Preparación de tejidos cardíacos de ingeniería en forma de malla derivados de células iPS humanas para la reparación del miocardio In Vivo

Resumen

El presente protocolo genera tejidos cardíacos de ingeniería en forma de malla que contienen células cardiovasculares derivadas de células madre pluripotentes inducidas por el hombre para permitir la investigación de la terapia de implantación celular para enfermedades del corazón.

Resumen

El protocolo actual describe métodos para generar tejidos cardíacos (ECT) de ingeniería en forma de malla escalables compuestos por células cardiovasculares derivadas de células madre pluripotentes inducidas por humanos (hiPSC), que se desarrollan hacia el objetivo del uso clínico. Los cardiomiocitos derivados de HiPSC, las células endoteliales y las células murales vasculares se mezclan con matriz de gel y luego se vierten en un molde de tejido de polidimetilsiloxano (PDMS) con postes escalonados internos rectangulares. Por día de cultivo 14 ECT maduran en una estructura de malla de 1,5 cm x 1,5 cm con paquetes de miofibra de 0,5 mm de diámetro. Los cardiomiocitos se alinean con el eje largo de cada haz y golpean espontáneamente sincrónicamente. Este enfoque se puede escalar hasta un ECT de malla más grande (3,0 cm x 3,0 cm) conservando la maduración y función de construcción. Por lo tanto, los ECT en forma de malla generados a partir de células cardíacas derivadas de hiPSC pueden ser factibles para los paradigmas de regeneración cardíaca.

Introducción

Numerosos estudios preclínicos y ensayos clínicos han confirmado la eficiencia de las terapias regenerativas cardíacas basadas en células para corazones en quiebra^1,2,3. Entre varios tipos de células, las células madre pluripotentes inducidas por humanos (hiPSC) son fuentes celulares prometedoras en virtud de su capacidad proliferativa, potencial para generar varios linajes cardiovasculares^4,,5,y alogenicidad. Además, las tecnologías de ingeniería de tejidos han hecho posible transferir millones de células a un corazón dañado^5,,6,7,8.

Anteriormente, informamos de la generación de tejidos cardíacos de ingeniería lineal tridimensional (3D) (ECT) a partir de linajes cardiovasculares derivados de hiPSC utilizando un sistema de cultivo disponible comercialmente para tejidos bioartificiales 3D^5,,7. Encontramos que la coexistencia de células endoteliales vasculares y células murales con cardiomiocitos dentro de la ECT facilitaba la maduración del tejido estructural y electrofisiológico. Además, validamos el potencial terapéutico de los hiPSC-ECT implantados en un modelo de infarto de miocardio de rata tolerante al inmunelí para mejorar la función cardíaca, regenerar el miocardio y mejorar la angiogénesis^5. Sin embargo, los ECT lineales construidos por este método eran cilindros de 1 mm por 10 mm y, por lo tanto, no eran adecuados para la implantación en estudios preclínicos con animales más grandes o uso clínico.

Basándonos en el uso exitoso de moldes tisulares para generar la formación de tejidos de ingeniería porosa utilizando mioblastos esqueléticos de rata y cardiomiocitos^9,cardiomiocitos humanos derivados de ESC¹⁰ y iPSCs^{de ratón 11,}desarrollamos un protocolo para generar tejido implantable más grande derivado de hiPSC escalable utilizando moldes de polidimemetilsiloxano (PDMS). Evaluamos una gama de geometrías de moldes para determinar las características más efectivas del molde. Los ECT en forma de malla con múltiples haces y uniones presentaban excelentes características en viabilidad celular, función de tejido y escalabilidad en comparación con formatos lineales o de hojas lisas que carecía de poros o uniones. Implantamos el ECT en forma de malla en un modelo de infarto de miocardio de rata y confirmamos sus efectos terapéuticos similares a los ECT cilíndricos implantados^12. Aquí describimos el protocolo para generar un ECT en forma de malla derivado de hiPSC.

