ve comprometida en la fundición de corrosión tradicional10,13,14,15,16. Incluso la edad y el tamaño de los animales se convierten en factores al intentar introducir un catéter o, la resolución es deficiente. La técnica de inyección de polímero, por otro lado, llena las arterias al nivel capilar y cuando se combina con el TCT, permite una resolución sin igual5. Las muestras de los pulmones de ratón tan jóvenes como el día 14 postnatal se han echado con éxito8 y se han procesado en cuestión de horas. Estos pueden ser reencaneados indefinidamente, o incluso enviados para preparación histológica / microscopía electrónica (EM) sin comprometer el tejido blando existente17. Las principales limitaciones de este método son el costo inicial de los equipos/software de TC, los desafíos con el monitoreo preciso de la presión intravascular y la incapacidad de adquirir datos longitudinalmente en el mismo animal.

Este documento se basa en el trabajo existente para optimizar aún más la técnica de inyección de la arteria pulmonar y empujar los límites relacionados con la edad/tamaño hasta el día posnatal 1 (P1) para producir resultados sorprendentes. Es más útil para los equipos que quieren estudiar redes vasculares arteriales. En consecuencia, proporcionamos nuevas directrices para la colocación/estabilización del catéter, un mayor control sobre la tasa de llenado/volumen y destacamos los notables escollos para un mayor éxito de fundición. Los moldes resultantes se pueden utilizar para futuras caracterizaciones y análisis morfológicos. Tal vez lo más importante, esta es la primera demostración visual, a nuestro conocimiento, que guía al usuario a través de este intrincado procedimiento.

Protocolo

Todos los métodos descritos aquí han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso animal (ACUC) del Instituto Nacional de Pulmón Cardíaco y Sangre.

1. Preparación

  1. Inyecte el ratón por vía intraperitoneal con heparina (1 unidad/g de peso corporal del ratón) y permita que se ambula durante 2 min.
  2. Eutanasia al animal en una cámara deCO2.
  3. Coloque el ratón en una posición supina en una placa quirúrgica y asegure las cuatro extremidades a la placa con cinta adhesiva. Utilice la ampliación para la disección fina.

2. Exposición de pulmones y tráquea

  1. Rocíe el lado ventral del ratón con 70% de etanol para minimizar la interferencia del cabello.
  2. Agarre la piel abdominal con fórceps y haga una pequeña incisión con tijeras en la región umbilical. Deslice las puntas de las tijeras en la capa fascial entre la musculatura abdominal y la piel y comience a separar las dos capas. Trabaje rostralmente, eliminando la piel del abdomen, la caja torácica y el cuello.
  3. Abra la musculatura abdominal con tijeras y corte lateralmente en ambos lados hasta que el diafragma quede expuesto.
  4. Sujete suavemente el proceso de xifoide y levante ligeramente la caja torácica maximizando la vista de los pulmones caudales a través del diafragma delgado y semitransparente. Haga cuidadosamente una pequeña incisión en el diafragma justo debajo del proceso de xifoide. Los pulmones colapsarán y se alejarán del diafragma. Diseccionar el diafragma lejos de la caja torácica, teniendo cuidado de no cortar el parénquima pulmonar.
  5. Localice y corta la vena cava inferior (IVC) y el esófago por donde pasan a través del diafragma. Use gasas para limpiar cualquier acumulación de sangre en la cavidad torácica, evitando el contacto con los pulmones.
  6. Sujete el xifoide una vez más y levante suavemente. Cortar la caja torácica bilateralmente (aproximadamente en la línea axilar media) evitando el contacto con los pulmones. Retire la caja torácica anterior por completo, haciendo el corte final a lo largo del ángulo esternal justo antes del manubrio.
  7. Usando una jeringa precargada, humedezca liberalmente los pulmones con solución salina tamponada por fosfato (PBS, pH 7.4) para evitar el secado. Continúe con esta rutina durante todo el procedimiento.
  8. Usando fórceps, agarre el manubrio y aléjese suavemente del cuerpo. Usando tijeras, corte 1-2 mm lateralmente al manubrio, cortando las clavículas y retírelas. Esto expondrá el timo debajo.
  9. Agarre cada lóbulo del timo, tire de separarse y retírelo. Repita este procedimiento con la glándula submandibular. Finalmente, retire el tejido muscular superponiendo la tráquea.
    NOTA: Después de la disección, el corazón, la aorta ascendente (AA), el tronco arterial pulmonar (PAT) y la tráquea deben ser visibles. Asegúrese de que las ramas arteriales primarias del tronco no estén divididas ni lesionadas.

