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요약

이 기술의 목적은 폐 인플레이션과 폐 동맥을 통해 무선 불투명 한 폴리머 기반 화합물의 주입을 통해 초기 산후 및 성인 마우스의 폐 동맥 네트워크의 전 생체 시각화입니다. 캐스팅된 조직에 대한 잠재적 응용 프로그램도 논의됩니다.

초록

혈관은 3 차원 공간에서 복잡한 네트워크를 형성합니다. 따라서 조직의 표면을 관찰하여 혈관 네트워크가 상호 작용하고 어떻게 작용하는지 시각적으로 이해하기가 어렵습니다. 이 방법은 폐의 복잡한 3차원 혈관 구조를 시각화하는 수단을 제공한다.

이를 달성하기 위해 카테터는 폐 동맥에 삽입되고 혈관은 동시에 혈액을 플러시하고 저항을 제한하기 위해 화학적으로 팽창됩니다. 폐는 표준 압력에서 기관을 통해 팽창하고 중합체 화합물은 표준 유량에 혈관 침대에 주입된다. 전체 동맥 망이 채워지고 치료할 수 있게 되면 폐 혈관은 마이크로 CT(μCT) 스캐너에서 직접 시각화되거나 이미지화될 수 있습니다.

성공적으로 수행 하면, 하나는 초기 산후 나이에서 성인에 이르기까지 쥐에 폐 동맥 네트워크를 감사할 수 있습니다. 또한 폐 동맥 침대에서 시연되었지만 이 방법은 최적화된 카테터 배치 및 끝점을 갖춘 혈관 침대에 적용할 수 있습니다.

서문

이 기술의 초점은 마우스에 있는 폴리머 기지를 둔 화합물을 사용하여 폐 동맥 건축의 시각화입니다. 뇌,,심장 및 신장1,2,2,,3,4,5와같은 전신 혈관 침대에서 광범위한 작업이 수행되었지만 폐 동맥 망의 준비 및 충진에 관한 정보가 적습니다. 따라서 이 연구의 목적은 전작6,,7,,8을 확장하고 조사관이 쉽게 따를 수 있는 상세한 서면 및 시각적 참조를 제공하여 폐 동맥 나무의 고해상도 이미지를 생성하는 것입니다.

자기 공명 영상, 에코카디그래피 또는 CT 혈관 조영술9,,10과같은 폐 혈관을 라벨링 및 이미징하기 위한 수많은 방법이 존재하지만, 이러한 양식의 대부분은 연구될 수 있는 것의 범위를 제한하여 작은 혈관을 적절히 채우거나 캡처하지 못합니다. 직렬 단면 및 재구성과 같은 방법은 고해상도를 제공하지만 시간 /노동 집약적11,,12,,13입니다. 주변 연조직 무결성은 전통적인 부식 주조10,,13,,14,,15,,16에서손상된다. 동물 의 나이와 크기조차도 카테터를 도입하려고 할 때 요인이되거나 해상도가 부족합니다. 반면에 폴리머 주입 기술은 동맥을 모세관 수준으로 채우고 μCT와 결합하면 비교할 수 없는 분해능5를허용합니다. 산후 14일의 어린 마우스 폐에서 샘플을 성공적으로캐스팅하고 몇 시간 만에 처리되었습니다. 이들은 기존연조직(17)을손상시키지 않고 조직학적 제제/전자 현미경검사(EM)를 위해 무기한 재스캔하거나 심지어 보내질 수 있다. 이 방법의 주요 제한 사항은 CT 장비/소프트웨어의 선행 비용, 혈관 내 압력을 정확하게 모니터링하는 데 어려움을 겪고 있으며 동일한 동물에서 세로로 데이터를 수집할 수 없다는 것입니다.

