Moulage vasculaire des poumons de souris postnatales adultes et précoces pour l’imagerie micro-CT

Résumé

Le but de cette technique est la visualisation ex vivo des réseaux artériels pulmonaires des souris postnatales et adultes précoces par l’inflation pulmonaire et l’injection d’un composé à base de polymère radio-opaque par l’intermédiaire de l’artère pulmonaire. Les applications potentielles pour les tissus moulés sont également discutées.

Résumé

Les vaisseaux sanguins forment des réseaux complexes dans l’espace tridimensionnel. Par conséquent, il est difficile d’apprécier visuellement comment les réseaux vasculaires interagissent et se comportent en observant la surface d’un tissu. Cette méthode fournit un moyen de visualiser l’architecture vasculaire tridimensionnelle complexe du poumon.

Pour ce faire, un cathéter est inséré dans l’artère pulmonaire et la vascularisation est simultanément rincée de sang et chimiquement dilatée pour limiter la résistance. Les poumons sont ensuite gonflés par la trachée à une pression standard et le composé polymère est infusé dans le lit vasculaire à un débit standard. Une fois que l’ensemble du réseau artériel est rempli et autorisé à guérir, la vascularisation pulmonaire peut être visualisée directement ou image sur un scanner micro-CT (μCT).

Lorsqu’on les effectue avec succès, on peut apprécier le réseau artériel pulmonaire chez des souris allant de l’âge postnatal précoce aux adultes. En outre, bien que démontré dans le lit artériel pulmonaire, cette méthode peut être appliquée à n’importe quel lit vasculaire avec le placement optimisé de cathéter et les extrémités.

Introduction

L’objectif de cette technique est la visualisation de l’architecture artérielle pulmonaire à l’aide d’un composé à base de polymère chez la souris. Tandis que des travaux étendus ont été exécutés sur les lits vasculaires systémiques tels que le cerveau, le coeur, et le rein^1,2,3,4,,5, moins d’information est disponible concernant la préparation et le remplissage du réseau artériel pulmonaire. Le but de cette étude, par conséquent, est d’élargir les travaux précédents^6,7,8 et de fournir une référence écrite et visuelle détaillée que les chercheurs peuvent facilement suivre pour produire des images à haute résolution de l’arbre artériel pulmonaire.

Bien qu’il existe de nombreuses méthodes d’étiquetage et d’imagerie de la vascularisation pulmonaire, telles que l’imagerie par résonance magnétique, l’échocardiographie ou l’angiographie^{ct 9,,10,}bon nombre de ces modalités ne remplissent pas adéquatement et/ou capturent les petits vaisseaux, limitant ainsi la portée de ce qui peut être étudié. Les méthodes telles que le sectionnage en série et la reconstruction fournissent une haute résolution, mais sont temps / travail intensif^11,12,13. L’intégrité des tissus mous environnants est compromise dans le moulage traditionnel de corrosion^{10,13,14,15,16}. Même l’âge et la taille de l’animal deviennent des facteurs lors de la tentative d’introduire un cathéter ou, la résolution fait défaut. La technique d’injection de polymère, d’autre part, remplit les artères au niveau capillaire et lorsqu’elle est combinée avec μCT, permet une résolution inégalée⁵. Des échantillons de poumons de souris aussi jeunes que le jour postnatal 14 ont été lancés avec succès⁸ et traités en quelques heures. Ceux-ci peuvent être rescanned indéfiniment, ou même envoyé pour la préparation histologique / microscopie électronique (EM) sans compromettre le tissu mou existant¹⁷. Les principales limites à cette méthode sont le coût initial de l’équipement/logiciel de CT, les défis avec la surveillance précise de la pression intravasculaire, et l’incapacité d’acquérir des données longitudinalement dans le même animal.

