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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Lo scopo di questa tecnica è la visualizzazione ex vivo delle reti arteriliiche polmonari dei primi topi postnatali e adulti attraverso l'inflazione polmonare e l'iniezione di un composto a base di polimeri radio-opaco attraverso l'arteria polmonare. Vengono inoltre discusse le potenziali applicazioni per i tessuti castati.

Abstract

I vasi sanguigni formano reti intricate nello spazio tridimensionale. Di conseguenza, è difficile apprezzare visivamente il modo in cui le reti vascolari interagiscono e si comportano osservando la superficie di un tessuto. Questo metodo fornisce un mezzo per visualizzare la complessa architettura vascolare tridimensionale del polmone.

Per raggiungere questo obiettivo, un catetere viene inserito nell'arteria polmonare e la vascolatura viene simultaneamente lavata di sangue e dilatata chimica per limitare la resistenza. I polmoni vengono poi gonfiati attraverso la trachea a una pressione standard e il composto polimerico viene infuso nel letto vascolare ad una velocità di flusso standard. Una volta che l'intera rete arteriosa è stata riempita e autorizzata a curare, la vascolatura polmonare può essere visualizzata direttamente o su uno scanner micro-CT.

Quando eseguito con successo, si può apprezzare la rete arteriosa polmonare nei topi che vanno dalle prime età postnatali agli adulti. Inoltre, mentre dimostrato nel letto arteriosa polmonare, questo metodo può essere applicato a qualsiasi letto vascolare con posizionamento del catetere ottimizzato e punti finali.

Introduzione

Il focus di questa tecnica è la visualizzazione dell'architettura arteriosa polmonare utilizzando un composto a base di polimeri nei topi. Mentre è stato eseguito un ampio lavoro su letti vascolari sistemici come cervello, cuore e rene1,2,3,4,5, sono disponibili meno informazioni per quanto riguarda la preparazione e il riempimento della rete arteriosa polmonare. Lo scopo di questo studio, quindi, è quello di ampliare il lavoroprecedente 6,7,8 e fornire un riferimento scritto e visivo dettagliato che i ricercatori possono facilmente seguire per produrre immagini ad alta risoluzione dell'albero arteriosa polmonare.

Mentre esistono numerosi metodi per l'etichettatura e l'imaging della vascolatura polmonare, come la risonanza magnetica, l'ecocardiografia o l'angiografiaTC 9,10, molte di queste modalità non riescono a riempire adeguatamente e/o catturare i piccoli vasi, limitando la portata di ciò che può essere studiato. Metodi come la sezionazione seriale e la ricostruzione forniscono alta risoluzione, ma sono tempo/lavoro ad altaintensità di tempo 11,12,13. L'integrità dei tessuti molli circostante è compromessa nella colata di corrosionetradizionale 10,,13,14,15,16. Anche l'età e le dimensioni degli animali diventano fattori quando si tenta di introdurre un catetere o, la risoluzione è carente. La tecnica di iniezione polimerica, d'altra parte, riempie le arterie al livello capillare e, se combinata con la CT, consente una risoluzione senza precedenti5. I campioni dei polmoni di topo giovani come il giorno postnatale 14 sono stati lanciaticon successo 8 ed elaborati in poche ore. Questi possono essere riscanci a tempo indeterminato, o addirittura inviati per preparazione irologica/ microscopia elettronica (EM) senza compromettere il tessuto molleesistente 17. Le principali limitazioni di questo metodo sono il costo iniziale delle apparecchiature/software CT, le sfide con il monitoraggio accurato della pressione intravascolare e l'incapacità di acquisire dati longitudinalmente nello stesso animale.