3. Cateterismo PA y perfusión de sangre

  1. Para montar la unidad 1, enhebrar 15 cm de tubo PE-10 en el cubo de una aguja de 30 G y fijar a una jeringa de 1 ml precargada con nitroprusido sódico (SNP)de 10 -4 M en PBS. En primer lugar, el tubo avanzando el émbolo hasta que se purgue todo el aire de esta unidad (Figura 1).
    ADVERTENCIA: SNP es tóxico si se ingiere. Evite el contacto con la piel y los ojos. Lávese bien la piel después de manipularla. Use el equipo de protección personal adecuado.
    1. Alternativamente, monte la unidad 2. Para ratones del día 7 (P7) y menores, utilice un hemostat para separar una aguja adicional de 30 G de su cubo e enhebrar la aguja en el extremo abierto del tubo de la Unidad 1 (Figura 1).
  2. En lugar de una aguja, utilice fórceps afilados curvados para agarrar un extremo de una longitud de 10 cm de seda de 7-0. Penetra el ápice del corazón entrando por un lado y pasando las puntas de los fórceps a través del músculo y fuera del otro lado. Sujete la seda con otro conjunto de fórceps y tire de aproximadamente 2 cm de longitud a través y atar. Tome el extremo restante de 8 cm de la sutura, tirando del corazón caudalmente, y pegue el extremo de la placa quirúrgica.
    NOTA: Esto creará tensión, exponiendo aún más los grandes vasos y atando el corazón en su lugar, lo que permite una colocación más fácil del catéter en la arteria pulmonar.
  3. Enganchar las puntas de los fórceps curvos bajo el AA y PAT. Tire de una longitud de 3 cm de seda 7-0 hacia atrás a través de la abertura y cree una sutura suelta de un solo tiro.
  4. Usando tijeras hacer una incisión de 1-2 mm hacia el ápice del corazón, penetrando el ventrículo derecho de paredes delgadas (RV), para permitir la inserción del catéter (Unidad 1). Antes de la inserción, confirme que no hay aire en el sistema. Introducir el tubo cebado en el ventrículo derecho y avanzar suavemente en la SEMItransparente PAT de paredes delgadas.
    1. Verifique visualmente que el catéter no ha avanzado hacia las ramas pulmonares izquierda o derecha y no se encuentra con la rama de la arteria pulmonar. Con cinta adhesiva, fije la parte distal del tubo a la placa quirúrgica.
      NOTA: Para identificar la RV, utilice fórceps para pellizcar el lado derecho del corazón. A diferencia del ventrículo izquierdo, la pared libre relativamente delgada de la RV debe ser fácilmente agarrada.
    2. Para ratones menores que P7, conecte la unidad 2 a un micromanipulador e introduzca el extremo de la aguja de la unidad en la PALMADITA como se ha descrito anteriormente utilizando el manipulador.
  5. Apriete suavemente la sutura suelta alrededor de ambos grandes recipientes y corte la longitud de 8 cm de sutura creada en el paso 3.2 para devolver el corazón a una posición de reposo natural. El catéter ahora está firmemente asegurado dentro de la PAT.
  6. Recorte la aurícula izquierda del corazón para permitir que perfusate salga del sistema.
  7. Asegure la jeringa que contiene SNP (Unidad 1 o Unidad 2, dependiente del tamaño) en la bomba de la jeringa y perfunda la solución a una velocidad de 0,05 ml/min para vaciar la sangre y dilatar al máximo la vasculatura. La sangre/perfuto saldrá a través de la aurícula recortada. Continúe con la perfusión hasta que la perfusión quede clara (200 ml en un ratón adulto, menos para los animales más jóvenes).
    NOTA: Al perfunde la baja viscosidad PBS/SNP, se utilizó una tasa de perfusión relativamente más alta en aras de ahorrar tiempo. El compuesto de polímero más viscoso se infunde a un ritmo más lento para evitar el sobrellenado, la ruptura y maximizar el control sobre los puntos finales distales.