이 논문은 폐 동맥 주입 기술을 더욱 최적화하고 출생 후 날 1 (P1)까지 연령 / 크기 관련 경계를 밀어 눈에 띄는 결과를 산출하기 위해 기존의 작업을 기반으로합니다. 동맥 혈관 네트워크를 연구하려는 팀에게 가장 유용합니다. 따라서 카테터 배치/안정화에 대한 새로운 지침을 제공하고, 채우기 속도/볼륨에 대한 제어가 증가하고, 주조 성공증가를 위한 주목할 만한 함정을 강조합니다. 그런 다음 결과 캐스트를 향후 특성화 및 형태 분석에 사용할 수 있습니다. 아마도 더 중요한 것은, 이것은 이 복잡한 절차를 통해 사용자를 안내하는 우리의 지식에 대한 첫 번째 시각적 데모입니다.

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프로토콜

여기에 설명된 모든 방법은 국립 심장 폐 및 혈액 연구소의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (ACUC)에 의해 승인되었습니다.

1. 준비

  1. 헤파린 (1 단위 /g 마우스 체중)과 마우스 를 인내하여 2 분 동안 앰필 할 수 있도록하십시오.
  2. CO2 챔버에서 동물을 안락사시합니다.
  3. 수술 판의 척추 자세로 마우스를 준비하고 테이프로 네 개의 팔다리를 모두 보드에 고정시하십시오. 미세 해부에 배율을 사용합니다.

2. 폐와 기관 노출

  1. 모발 간섭을 최소화하기 위해 마우스의 복부 면을 70% 에탄올로 스프레이합니다.
  2. 집게로 복부 피부를 잡고 배꼽 부위의 가위로 작은 절개를 합니다. 가위의 끝을 복부 근육과 피부 사이의 근막 층으로 밀어 넣고 두 층을 분리합니다. 복부, 흉곽 및 목에서 피부를 제거하여 장밋빛으로 작동합니다.
  3. 가위로 복부 근육을 열고 다이어프램이 노출될 때까지 양쪽에서 측면으로 자른다.
  4. xiphoid 과정을 부드럽게 파악하고 흉곽을 약간 들어 올려 얇고 반투명 한 다이어프램을 통해 caudal 폐의 시야를 극대화합니다. 신중하게 xiphoid 과정 바로 아래에 격막에 작은 절개를합니다. 폐는 붕괴하고 격막에서 물러나게 됩니다. 흉곽에서 멀리 격막을 해부, 폐 빈맥을 닉하지 않도록주의.
  5. 열등한 베나 카바(IVC)와 식도를 찾아 서두르고 다이어프램을 통과합니다. 거즈를 사용하여 흉부 구멍에 있는 모든 풀링 혈액을 청소하고 폐와의 접촉을 피하십시오.
  6. 다시 한 번 xiphoid를 잡고 부드럽게 들어 올립니다. 흉곽을 양측으로 잘라 (대략 midaxillary 라인에서) 폐와의 접촉을 피하십시오. 전방 흉곽을 완전히 제거하여 주누브리움 바로 앞에 흉골 각도를 따라 최종 절단을 합니다.
  7. 미리 채워진 주사기를 사용하여, 자유롭게 건조를 방지하기 위해 인산염 완충 식염수 (PBS, pH 7.4)로 폐를 적시. 절차 전반에 걸쳐 이 루틴을 계속합니다.
  8. 집게를 사용하여, 주브리움을 잡고 부드럽게 몸에서 상승. 가위를 사용하여 1-2mm 측면을 매니브리움으로 자르고, 쇄골을 절단하고, 제거합니다. 이렇게 하면 그 아래에 있는 흉선이 드러납니다.
  9. 흉골의 각 엽을 잡고, 분리하고 제거합니다. 이 절차를 submandib선으로 반복합니다. 마지막으로, 기관을 오버레이 근육 조직을 제거합니다.
    참고 : 해부 에 따라, 심장, 오름차순 대동맥 (AA), 폐 동맥 트렁크 (PAT), 및 기관표시되어야한다. 트렁크에서 벗어난 기본 동맥 가지가 분할되거나 부상되지 않았는지 확인합니다.