Questo documento si basa sul lavoro esistente per ottimizzare ulteriormente la tecnica di iniezione dell'arteria polmonare e spingere i confini relativi all'età/dimensione fino al giorno postnatale 1 (P1) per produrre risultati sorprendenti. È più utile per i team che vogliono studiare le reti vascolari arteriose. Di conseguenza, forniamo nuove linee guida per il posizionamento/stabilizzazione del catetere, un maggiore controllo sulla frequenza/volume di riempimento ed evidenziamo notevoli insidie per un maggiore successo di colata. I cast risultanti possono quindi essere utilizzati per la caratterizzazione futura e l'analisi morfologica. Forse ancora più importante, questa è la prima dimostrazione visiva, a nostra conoscenza, che guida l'utente attraverso questa procedura complessa.

Protocollo

Tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (ACUC) del National Heart Lung and Blood Institute.

1. Preparazione

  1. Iniettare il topo intraperitonealmente con epatina (1 unità/g peso corporeo del topo) e lasciare che ambulate per 2 min.
  2. Eutanasia l'animale in una camera di CO2.
  3. Disporre il mouse in posizione supina su una tavola chirurgica e fissare tutti e quattro gli arti alla scheda con del nastro adesivo. Utilizzare l'ingrandimento per la dissezione fine.

2. Esposizione di polmoni e trachea

  1. Spruzzare il lato ventrale del mouse con il 70% di etanolo per ridurre al minimo le interferenze dei capelli.
  2. Afferrare la pelle addominale con le forche e fare una piccola incisione con forbici nella regione ombelicale. Far scorrere le punte delle forbici nello strato fasciale tra la muscolatura addominale e la pelle e iniziare a separare i due strati. Lavorare in modo rostrale, rimuovendo la pelle dall'addome, dalla gabbia toracica e dal collo.
  3. Aprire la muscolatura addominale con le forbici e tagliare lateralmente su entrambi i lati fino a quando il diaframma è esposto.
  4. Afferrare delicatamente il processo xifoide e sollevare leggermente la gabbia toracica massimizzando la vista dei polmoni caudali attraverso il sottile diaframma semitrasparente. Fare con attenzione una piccola incisione nel diaframma appena sotto il processo xifoide. I polmoni collasseranno e si ritrarranno dal diaframma. Disiezionare il diaframma lontano dalla gabbia toracica, facendo attenzione a non nick il parenchyma polmonare.
  5. Individuare e recidere la vena cava inferiore (IVC) e l'esofago dove passano attraverso il diaframma. Utilizzare la garza per pulire il sangue di pooling nella cavità toracica, evitando il contatto con i polmoni.
  6. Afferra lo xifoide ancora una volta e solleva delicatamente. Tagliare bilateralmente la gabbia toracica (approssimativamente sulla linea midaxillary) evitando il contatto con i polmoni. Rimuovere completamente la gabbia toracica anteriore, effettuando il taglio finale lungo l'angolo sternale appena prima del manubrium.
  7. Utilizzando una siringa precompilata, bagnare liberamente i polmoni con salina tamponata di fosfati (PBS, pH 7.4) per evitare l'essiccazione. Continuare questa routine per tutta la procedura.
  8. Utilizzando le forcepi, afferrare il manubrium e elevarsi delicatamente dal corpo. Utilizzando le forbici, tagliare 1-2 mm lateralmente al manubrium, recidendo le clavicide e rimuovere. Questo esporrà il timo sotto.
  9. Afferra ogni lobo del timo, allontanati e rimuovi. Ripetere questa procedura con la ghiandola submandibolare. Infine, rimuovere il tessuto muscolare sovrapposto alla trachea.
    NOTA: Dopo la dissezione, il cuore, l'aorta ascendente (AA), il tronco arteriosa polmonare (PAT) e la trachea devono essere visibili. Assicurarsi che i rami arteriostri primari del tronco non siano divisi o feriti.