4. Traqueotomía e inflación pulmonar

  1. Construir la unidad de inflado pulmonar (Figura 2).
    1. Conecte un catéter de plástico flexible de 24 G por vía intravenosa (IV) (se extrae la aguja)/un conjunto de perfusión de mariposa a un tapón, unido a una jeringa abierta de 50 ml (sin émbolo). Cuelgue la jeringa de un soporte de anillo.
    2. Añadir 10% de formalina tamponada a la jeringa. Abra la llave, permitiendo que el formol entre en el tubo y purgue todo el aire del sistema. Cierre el llave y levante la jeringa hasta que el menisco esté 20 cm por encima de la tráquea8.
      ADVERTENCIA: Formalin es inflamable, cancerígeno, agudamente tóxico cuando se ingiere, y causa irritación de la piel, daño ocular grave, sensibilización de la piel y mutagenicidad de las células germinales. Evite la ingestión y el contacto con la piel y los ojos. Evite la inhalación del vapor o la niebla. Mantener alejado de fuentes de ignición. Use el equipo de protección personal adecuado.
  2. Coloque dos suturas sueltas inferiores al cartílago cricoide 2-4 mm de separación.
  3. Usando tijeras, haz una pequeña incisión en el ligamento cricotiroido superior a las suturas.
  4. Inserte el catéter IV en la abertura y avance la punta más allá de las dos suturas sueltas.
  5. Apriete las suturas alrededor de la tráquea y abra el llave. Permita que la formalina entre en los pulmones por gravedad y espere 5 minutos para que los pulmones se inflan completamente. Si los pulmones se adhieren a la caja torácica durante la inflación, agarre el exterior de la caja torácica con fórceps con puntas contundentes y muévase en todas las direcciones para ayudar a liberar los lóbulos. No haga contacto directo con los pulmones.
  6. Después de 5 minutos, retroceda el catéter IV más allá de la primera sutura y el ligato. Repita para la segunda sutura. Los pulmones ahora están inflados en un estado cerrado y presurizado.

5. Fundición de la vasculatura

  1. En un tubo de 1,5 ml, prepare 1 ml de unasolución 8:1:1 de polímero:diluir:agente de curado e invierta suavemente varias veces para asegurar una buena mezcla.
  2. Retire el émbolo de una jeringa de 1 cc, cubra el extremo opuesto con un dedo enguantado y vierta el compuesto de polímero en la jeringa. Vuelva a insertar cuidadosamente el émbolo, invierta y avance el émbolo para eliminar todo el aire y formar un menisco en la punta de la jeringa.
  3. Retire la jeringa SNP/PBS del cubo de la aguja y gotee PBS adicional en el cubo para crear un menisco. Revise cuidadosamente el cubo en busca de aire atrapado, desalojar si es necesario, y reformar el menisco. Unir el cubo a la jeringa llena con el compuesto de polímero.
    NOTA: La creación de un menisco en ambos extremos reduce significativamente la posibilidad de que el aire entre en el sistema.
  4. Fije la jeringa llena de compuesto de polímero a la bomba de la jeringa e infunda a 0,02 ml/min.
    NOTA: Para los pulmones más pequeños, una velocidad más lenta puede ser útil para prevenir el sobrellenado, pero no es esencial.
  5. Supervise el compuesto a medida que se mueve libremente por el tubo de PE y observe el volumen de la jeringa al entrar en la PAT. Continúe llenando hasta que todos los lóbulos se llenen completamente hasta el nivel capilar y detenga la bomba de la jeringa. Compruebe de nuevo el volumen de la jeringa.
    NOTA: Después de varias corridas, se puede utilizar un volumen estimado para medir un punto final aproximado (35 oL para un ratón adulto y 5 ml para un cachorro de P1). Después de detener la bomba, la presión residual en el sistema continuará empujando el compuesto del polímero en las arterias pulmonares. Todos los lóbulos pulmonares deben llenarse a una velocidad similar.
  6. Cubra los pulmones con una toallita limpiadora de fibra óptica, aplique liberalmente PBS y deje que la carcasa se siente intacta durante 30-40 minutos a temperatura ambiente. Durante este período, el compuesto de polímero se curará y endurecerá.
  7. Retire el catéter, corta los brazos/la mitad inferior del ratón y coloca la cabeza/tórax en una cónica de 50 ml llena de formalina tamponada al 10% durante la noche.
  8. Después de la fijación, agarre la tráquea y separe suavemente la unidad del corazón/pulmón de la caja torácica y el tórax restantes. Coloque el bloqueo del corazón/pulmón en un vial de centelleo lleno de formol. Desecha el resto.