Cet article s’appuie sur les travaux existants pour optimiser davantage la technique d’injection d’artère pulmonaire et repousser les limites liées à l’âge/taille jusqu’au jour postnatal 1 (P1) pour produire des résultats frappants. Il est plus utile pour les équipes qui veulent étudier les réseaux vasculaires artériels. Par conséquent, nous fournissons de nouvelles directives pour le placement/stabilisation de cathéter, le contrôle accru sur le taux/volume de remplissage, et mettons en évidence les pièges notables pour le succès accru de coulée. Les moulages qui en résultent peuvent ensuite être utilisés pour la caractérisation future et l’analyse morphologique. Peut-être plus important encore, c’est la première démonstration visuelle, à notre connaissance, qui guide l’utilisateur à travers cette procédure complexe.

Protocole

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (ACUC) de l’Institut national des poumons et du sang cardiaques.

1. Préparation

1. Injectez la souris intraperitoneally avec de l’héparine (1 unité/g de poids corporel de la souris) et laissez-la s’ambriculer pendant 2 min.
2. Euthanasier l’animal dans une chambre CO_2.
3. Disposer la souris en position supination sur une planche chirurgicale et fixer les quatre membres à la planche avec du ruban adhésif. Utilisez le grossissement pour la dissection fine.

2. Exposer les poumons et la trachée

1. Vaporiser le côté ventral de la souris avec 70% d’éthanol pour minimiser les interférences capillaires.
2. Saisissez la peau abdominale avec des forceps et faites une petite incision avec des ciseaux dans la région ombilicale. Faites glisser les pointes des ciseaux dans la couche fasciale entre la musculature abdominale et la peau et commencer à séparer les deux couches. Travailler rostrally, enlever la peau de l’abdomen, la cage thoracique, et le cou.
3. Ouvrir la musculature abdominale avec des ciseaux et couper ultérieurement des deux côtés jusqu’à ce que le diaphragme soit exposé.
4. Saisissez doucement le processus xiphoide et soulevez légèrement la cage thoracique en maximisant la vue des poumons caudal à travers le diaphragme mince et semi-transparent. Faites soigneusement une petite incision dans le diaphragme juste en dessous du processus xiphoide. Les poumons s’effondrent et se rétractent du diaphragme. Disséquer le diaphragme loin de la cage thoracique, en prenant soin de ne pas entailler le parenchyme pulmonaire.
5. Localiser et couper le vena cava inférieur (IVC) et l’œsophage où ils passent à travers le diaphragme. Utilisez de la gaze pour nettoyer tout sang de mise en commun dans la cavité thoracique, en évitant le contact avec les poumons.
6. Saisissez le xiphoide une fois de plus et soulevez doucement. Couper la cage thoracique bilatéralement (à peu près à la ligne midaxillaire) en évitant le contact avec les poumons. Retirer complètement la cage thoracique antérieure, en faisant la coupe finale le long de l’angle sternal juste avant le manubrium.
7. À l’aide d’une seringue préremplie, mouiller généreusement les poumons à l’aide d’une solution saline tamponnée par le phosphate (PBS, pH 7.4) pour éviter le dessèchement. Continuez cette routine tout au long de la procédure.
8. À l’aide de forceps, saisissez le manubrium et soulevez doucement loin du corps. À l’aide de ciseaux, couper 1-2 mm latéralement au manubrium, couper les clavicules et enlever. Cela exposera le thymus en dessous.
9. Saisissez chaque lobe du thymus, séparez-les et retirez-les. Répétez cette procédure avec la glande submandibulaire. Enfin, enlever le tissu musculaire superposant la trachée.
   REMARQUE : Après la dissection, le coeur, l’aorte ascendante (AA), le tronc artériel pulmonaire (PAT), et la trachée devraient être visibles. Assurez-vous que les branches artérielles primaires du tronc ne sont pas divisées ou blessées.