3. Cateterizzazione PA e perfusione di sangue

  1. Per assemblare l'unità 1, infilare 15 cm di PE-10 tubo sul mozzo di un ago da 30 G e attaccarlo a una siringa da 1 mL precompilata con 10-4 M di sodio nitroprusside (SNP) in PBS. Far srotolare il tubo avanzando lo stantuffo fino a quando tutta l'aria viene epurata da questa unità ( Figura 1).
    CAUTION: SNP è tossico se ingerito. Evitare il contatto con la pelle e gli occhi. Lavare accuratamente la pelle dopo la manipolazione. Indossare attrezzature di protezione personale adeguate.
    1. In alternativa, assemblate l'Unità 2. Per i topi postnatali giorno 7 (P7) e più giovani, utilizzare un emostatico per staccare un ago aggiuntivo 30 G dal suo hub e infilare l'ago all'estremità aperta del tubo dell'unità 1 (Figura 1).
  2. Invece di un ago, utilizzare le force curve affilate per afferrare un'estremità di una lunghezza di 10 cm di seta 7-0. Penetrare l'apice del cuore entrando da un lato e passando le punte delle forcepi attraverso il muscolo e fuori dall'altro lato. Afferrare la seta con un'altra serie di forcembi e tirare circa una lunghezza di 2 cm attraverso e legare. Prendere l'estremità rimanente di 8 cm della sutura, tirando il cuore caudally, e nastro adesivo l'estremità alla scheda chirurgica.
    NOTA: Questo creerà tensione, esponendo ulteriormente i grandi vasi e legato il cuore in posizione, consentendo un più facile posizionamento del catetere nell'arteria polmonare.
  3. Agganciare le punte delle force curve sotto l'AA e PAT. Tirare una lunghezza di 3 cm di 7-0 seta indietro attraverso l'apertura e creare una sutura sciolta a lancio singolo.
  4. Utilizzando le forbici fare un'incisione 1-2 mm verso l'apice del cuore, penetrando il ventricolo destro a parete sottile (RV), per consentire l'inserimento del catetere (Unità 1). Prima dell'inserimento, verificare che non vi sia aria nel sistema. Introdurre il tubo innescato nel ventricolo destro e avanzare delicatamente nel PAT semitrasparente a parete sottile.
    1. Verificare visivamente che il catetere non sia avanzato nei rami polmonari sinistro o destro e non si achioti il ramo dell'arteria polmonare. Utilizzando il nastro adesivo, fissare la parte distale del tubo alla scheda chirurgica.
      NOTA: Per identificare il camper, utilizzare le fopante per pizzicare il lato destro del cuore. A differenza del ventricolo sinistro, la parete libera relativamente sottile del camper dovrebbe essere facilmente afferrata.
    2. Per i topi più giovani di P7, collegare l'unità 2 a un micromanipolatore e introdurre l'estremità dell'ago dell'unità nel PAT come descritto sopra utilizzando il manipolatore.
  5. Stringere delicatamente la sutura allentata attorno a entrambi i grandi vasi e tagliare la lunghezza di 8 cm di sutura creata nel punto 3.2 per riportare il cuore in una posizione di riposo naturale. Il catetere è ora saldamente fissato all'interno del PAT.
  6. Agganciare l'auricolare sinistro del cuore per consentire al perfuso di uscire dal sistema.
  7. Proteggere la siringa contenente SNP (unità 1 o unità 2, a seconda delle dimensioni) nella pompa di siringa e perfuse la soluzione ad una velocità di 0,05 mL/min per lavare il sangue e dilatare al massimo la vascolatura. Sangue/perfusato uscirà attraverso l'auricolare tagliato. Continuare la perfusione fino a quando il perfusate non è chiaro (200 dollari di L in un topo adulto, meno per gli animali più giovani).
    NOTA: quando si perfuoca il PBS/SNP a bassa viscosità, è stato utilizzato un tasso di infusione relativamente più elevato nell'interesse del risparmio di tempo. Il composto polimero più viscoso viene infuso a una velocità più lenta per evitare il riempimento eccessivo, la rottura e il controllo sui punti finali distale.