3. PA 카테터레이션 및 혈액 관류

  1. 유닛 1을 조립하기 위해, 30G 바늘의 허브에 PE-10 튜브15cm를 실어 PBS에서10-4M 나트륨 니트로스트러스사이드(SNP)로 미리 채워진 1mL 주사기에 부착한다. 모든 공기가이 단위 (그림 1)에서제거 될 때까지 플런저를 진행하여 튜브를 프라임합니다.
    주의: SNP는 삼키면 독성이 있습니다. 피부와 눈과의 접촉을 피하십시오. 취급 후 피부를 철저히 씻어 줍니다. 적절한 개인 보호 장비를 착용하십시오.
    1. 또는 단위 2를 어셈블합니다. 생후 7일(P7) 이하의 마우스의 경우, 후직을 사용하여 허브로부터 30G 바늘을 추가로 분리하고 바늘을 유닛1(도 1)의튜브의 열린 끝에 나사로 연결한다.
  2. 바늘 대신, 7-0 실크의 10cm 길이의 한쪽 끝을 파악하기 위해 곡선 날카로운 집게를 사용합니다. 한쪽에서 들어오는 심장의 정점을 관통하고 근육을 통해 다른 쪽에서 집게의 끝을 전달합니다. 또 다른 집게 세트로 실크를 잡고 약 2cm 길이를 당겨 묶습니다. 봉합사의 나머지 8cm 끝을 가지고, 심장을 caudally 잡아 당기고, 수술 보드에 끝을 테이프.
    참고 : 이것은 긴장을 만들어 큰 혈관을 더 노출시키고 심장을 제자리에 묶을 수 있으므로 폐 동맥에 카테터를 쉽게 배치 할 수 있습니다.
  3. AA와 PAT 의 곡선 집게 팁을 후크. 오프닝을 통해 다시 7-0 실크의 3cm 길이를 당겨 단일 던지기 느슨한 봉합사를 만듭니다.
  4. 가위를 사용하면 심장 정점을 향해 1-2mm 절개를 하여 얇은 벽의 오른쪽 심실(RV)을 관통하여 카테터(Unit 1)를 삽입할 수 있습니다. 삽입 하기 전에 시스템에 공기가 없는지 확인 합니다. 프라이밍 튜빙을 오른쪽 심실로 소개하고 반투명 얇은 벽의 PAT로 부드럽게 진출합니다.
    1. 카테터가 왼쪽 또는 오른쪽 폐 가지로 진행되지 않았으며 폐 동맥 분기점을 반소하지 않았는지 시각적으로 확인합니다. 테이프를 사용하여 튜브의 탈면 부분을 수술 보드에 고정하십시오.
      참고: RV를 식별하려면 집게를 사용하여 심장의 오른쪽을 꼬집습니다. 좌심실과 달리 RV의 비교적 얇은 자유 벽을 쉽게 파악해야 합니다.
    2. P7 보다 젊은 마우스의 경우, 장치 2를 마이크로 조작기에 부착하고 상기 기조를 사용하여 전술한 바와 같이 장치의 바늘 끝을 PAT에 도입한다.
  5. 큰 배 주위의 느슨한 봉합사를 부드럽게 조이고 3.2 단계에서 만든 봉합사의 8cm 길이를 잘라 내츄럴 한 휴식 위치로 심장을 돌려놓습니다. 이제 카테터는 PAT 내에서 단단히 고정됩니다.
  6. 심장의 왼쪽 오리클을 잘라서 퍼지가 시스템을 빠져나갈 수 있도록 합니다.
  7. 주사기 펌프에서 SNP 함유 주사기(유닛 1 또는 유닛 2, 크기 종속)를 확보하고 0.05mL/min의 속도로 용액을 침투하여 혈액을 플러시하고 혈관을 최대화합니다. 혈액/퍼퓸은 잘린 오리클을 통해 빠져나옵니다. 배설이 명확해질 때까지 관류를 계속하십시오 (성인 마우스의 경우 ~ 200 μL, 어린 동물에게는 적습니다).
    참고: 낮은 점도 PBS/SNP를 인퓨징할 때, 시간을 절약하기 위해 상대적으로 높은 주입율이 사용되었습니다. 점성이 높은 폴리머 화합물은 과충진, 파열 및 탈모 종점에 대한 제어를 최대화하기 위해 느린 속도로 주입됩니다.