3. Cathétérisme pa et perfusion sanguine

1. Pour assembler l’unité 1, enfiler 15 cm de tubes PE-10 sur le moyeu d’une aiguille de 30 G et attacher à une seringue de 1 mL préremplie de 10^{à 4} M de nitroprusside de sodium (SNP) en PBS. Amorcer le tube en avançant le piston jusqu’à ce que tout l’air soit purgé de cette unité ( figure 1).
   ATTENTION: SNP est toxique s’il est avalé. Évitez tout contact avec la peau et les yeux. Laver soigneusement la peau après manipulation. Portez l’équipement de protection individuelle approprié.
   1. Alternativement, assemblez l’unité 2. Pour les souris postnatales 7 (P7) et plus jeunes, utilisez un hémostat pour détacher une aiguille supplémentaire de 30 G de son moyeu et enfiler l’aiguille sur l’extrémité ouverte du tube de l’unité 1 (figure 1).
2. Au lieu d’une aiguille, utilisez des forceps tranchants incurvés pour saisir une extrémité d’une longueur de 10 cm de soie de 7-0. Pénétrer l’apex du cœur entrant d’un côté et en passant les extrémités des forceps à travers le muscle et de l’autre côté. Saisissez la soie avec un autre ensemble de forceps et tirez environ 2 cm de longueur à travers et attachez-vous. Prenez l’extrémité restante de 8 cm de la suture, tirant le cœur caudalement, et bande la fin de la planche chirurgicale.
   REMARQUE : Cela créera de la tension, exposant davantage les grands vaisseaux et attachant le cœur en place, permettant un placement plus facile du cathéter dans l’artère pulmonaire.
3. Accrochez les extrémités des forceps incurvées sous les AA et PAT. Tirez une longueur de 3 cm de soie de 7-0 en arrière à travers l’ouverture et de créer une suture lâche d’un seul lancer.
4. À l’aide de ciseaux, faire une incision de 1 à 2 mm vers l’apex du cœur, en pénétrant le ventricule droit à parois minces (RV), pour permettre l’insertion du cathéter (unité 1). Avant l’insertion, confirmez qu’il n’y a pas d’air dans le système. Introduisez le tube amorçage dans le ventricule droit et avancez doucement dans le PAT semi-transparent à parois minces.
   1. Vérifiez visuellement que le cathéter n’a pas avancé dans les branches pulmonaires gauches ou droites et n’empêche pas le point de branchement de l’artère pulmonaire. À l’aide de ruban adhésif, fixer la partie distale du tube à la planche chirurgicale.
      REMARQUE : Pour identifier le VR, utilisez des forceps pour pincer le côté droit du cœur. Contrairement au ventricule gauche, la paroi libre relativement mince du RV doit être facilement saisie.
   2. Pour les souris plus jeunes que P7, attachez l’unité 2 à un micromanipulateur et introduisez l’extrémité de l’aiguille de l’unité dans le PAT tel que décrit ci-dessus à l’aide du manipulateur.
5. Serrez doucement la suture lâche autour des deux grands vaisseaux et coupez la longueur de 8 cm de suture créée à l’étape 3.2 pour ramener le cœur à une position de repos naturelle. Le cathéter est maintenant solidement fixé dans le PAT.
6. Clip l’auricule gauche du cœur pour permettre perfusate de sortir du système.
7. Sécurisez la seringue contenant du SNP (unité 1 ou unité 2, de taille dépendante) dans la pompe à seringues et perfusez la solution à une vitesse de 0,05 mL/min pour rincer le sang et dilater au maximum la vascularisation. Le sang/perfusate sortira par l’auricule coupé. Continuer la perfusion jusqu’à ce que le perfusate s’éclaircit (~200 μL chez une souris adulte, moins pour les animaux plus jeunes).
   REMARQUE : Lorsqu’on persussait la faible viscosité PBS/SNP, un taux d’infusion relativement plus élevé a été utilisé dans l’intérêt de gagner du temps. Le composé polymère plus visqueux est infusé à un rythme plus lent pour empêcher le remplissage excessif, la rupture et de maximiser le contrôle sur les points de terminaison distal.