4. Tracheostomia e inflazione polmonare

  1. Costruire l'unità di inflazione polmonare (Figura 2).
    1. Collegare un catetere in plastica flessibile 24 G (IV) (aghi rimossi)/butterfly infusione impostato su un stopcock, attaccato a una siringa aperta da 50 mL (senza stantuffo). Appendere la siringa da un supporto ad anello.
    2. Aggiungere il 10% di formalina tamponata alla siringa. Aprire il stopcock, permettendo formalin per entrare nel tubo e ripulire tutta l'aria dal sistema. Chiudere il pavone e sollevare la siringa fino a quando il menisco è 20 cm sopra la trachea8.
      CAUTION: Formalin è infiammabile, cancerogeno, acutamente tossico quando ingerito, e provoca irritazione della pelle, gravi danni agli occhi, sensibilizzazione della pelle e mutagenicità delle cellule germinali. Evitare l'ingestione e il contatto con la pelle e gli occhi. Evitare l'inalazione del vapore o della nebbia. Tenere lontano da fonti di accensione. Indossare attrezzature di protezione personale adeguate.
  2. Posizionare due suture sciolte inferiori alla cartilagine cricoide a 2-4 mm di distanza.
  3. Utilizzando le forbici, fare una piccola incisione nel legamento cricotiroide superiore alle suture.
  4. Inserire il catetere IV nell'apertura e far avanzare la punta oltre le due suture sciolte.
  5. Stringere le suture intorno alla trachea e aprire il stopcock. Lasciare che la formalina entri nei polmoni per gravità e attendere 5 minuti per i polmoni per gonfiarsi completamente. Se i polmoni aderiscono alla gabbia toracica durante l'inflazione, afferrare l'esterno della gabbia toracica con le forfie con punta smussata e muoversi in tutte le direzioni per aiutare a liberare i lobi. Non prendere contatto diretto con i polmoni.
  6. Dopo 5 minuti, indietro il catetere IV oltre la prima sutura e ligate. Ripetere l'operazione per la seconda sutura. I polmoni sono ora gonfiati in uno stato chiuso e pressurizzato.

5. Lanciare la vascolatura

  1. In un tubo da 1,5 mL, preparare 1 mL di una soluzione 8:1:18 di polimero:diluente: agente di cura e invertire delicatamente più volte per garantire una buona miscelazione.
  2. Togliere lo stantuffo da una siringa da 1 cc, coprire l'estremità opposta con un dito guanto e versare il composto polimero nella siringa. Reinserire con attenzione lo stantuffo, invertire e far avanzare lo stantuffo per rimuovere tutta l'aria e formare un menisco sulla punta della siringa.
  3. Rimuovere la siringa SNP/PBS dal mozzo dell'ago e gocciolare PBS aggiuntivo nel mozzo per creare un menisco. Controllare attentamente l'hub per l'aria intrappolata, spostare se necessario, e riformare il menisco. Unire l'hub alla siringa riempita con il composto polimero.
    NOTA: La creazione di un menisco su entrambe le estremità riduce significativamente la possibilità per l'aria di entrare nel sistema.
  4. Attaccare la siringa riempita composto polimero alla pompa di siringa e infondere a 0,02 mL/min.
    NOTA: Per i polmoni più piccoli, una velocità più lenta può essere utile per prevenire il riempimento eccessivo, ma non è essenziale.
  5. Monitorare il composto mentre si muove liberamente lungo il tubo PE e notare il volume della siringa mentre entra nel PAT. Continuare a riempire fino a quando tutti i lobi sono riempiti completamente fino al livello capillare e fermare la pompa di siringa. Controllare nuovamente il volume della siringa.
    NOTA: dopo diverse esecuzioni, è possibile utilizzare un volume stimato per misurare un endpoint approssimativo (35 usd per un topo adulto e 5 USD per un cucciolo P1). Dopo che la pompa è stata arrestata, la pressione residua nel sistema continuerà a spingere il composto polimero nelle arterie polmonari. Tutti i lobi polmonari dovrebbero riempirsi ad un ritmo simile.
  6. Coprire i polmoni con una salvietta di pulizia in fibra ottica, applicare liberamente PBS, e lasciare che la carcassa si sieda indisturbata per 30-40 min a temperatura ambiente. Durante questo periodo, il composto polimerica curerà e si indurisce.
  7. Rimuovere il catetere, seire le braccia/metà inferiore del mouse e posizionare la testa/torace in un conico da 50 mL riempito con 10% di formalina tamponata durante la notte.
  8. Dopo la fissazione, afferrare la trachea e separare delicatamente l'unità cuore/polmone dalla gabbia toracica e dal torace rimanenti. Posizionare il blocco cuore/polmone in una fiala scintillazione riempita di formalina. Scarta il resto.