6. Camas vasculares alternativas para fundición (Tabla 1)

NOTA: Cada lecho vascular objetivo puede requerir diferentes colocaciones de catéter, tasas de perfusión y tiempos de llenado óptimos. Por lo tanto, varios animales serán necesarios para lanzar múltiples órganos.

  1. Para las camas vasculares sistémicas superiores o inferiores al diafragma siga los pasos 1.1-2.5 como se indica arriba. Véanse las notas adicionales sobre el sistema del portal y el diafragma (Tabla 1).
  2. Agarre el proceso de xifoide con un hemostat y corte la caja torácica bilateralmente (aproximadamente en la línea media axilar) justo antes de las arterias torácias internas.
  3. Doblar la caja torácica todavía conectada sobre tal manera que está descansando sobre el cuello / cabeza del animal, exponiendo completamente la cavidad torácica.
  4. Siga el paso 3.1 anterior y, a continuación, retire los pulmones. Una vez que la aorta torácica (TA) es visible, enganchar las puntas de los fórceps curvos debajo de ella, 10 mm superior al diafragma. Agarre una longitud de 3 cm de seda 7-0, tire hacia atrás a través de la abertura debajo del TA y cree una sutura suelta de un solo tiro. Repita este procedimiento 8 mm por encima del diafragma.
  5. Para estructuras superiores al diafragma, utilice tijeras de resorte para crear un pequeño agujero (30% de la circunferencia total) en la porción ventral del TA, inferior a las suturas sueltas colocadas en el paso 6.4.
    1. Para las estructuras inferiores al diafragma, en su lugar, cree un pequeño agujero de 2 mm superior a las suturas sueltas.
  6. Dependiendo del tamaño del animal, introduzca la Unidad 1 o 2 en el recipiente, avance más allá de las suturas sueltas y liga suavemente el recipiente.
  7. Siga el paso 3.7, ajustando la bomba de la jeringa a una velocidad de 1,0 ml/min y perfundiendo un mínimo de 5 ml. Persate saldrá a través del CIV.
  8. Siga los pasos 5.1 - 5.4 ajustando la velocidad de perfusión a 0,05 ml/min, monitoreando visualmente el tejido objetivo en tiempo real.
    NOTA: El volumen de perfusión será específico de la edad de órganos y animales. El volumen puede limitarse aún más mediante la ligadura de ramas arteriales que conducen a lechos vasculares no objetivo (es decir, cerebro, hígado, riñón, intestino).
  9. Siga 5.6 y luego retire el tejido objetivo y colóquelo en formalina.