4. Trachéostomie et inflation pulmonaire

1. Construire l’unité d’inflation pulmonaire (figure 2).
   1. Connectez un cathéter intraveineux flexible de 24 G (IV) en plastique (aiguille enlevée)/infusion de papillon réglé sur un robinet d’arrêt, fixé à une seringue ouverte de 50 mL (pas de piston). Accrochez la seringue à un support d’anneau.
   2. Ajouter 10 % de formaline tamponnée à la seringue. Ouvrez le robinet d’arrêt, permettant à la formaline d’entrer dans le tube et de purger tout l’air du système. Fermez le robinet d’arrêt et soulevez la seringue jusqu’à ce que le ménisque soit de 20 cm au-dessus de la trachée⁸.
      ATTENTION : La formaline est inflammable, cancérigène, extrêmement toxique lorsqu’elle est ingérée, et provoque une irritation de la peau, de graves lésions oculaires, une sensibilisation de la peau et une mutagénicité des cellules germinales. Évitez l’ingestion et le contact avec la peau et les yeux. Évitez l’inhalation de la vapeur ou de la brume. Éloignez-vous des sources d’inflammation. Portez l’équipement de protection individuelle approprié.
2. Placer deux sutures lâches inférieures au cartilage cricoide de 2 à 4 mm l’une de l’autre.
3. À l’aide de ciseaux, faire une petite incision dans le ligament de la cricothyroïdie supérieur aux sutures.
4. Insérez le cathéter IV dans l’ouverture et avancez la pointe au-delà des deux sutures lâches.
5. Serrer les sutures autour de la trachée et ouvrir le robinet. Laissez la formaline pénétrer dans les poumons par gravité et attendez 5 min que les poumons se gonflent complètement. Si les poumons adhèrent à la cage thoracique pendant l’inflation, saisissez l’extérieur de la cage thoracique avec des forceps à pointe émoussée et déplacez-vous dans toutes les directions pour aider à libérer les lobes. Ne pas entrer en contact direct avec les poumons.
6. Après 5 min, reculez le cathéter IV au-delà de la première suture et de la l torture. Répétez la deuxième suture. Les poumons sont maintenant gonflés dans un état fermé et sous pression.

5. Coulée de la vasculature

1. Dans un tube de 1,5 mL, préparer 1 ml d’une solution 8:1:1^de polymère:diluent:agent de traitement et inverser doucement plusieurs fois pour assurer un bon mélange.
2. Retirer le piston d’une seringue de 1 cc, couvrir l’extrémité opposée d’un doigt ganté et verser le composé polymère dans la seringue. Réinsérer soigneusement le piston, inverser et faire avancer le piston pour enlever tout l’air et former un ménisque à l’extrémité de la seringue.
3. Retirez la seringue SNP/PBS du moyeu de l’aiguille et égouttez des PBS supplémentaires dans le moyeu pour créer un ménisque. Vérifiez soigneusement le moyeu pour l’air emprisonné, déloger si nécessaire, et réformer le ménisque. Joignez le moyeu à la seringue remplie du composé polymère.
   REMARQUE : La création d’un ménisque aux deux extrémités réduit considérablement les chances d’entrée de l’air dans le système.
4. Attachez la seringue remplie de composés polymères à la pompe à seringues et infuser à 0,02 mL/min.
   REMARQUE : Pour les poumons plus petits, un taux plus lent peut être utile pour prévenir le suremplissage, mais n’est pas essentiel.
5. Surveiller le composé pendant qu’il se déplace librement vers le bas du tube pe et noter le volume de la seringue comme il entre dans le PAT. Continuer à remplir jusqu’à ce que tous les lobes sont remplis complètement jusqu’au niveau capillaire et arrêter la pompe à seringues. Vérifiez à nouveau le volume de la seringue.
   REMARQUE : Après plusieurs courses, un volume estimé peut être utilisé pour évaluer un point d’évaluation approximatif (~35 μL pour une souris adulte et ~5 μL pour un chiot P1). Une fois la pompe arrêtée, la pression résiduelle du système continuera à pousser le composé polymère dans les artères pulmonaires. Tous les lobes pulmonaires doivent se remplir à un rythme similaire.
6. Couvrir les poumons d’un linge de nettoyage à fibre optique, appliquer généreusement pbs et laisser la carcasse s’asseoir sans être dérangée pendant 30 à 40 min à température ambiante. Pendant cette période, le composé polymère guérira et durcira.
7. Retirez le cathéter, coupez les bras/moitié inférieure de la souris, et placez la tête/thorax dans un conique de 50 mL rempli de formaline tamponnée de 10% pendant la nuit.
8. Après fixation, saisissez la trachée et séparez doucement l’unité cardiaque/poumon de la cage thoracique et du thorax restants. Placez le bloc coeur/poumon dans un flacon de scintillation rempli de formaline. Jetez le reste.