6. Letti vascolari alternativi per la colata (tabella 1)

NOTA: Ogni letto vascolare bersaglio può richiedere diversi posizionamenti del catetere, tassi di infusione e tempi di riempimento ottimali. Così, più animali saranno necessari per lanciare più organi.

  1. Per i letti vascolari sistemici superiori o inferiori al diaframma seguire i passaggi 1.1-2.5 come sopra. Vedere ulteriori note sul sistema del portale e sul diaframma (Tabella 1).
  2. Afferrare il processo xifoide con un emostatico e tagliare bilateralmente la gabbia toracica (approssimativamente nella linea midaxillary) appena prima delle arterie toracici interne.
  3. Piegare la gabbia toracica ancora collegata su tale che è appoggiata sul collo / testa dell'animale, esponendo completamente la cavità toracica.
  4. Seguire il passaggio 3.1 precedente, quindi rimuovere i polmoni. Una volta che l'aorta toracica (TA) è visibile, agganciare le punte delle punte curve sotto di essa, 10 mm di qualità superiore al diaframma. Afferrare una lunghezza di 3 cm di seta 7-0, tirare indietro attraverso l'apertura sotto l'TA, e creare una sutura sciolta a lancio singolo. Ripetere questa procedura 8 mm sopra il diaframma.
  5. Per le strutture superiori al diaframma, utilizzare le forbici a molla per creare un piccolo foro (30% della circonferenza totale) sulla parte ventrale dell'TA, 2 mm inferiore alle suture sciolte poste al punto 6.4.
    1. Per le strutture inferiori al diaframma, invece, creare un piccolo foro di 2 mm superiore alle suture sciolte.
  6. A seconda delle dimensioni dell'animale, introdurre l'Unità 1 o 2 nella nave, avanzare oltre le suture sciolte e legare delicatamente la nave.
  7. Seguire il punto 3.7, impostando la pompa di siringa ad una velocità di 1,0 mL/min e perfutilizzando un minimo di 5 mL. Perfusate uscirà tramite l'IVC.
  8. Seguire i passaggi da 5.1 a 5.4 regolando la velocità di infusione a 0,05 mL/min, monitorando visivamente il tessuto bersaglio in tempo reale.
    NOTA: il volume di infusione sarà specifico per l'età degli organi e degli animali. Il volume può essere ulteriormente limitato da rami arteriosi leganti che portano a letti vascolari non bersaglio (ad esempio, cervello, fegato, rene, intestino).
  9. Seguire 5.6 quindi rimuovere il tessuto bersaglio e posizionare in formalina.

7. Campionamento del montaggio, scansione e ricostruzione per micro-CT

  1. Utilizzando la pellicola di paraffina, creare una superficie piana sul letto di scansione e centrare il campione bagnato su questa superficie (Figura 3A).
    NOTA: se viene rilevato un elemento di movimento, il campione potrebbe richiedere un'ulteriore stabilizzazione.
  2. Campione di tenda/copertura leggermente con pellicola di paraffina aggiuntiva per prevenire la disidratazione. Fare particolare attenzione a non appoggiare la pellicola di paraffina sul campione causando deformazioni al tessuto (Figura 3B).
  3. Eseguire la scansione del campione utilizzando le impostazioni descritte nella tabella 2 e standardizzare questi parametri all'interno di un determinato esperimento.
    NOTA: si tratta di un'esperimento/endpoint dipendente. Standardizzare i parametri scelti per facilitare il confronto tra i campioni.
  4. Trasferire le scansioni ricostruite per la post-elaborazione e l'analisi.