4. 기관 절제술 및 폐 인플레이션

  1. 폐 인플레이션 단위를 구성합니다(그림2).
    1. 유연한 플라스틱 24G 정맥(IV) 카테터(바늘 제거)/나비 주입 세트를 스톱콕에 연결하여 50mL 주사기(플런저 없음)에 부착합니다. 링 스탠드에서 주사기를 걸어.
    2. 주사기에 10% 버퍼링 된 포르말린을 추가합니다. 스톱콕을 열어 포르말린이 튜브에 들어가 시스템에서 모든 공기를 제거할 수 있도록 합니다. 스톱콕을 닫고 반월 상 연골이 기관8위에 20cm 가 될 때까지 주사기를 올립니다.
      주의: 포르말린은 인화성, 발암성, 섭취 시 급성 독성이 있으며 피부 자극, 심각한 눈 손상, 피부 민감성 및 세균 세포 돌연변이성을 유발합니다. 섭취를 피하고 피부와 눈과 접촉하십시오. 증기 또는 미스트의 흡입을 피하십시오. 점화원에서 멀리 하십시오. 적절한 개인 보호 장비를 착용하십시오.
  2. 2-4mm 를 분해한 연골에 두 개의 느슨한 봉합사를 열등하게 놓습니다.
  3. 가위를 사용하여, 봉합사보다 우수한 카리갑 인대에 작은 절개를합니다.
  4. IV 카테터를 개구부에 삽입하고 두 개의 느슨한 봉합사를 넘어 팁을 진행합니다.
  5. 기관 주위의 봉합사를 조이고 스톱콕을 엽니다. 포르말린이 중력으로 폐로 들어가폐를 완전히 팽창시킬 때까지 5분 동안 기다립니다. 폐가 인플레이션 중에 흉곽을 고수하는 경우, 무딘 기울어진 집게로 흉곽의 외부를 잡고 모든 방향으로 이동하여 엽을 자유롭게 합니다. 폐와 직접 접촉하지 마십시오.
  6. 5 분 후, 첫 번째 봉합사 및 ligate 넘어 IV 카테터를 다시. 두 번째 봉합사를 반복합니다. 폐는 이제 폐쇄되고 가압된 상태로 팽창됩니다.

5. 혈관을 캐스팅

  1. 1.5mL 튜브에서, 8:1:1 용액8의 폴리머:희석제:경화제의 1mL을 준비하고 좋은 혼합을 보장하기 위해 여러 번 부드럽게 반전한다.
  2. 1cc 주사기에서 플런저를 제거하고, 장갑을 낀 손가락으로 반대쪽 끝을 덮고, 폴리머 화합물을 주사기에 붓습니다. 플런저를 조심스럽게 다시 삽입하고, 뒤집고, 플런저를 전진하여 모든 공기를 제거하고 주사기 끝에 반월상 연골을 형성합니다.
  3. 바늘의 허브에서 SNP/PBS 주사기를 제거하고 반월 상연을 만들기 위해 허브에 추가 PBS를 드립. 허브에 갇힌 공기를 주의 깊게 확인하고 필요한 경우 빠져나와 반월 상 연골을 개혁하십시오. 중합체 화합물로 채워진 주사기에 허브에 가입하십시오.
    참고: 양쪽 끝에 반월상연골을 만들면 공기가 시스템에 들어갈 수 있는 기회가 크게 줄어듭니다.
  4. 주사기 펌프에 채워진 폴리머 화합물을 부착하고 0.02 mL/min에 주입한다.
    참고: 폐가 작을수록 속도가 느려지는 것이 과충진을 방지하는 데 도움이 될 수 있지만 필수는 아닙니다.
  5. PE 튜브아래로 자유롭게 이동하여 주사기 볼륨을 주의하십시오. 모든 로브가 모세관 수준으로 완전히 채워지고 주사기 펌프를 멈출 때까지 계속 채웁니다. 주사기 볼륨을 다시 확인합니다.
    참고: 여러 실행 후 추정 부피를 사용하여 대략적인 끝점(성인 마우스의 경우~35 μL, P1 강아지의 경우 ~5 μL)을 측정할 수 있습니다. 펌프가 중단된 후 시스템의 잔류 압력은 중합체 화합물을 폐 동맥으로 계속 밀어 넣습니다. 모든 폐 엽은 비슷한 속도로 채워야합니다.
  6. 광섬유 세척 물티슈로 폐를 덮고, PBS를 자유롭게 바르고, 시체가 실온에서 30-40 분 동안 방해받지 않고 앉을 수 있도록하십시오. 이 기간 동안, 중합체 화합물은 치료및 경화될 것이다.
  7. 카테터를 제거하고 마우스의 팔/하반을 끊고 머리/흉부를 50mL 원판에 넣고 하룻밤 사이에 10% 버퍼링된 포르말린으로 채워진다.
  8. 고정 후, 기관체를 잡고 부드럽게 나머지 늑골 케이지와 흉부에서 심장 / 폐 단위를 분리합니다. 심장/폐 블록을 포르말린으로 채워진 신경병 바이알에 놓습니다. 나머지는 폐기합니다.