6. Lits vasculaires alternatifs pour la coulée (tableau 1)

REMARQUE : Chaque lit vasculaire cible peut nécessiter des placements différents de cathéter, des taux de perfusion et des temps de remplissage optimaux. Ainsi, plusieurs animaux seront nécessaires pour lancer plusieurs organes.

1. Pour les lits vasculaires systémiques supérieurs ou inférieurs au diaphragme suivre les étapes 1.1-2.5 comme ci-dessus. Voir des notes supplémentaires sur le système de portail et le diaphragme (Tableau 1).
2. Saisissez le processus xiphoide avec un hémostat et coupez la cage thoracique bilatéralement (approximativement dans la ligne midaxillaire) juste avant les artères thoraciques internes.
3. Pliez la cage thoracique encore reliée au-dessus de telle sorte qu’elle repose sur le cou/tête de l’animal, exposant entièrement la cavité thoracique.
4. Suivez l’étape 3.1 ci-dessus, puis retirez les poumons. Une fois que l’aorte thoracique (TA) est visible, accrochez les extrémités des forceps courbes en dessous, ~10 mm supérieures au diaphragme. Saisissez une longueur de 3 cm de soie de 7-0, tirez à travers l’ouverture sous le TA, et créez une suture lâche d’un seul jet. Répétez cette procédure ~8 mm au-dessus du diaphragme.
5. Pour les structures supérieures au diaphragme, utilisez des ciseaux à ressort pour créer un petit trou (~30% de la circonférence totale) sur la partie ventrale du TA, ~2 mm inférieur aux sutures lâches placées à l’étape 6.4.
   1. Pour les structures inférieures au diaphragme, créez plutôt un petit trou ~2 mm supérieur aux sutures lâches.
6. Selon la taille de l’animal, introduire l’unité 1 ou 2 dans le navire, avancer au-delà des sutures lâches et ligote doucement le navire.
7. Suivez l’étape 3.7, en fixant la pompe à seringues à une vitesse de 1,0 mL/min et en perfusant un minimum de 5 mL. Perfusate sortira par l’IVC.
8. Suivez les étapes 5.1 - 5.4 en ajustant le taux de perfusion à 0,05 mL/min, en surveillant visuellement le tissu cible en temps réel.
   REMARQUE : Le volume d’infusion sera spécifique à l’organe et à l’âge animal. Le volume peut être encore limité par ligature des branches artérielles menant à des lits vasculaires non ciblés (c.-à-d. cerveau, foie, rein, intestin).
9. Suivez 5.6 puis retirez le tissu cible et placez-le dans la formaline.

7. Montage, balayage et reconstruction d’échantillons pour micro-CT

1. À l’aide d’un film de paraffine, créez une surface plane sur le lit de balayage et centrez l’échantillon humide sur cette surface (Figure 3A).
   REMARQUE : Si l’artefact de mouvement est détecté, l’échantillon peut nécessiter une stabilisation supplémentaire.
2. Échantillon légèrement tente/couverture avec pellicule de paraffine supplémentaire pour prévenir la déshydratation. Prenez un soin particulier de ne pas reposer le film de paraffine sur l’échantillon causant la déformation du tissu (Figure 3B).
3. Numérisez l’exemple à l’aide des paramètres décrits dans le tableau 2 et standardisez ces paramètres au sein d’une expérience donnée.
   REMARQUE : Il s’agit d’une expérience ou d’un point de terminaison dépendant. Standardisez les paramètres choisis pour faciliter la comparaison entre les échantillons.
4. Transférez les scans reconstruits pour le post-traitement et l’analyse.