Risultati

Un cast di successo mostrerà un riempimento uniforme dell'intera rete arteriosa polmonare. Lo dimostriamo nei topi C57Bl/6J che variano in età: giorno postnatale P90 (Figura 4A), P30 (Figura 4B), P7 (Figura 4C) e P1 (Figura 4D). Controllando la velocità del flusso e monitorando visivamente il riempimento in tempo reale, sono stati raggiunti endpoint affidabili della v...

Discussione

Eseguito correttamente, questo metodo produce immagini sorprendenti di reti arteriose polmonari, consentendo il confronto e la sperimentazione nei modelli di roditori. Diversi passaggi critici lungo il percorso garantiscono il successo. In primo luogo, i ricercatori devono eparinizzare l'animale nella fase preparatoria per evitare che si forno coaguli di sangue nella vascolatura polmonare e nelle camere del cuore. Ciò consente il transito arteriosa completo del composto polimero. In secondo luogo, quando si perfora il d...

Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare

Riconoscimenti

Questa ricerca è stata sostenuta in parte dal programma di ricerca intramurale NHLBI (DIR HL-006247). Ringraziamo il NIH Mouse Imaging Facility per la guida nell'acquisizione e nell'analisi delle immagini.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
1cc syringeBecton Dickinson309659
20ml Glass Scintillation VialsFisher03-340-25P
30G NeedleBecton Dickinson305106
50mL conical tubesCornin352098For sample Storage and scanning
60cc syringeBecton Dickinson309653
7-0 silk sutureTeleflex103-S
Analyze 12.0 SoftwareAnalyzeDirect Inc.N/APrimary Software
Amira 6.7 SoftwareThermo ScientificN/AAlternative Sofware
CeramaCut Scissors 9cmFine Science tools14958-09
Ceramic Coated Curved ForcepsFine Science tools11272-50
CO2 TankRobert's Oxygen Co.n/a
Dual syringe pumpCole ParmerEW-74900-10
Dumont Mini-ForcepsFine Science tools11200-14
EthanolPharmco111000200
FormalinSigma - Life SciencesHT501128
GauzeCovidien441215
HemostatFine Science tools13013-14
Heparin (1000USP Units/ml)HospiraNDC 0409-2720-01
Horos SoftwareHoros ProjectN/AAlternative Sofware
induction chambern/an/a
KimwipeFisher06-666fiber optic cleaning wipe
Labelling TapeFisher15966
Magnetic BaseKanetecN/A
Micro-CT systemPerkinElmerQuantum GX
Microfil (Polymer Compound)Flowech Inc.Kit B - MV-1228 oz. of MV compound; 8 oz. of diluent; MV-Curing Agent
MicromanipulatorStoelting56131
Monoject 1/2 ml Insulin SyringeCovidien1188528012
Octagon Forceps Straight TeethFine Science tools11042-08
ParafilmBemis company, Inc.#PM999
PE-10 tubingInstechBTPE-10
Phospahte buffered SalineBioRad#161-0780
Ring StandFisherS13747Height 24in.
Sodium Nitroprussidesigma71778-25G
Steel PlateN/AN/A16 x 16 in. area, 1/16 in thick
Straight Spring ScissorsFine Science tools15000-08
SURFLO 24G Teflon I.V. CatheterSanta Cruz Biotechnology360103
Surgical BoardFisher12-587-20This is a converted slide holder
Universal 3-prong clampFisherS24280
Winged Inf. Set 25X3/4, 12" TubingNiproPR25G19
Zeiss Stemi-508 Dissection ScopeZeissn/a

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