7. Montaje de muestras, escaneo y reconstrucción para micro-CT

  1. Usando película de parafina, cree una superficie plana en la cama de escaneo y centre la muestra húmeda en esta superficie (Figura 3A).
    NOTA: Si se detecta un artefacto de movimiento, es posible que la muestra requiera una estabilización adicional.
  2. Ligeramente tentar / cubrir la muestra con película de parafina adicional para prevenir la deshidratación. Tenga especial cuidado de no apoyar la película de parafina en la muestra causando deformación en el tejido (Figura 3B).
  3. Escanee el ejemplo utilizando la configuración descrita en la Tabla 2 y estandarice estos parámetros dentro de un experimento determinado.
    NOTA: Esto depende del experimento/punto final. Estandarice los parámetros elegidos para facilitar la comparación entre muestras.
  4. Transfiera los escaneos reconstruidos para el postprocesamiento y el análisis.

Resultados

Un molde exitoso exhibirá un llenado uniforme de toda la red arterial pulmonar. Lo demostramos en ratones C57Bl/6J que varían en edad: día posnatal P90 (Figura 4A), P30 (Figura 4B), P7 (Figura 4C) y P1 (Figura 4D). Mediante el control de la velocidad de flujo y la supervisión visual del relleno en tiempo real, se lograron puntos finales fiables de la vasculatura más...

Discusión

Ejecutado correctamente, este método produce imágenes impactantes de redes arteriales pulmonares, lo que permite la comparación y experimentación en modelos de roedores. Varios pasos críticos en el camino aseguran el éxito. En primer lugar, los investigadores deben heparinizar al animal en la etapa preparatoria para evitar que se formen coágulos de sangre en la vasculatura pulmonar y las cámaras del corazón. Esto permite el tránsito arterial completo del compuesto de polímero. En segundo lugar, al perforar el ...

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar

Agradecimientos

Esta investigación fue apoyada en parte por el Programa de Investigación Intramuros NHLBI (DIR HL-006247). Nos gustaría dar las gracias a NIH Mouse Imaging Facility por orientación en la adquisición y análisis de imágenes.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
1cc syringeBecton Dickinson309659
20ml Glass Scintillation VialsFisher03-340-25P
30G NeedleBecton Dickinson305106
50mL conical tubesCornin352098For sample Storage and scanning
60cc syringeBecton Dickinson309653
7-0 silk sutureTeleflex103-S
Analyze 12.0 SoftwareAnalyzeDirect Inc.N/APrimary Software
Amira 6.7 SoftwareThermo ScientificN/AAlternative Sofware
CeramaCut Scissors 9cmFine Science tools14958-09
Ceramic Coated Curved ForcepsFine Science tools11272-50
CO2 TankRobert's Oxygen Co.n/a
Dual syringe pumpCole ParmerEW-74900-10
Dumont Mini-ForcepsFine Science tools11200-14
EthanolPharmco111000200
FormalinSigma - Life SciencesHT501128
GauzeCovidien441215
HemostatFine Science tools13013-14
Heparin (1000USP Units/ml)HospiraNDC 0409-2720-01
Horos SoftwareHoros ProjectN/AAlternative Sofware
induction chambern/an/a
KimwipeFisher06-666fiber optic cleaning wipe
Labelling TapeFisher15966
Magnetic BaseKanetecN/A
Micro-CT systemPerkinElmerQuantum GX
Microfil (Polymer Compound)Flowech Inc.Kit B - MV-1228 oz. of MV compound; 8 oz. of diluent; MV-Curing Agent
MicromanipulatorStoelting56131
Monoject 1/2 ml Insulin SyringeCovidien1188528012
Octagon Forceps Straight TeethFine Science tools11042-08
ParafilmBemis company, Inc.#PM999
PE-10 tubingInstechBTPE-10
Phospahte buffered SalineBioRad#161-0780
Ring StandFisherS13747Height 24in.
Sodium Nitroprussidesigma71778-25G
Steel PlateN/AN/A16 x 16 in. area, 1/16 in thick
Straight Spring ScissorsFine Science tools15000-08
SURFLO 24G Teflon I.V. CatheterSanta Cruz Biotechnology360103
Surgical BoardFisher12-587-20This is a converted slide holder
Universal 3-prong clampFisherS24280
Winged Inf. Set 25X3/4, 12" TubingNiproPR25G19
Zeiss Stemi-508 Dissection ScopeZeissn/a

Referencias

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