6. 주조를위한 대체 혈관 침대 (표 1)

참고: 각 표적 혈관 침대에는 다른 카테터 배치, 주입 속도 및 최적의 충전 시간이 필요할 수 있습니다. 따라서 여러 개의 장기를 발동하려면 여러 동물이 필요합니다.

  1. 다이어프램에 우수하거나 열등한 전신 혈관 침대의 경우 위와 같이 1.1-2.5 단계를 따릅니다. 포털 시스템 및 다이어프램(표1)에대한 추가 메모를 참조하십시오.
  2. 자궁 경외 심정 과정을 파악하고 흉부 동맥 바로 앞에서 흉곽을 양측으로 잘라냅니다( 대략 미색선에서).
  3. 여전히 연결된 흉곽을 접어서 동물의 목/머리에 놓여 있어 가슴 구멍을 완전히 노출시합니다.
  4. 위의 단계 3.1을 따라 폐를 제거하십시오. 흉부 대오르타 (TA)가 보이면 다이어프램보다 + 10mm 우수한 곡면 집게의 팁을 연결합니다. 7-0 실크의 3cm 길이를 잡고 TA에서 개구부를 뒤로 당기고, 단일 던지기 느슨한 봉합사를 만듭니다. 다이어프램 위의 이 절차를 ~8mm 이상 반복합니다.
  5. 다이어프램보다 우수한 구조물의 경우, 스프링 가위를 사용하여 TA의 복부 부분에 작은 구멍(총 둘레의 ~30%)을 만들고, 6.4단계에 놓인 느슨한 봉합사보다 ~2mm 열등하게 된다.
    1. 다이어프램보다 열등한 구조의 경우, 대신, 느슨한 봉합사보다 우수한 작은 구멍 ~2mm를 만듭니다.
  6. 동물의 크기에 따라 1또는 2유닛을 용기에 넣고 느슨한 봉합사를 넘어 부드럽게 배를 리게이트합니다.
  7. 3.7단계를 따라 주사기 펌프를 1.0mL/min의 속도로 설정하고 최소 5mL를 인내합니다. Perfusate는 IVC를 통해 종료됩니다.
  8. 5.1 -5.4의 주입률을 0.05mL/min으로 조정하여 실시간으로 표적 조직을 시각적으로 모니터링합니다.
    참고: 주입 량은 장기 및 동물 연령에 따라 다릅니다. 부피는 비표적 혈관 침대 (즉, 두뇌, 간, 신장, 창자)로 이어지는 동맥 가지를 결찰함으로써 더 제한 될 수 있습니다.
  9. 5.6을 따라 표적 조직을 제거하고 포르말린에 놓습니다.

7. 마이크로 CT용 샘플 마운트, 스캔 및 재구성

  1. 파라핀 필름을 사용하여 스캐닝 침대에 평평한 표면을 만들고 이 표면의 젖은 샘플을 중심으로한다(그림 3A).
    참고: 모션 아티팩트가 감지되면 샘플에 추가 안정화가 필요할 수 있습니다.
  2. 탈수 방지를 위해 파라핀 필름을 추가하여 가볍게 텐트/커버 샘플을 추가로 처리합니다. 조직에 변형을 일으키는 샘플에 파라핀 필름을 쉬지 않도록 특별한주의를 기울인다(도3B).
  3. 표 2에 설명된 설정을 사용하여 샘플을 스캔하고 지정된 실험 내에서 이러한 매개 변수를 표준화합니다.
    참고: 이것은 실험/끝점에 따라 다릅니다. 샘플 간의 비교용용으로 선택한 매개 변수를 표준화합니다.
  4. 사후 처리 및 분석을 위해 재구성된 스캔을 전송합니다.