Résultats

Un casting réussi présentera un remplissage uniforme de l’ensemble du réseau artériel pulmonaire. Nous le démontrons chez les souris C57Bl/6J dont l’âge est le cas : jour postnatal P90 (figure 4A),P30 (figure 4B), P7 (figure 4C)et P1 (figure 4D). En contrôlant le débit et en surveillant visuellement le remplissage en temps réel, des critères d’évaluation...

Discussion

Exécutée correctement, cette méthode donne des images saisissantes des réseaux artériels pulmonaires, permettant la comparaison et l’expérimentation dans les modèles de rongeurs. Plusieurs étapes critiques en cours de route assurent le succès. Tout d’abord, les chercheurs doivent hépariniser l’animal dans l’étape préparatoire pour empêcher les caillots sanguins de se former dans la vascularisation pulmonaire et les chambres du cœur. Cela permet le transit artériel complet du composé polymère. Deu...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1cc syringe	Becton Dickinson	309659
20ml Glass Scintillation Vials	Fisher	03-340-25P
30G Needle	Becton Dickinson	305106
50mL conical tubes	Cornin	352098	For sample Storage and scanning
60cc syringe	Becton Dickinson	309653
7-0 silk suture	Teleflex	103-S
Analyze 12.0 Software	AnalyzeDirect Inc.	N/A	Primary Software
Amira 6.7 Software	Thermo Scientific	N/A	Alternative Sofware
CeramaCut Scissors 9cm	Fine Science tools	14958-09
Ceramic Coated Curved Forceps	Fine Science tools	11272-50
CO2 Tank	Robert's Oxygen Co.	n/a
Dual syringe pump	Cole Parmer	EW-74900-10
Dumont Mini-Forceps	Fine Science tools	11200-14
Ethanol	Pharmco	111000200
Formalin	Sigma - Life Sciences	HT501128
Gauze	Covidien	441215
Hemostat	Fine Science tools	13013-14
Heparin (1000USP Units/ml)	Hospira	NDC 0409-2720-01
Horos Software	Horos Project	N/A	Alternative Sofware
induction chamber	n/a	n/a
Kimwipe	Fisher	06-666	fiber optic cleaning wipe
Labelling Tape	Fisher	15966
Magnetic Base	Kanetec	N/A
Micro-CT system	SkyScan	1172
Microfil (Polymer Compound)	Flowech Inc.	Kit B - MV-122	8 oz. of MV compound; 8 oz. of diluent; MV-Curing Agent
Micromanipulator	Stoelting	56131
Monoject 1/2 ml Insulin Syringe	Covidien	1188528012
Octagon Forceps Straight Teeth	Fine Science tools	11042-08
Parafilm	Bemis company, Inc.	#PM999
PE-10 tubing	Instech	BTPE-10
Phospahte buffered Saline	BioRad	#161-0780
Ring Stand	Fisher	S13747	Height 24in.
Sodium Nitroprusside	sigma	71778-25G
Steel Plate	N/A	N/A	16 x 16 in. area, 1/16 in thick
Straight Spring Scissors	Fine Science tools	15000-08
SURFLO 24G Teflon I.V. Catheter	Santa Cruz Biotechnology	360103
Surgical Board	Fisher	12-587-20	This is a converted slide holder
Universal 3-prong clamp	Fisher	S24280
Winged Inf. Set 25X3/4, 12" Tubing	Nipro	PR25G19
Zeiss Stemi-508 Dissection Scope	Zeiss	n/a