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결과

성공적인 캐스트는 전체 폐 동맥 네트워크의 균일 한 충전을 전시할 것입니다. 우리는 나이에 이르기까지 C57Bl/6J 마우스에서 이를 입증합니다: 산후일 P90(도 4A),P30(도 4B),P7(도 4C),및 P1(도 4D). 유량의 속도를 제어하고 실시간으로 채우기를 시각적으로 모니터링함으로써, 가장 단산적?...

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토론

제대로 실행, 이 방법은 폐 동맥 네트워크의 눈에 띄는 이미지를 산출, 설치류 모델의 비교 및 실험을 허용. 길을 따라 몇 가지 중요한 단계는 성공을 보장합니다. 첫째, 조사관은 혈전이 심장의 폐 혈관과 챔버에서 형성되는 것을 방지하기 위해 준비 단계에서 동물을 헤아린해야합니다. 이를 통해 중합체 화합물의 완전한 동맥 통과를 가능하게 합니다. 둘째, 다이어프램을 뚫고 흉곽을 제거 할 때,...

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공개

저자는 공개 할 것이 없다

감사의 말

이 연구는 NHLBI 교내 연구 프로그램 (DIR HL-006247)에 의해 부분적으로 지원되었다. NIH 마우스 이미징 시설에서 이미지 수집 및 분석에 대한 지침을 주셔서 감사합니다.

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자료

NameCompanyCatalog NumberComments
1cc syringeBecton Dickinson309659
20ml Glass Scintillation VialsFisher03-340-25P
30G NeedleBecton Dickinson305106
50mL conical tubesCornin352098For sample Storage and scanning
60cc syringeBecton Dickinson309653
7-0 silk sutureTeleflex103-S
Analyze 12.0 SoftwareAnalyzeDirect Inc.N/APrimary Software
Amira 6.7 SoftwareThermo ScientificN/AAlternative Sofware
CeramaCut Scissors 9cmFine Science tools14958-09
Ceramic Coated Curved ForcepsFine Science tools11272-50
CO2 TankRobert's Oxygen Co.n/a
Dual syringe pumpCole ParmerEW-74900-10
Dumont Mini-ForcepsFine Science tools11200-14
EthanolPharmco111000200
FormalinSigma - Life SciencesHT501128
GauzeCovidien441215
HemostatFine Science tools13013-14
Heparin (1000USP Units/ml)HospiraNDC 0409-2720-01
Horos SoftwareHoros ProjectN/AAlternative Sofware
induction chambern/an/a
KimwipeFisher06-666fiber optic cleaning wipe
Labelling TapeFisher15966
Magnetic BaseKanetecN/A
Micro-CT systemPerkinElmerQuantum GX
Microfil (Polymer Compound)Flowech Inc.Kit B - MV-1228 oz. of MV compound; 8 oz. of diluent; MV-Curing Agent
MicromanipulatorStoelting56131
Monoject 1/2 ml Insulin SyringeCovidien1188528012
Octagon Forceps Straight TeethFine Science tools11042-08
ParafilmBemis company, Inc.#PM999
PE-10 tubingInstechBTPE-10
Phospahte buffered SalineBioRad#161-0780
Ring StandFisherS13747Height 24in.
Sodium Nitroprussidesigma71778-25G
Steel PlateN/AN/A16 x 16 in. area, 1/16 in thick
Straight Spring ScissorsFine Science tools15000-08
SURFLO 24G Teflon I.V. CatheterSanta Cruz Biotechnology360103
Surgical BoardFisher12-587-20This is a converted slide holder
Universal 3-prong clampFisherS24280
Winged Inf. Set 25X3/4, 12" TubingNiproPR25G19
Zeiss Stemi-508 Dissection ScopeZeissn/a

참고문헌

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