Protocolo

1. Mantenimiento de hiPSC y diferenciación cardiovascular

1. Ampliar y mantener hiPSCs en la matriz de membrana del sótano de capa delgada (factor de crecimiento reducido, 1:60 dilución) en medio condicionado extraído de fibroblastos embrionarios de ratón (MEF-CM) con factor de crecimiento de fibroblastos básico humano (hbFGF)⁴.
   NOTA: Utilizamos una línea hiPSCs (4 factores (Oct3/4, Sox2, Klf4 y c-Myc): 201B6). Agregue hbFGF a la concentración adecuada para cada línea celular. El fragmento de Laminin-511 también se puede utilizar para el recubrimiento de la placa de cultivo en lugar de la matriz de membrana del sótano. El medio disponible comercialmente diseñado para la cultura libre de alimentadores de hiPSC se puede utilizar como sustituto de MEF-CM.
2. Utilice Versene (0,48 mM de solución de ácido etilendiaminetetraacético (EDTA)) para separar y disociar las células cuando la confluencia celular alcanza los 90o U2012100%.
   NOTA: También se pueden utilizar otros productos disponibles comercialmente para la disociación celular.
3. Células de placa a una densidad de 10.000 células/mm² en placas de cultivo celular recubiertas de matriz en MEF-CM con hbFGF y cultivo durante dos o tres días.
4. Cuando el cultivo se vuelva completamente confluente, cubra las células con matriz (1:60 dilución con MEF-CM) durante un día.
5. Sustituya el MEF-CM por el medio RPMI 1640 + B27. Añadir 100 ng/mL de Activin A y 100 ng/mL de Wnt3A al medio durante un día.
   NOTA: Este es el día 0 de diferenciación. Para regular la señalización canónica de Wnt, también se pueden utilizar inhibidores GSK3 en lugar de Wnt3A.
6. En el día 1 de diferenciación, cambie el medio a la nueva RPMI 1640 + B27 con 10 ng/mL de BMP4 y 10 ng/mL de hbFGF. Células de cultivo para dos (protocolo MC) o cuatro (protocolo CM+EC) días sin cambio medio⁵.
   NOTA: El protocolo CM+EC está optimizado para inducir simultáneamente cardiomiocitos (CM) y células endoteliales vasculares (CE). El protocolo MC está optimizado para inducir preferentemente células murales vasculares (MC).
7. Protocolo CM+EC para la inducción de CM y ECs(Figura 1A).
   1. Sustituya el medio en el día 5 de diferenciación por RPMI 1640 + B27 complementado con 50 ng/ml de VEGF₁₆₅.
   2. Cambiar el medio de cultivo cada 48 h hasta el día 13-u201215 de diferenciación.
8. Protocolo MC para la inducción de células murales vasculares(Figura 1B)
   1. Sustituya el medio por el suero bovino fetal RPMI1640 + 10% (FBS) en el día 3 de diferenciación.
   2. Cambiar el medio de cultivo cada 48 h hasta el día 13-u201215 de diferenciación.

2. Cosecha celular y análisis de linaje en el día de diferenciación 13-u201215

1. Lavar las células con Ca²⁺ y Mg²⁺ solución salina libre de fosfato amortiguado (PBS).
2. Añadir solución de disociación celular (que contiene proteasas, colagenasas y DNAses) en el plato de cultivo celular para cubrir la placa. Incubar la placa durante 5 min a 37oC.
3. Recoger y disociar las células con medio de cultivo utilizando una pipeta después de la incubación.
4. Asigne 1 x 10⁶ celdas para el análisis de linaje con citometría de flujo. Para eliminar las células muertas, manche las células con un tinte de viabilidad fijable.
5. Manche las células con marcadores de superficie de membrana en PBS con 5% FBS. Utilice las siguientes diluciones de anticuerpos en la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) tampón de tinción: anti-PDGFR (1:100), anti-VE cadherina (1:100), anti-TRA-1-60 (1:20).
6. Para proteínas intracelulares, resuspender y fijar las células con 4% de paraformaldehído (PFA) en PBS.
7. Manchar las células con isoforma anti-cardiaca de Troponina T (cTnT) en PBS con 5% FBS y 0.75% Saponina, luego etiquetar el anticuerpo cTnT con 488 ratón IgG1 (dilución 1:50).
8. Resuspender las células manchadas en PBS con 5% FBS y ponerlas en tubos FACS con colador celular.
9. Analizar la composición celular de las células manchadas de cada protocolo de diferenciación con citometría de flujo para facilitar la generación de suspensiones celulares con distribuciones de linaje definidas.
   NOTA: Durante la realización de este procedimiento, la suspensión celular restante para las ECT se conserva en un refrigerador de 4 oC.

3. Fabricación de moho tisular PDMS

1. Funde una capa de 0,5 mm de espesor y más de 30 mm x 30 mm de polidimetilsiloxano (PDMS) mezclando el prepolímero y la solución de reticulación a una relación de 10:1 y luego cura a 80 oC durante 3 h.
2. Corte la hoja PDMS y adhiera con adhesivo de silicona para fabricar una bandeja rectangular de 21 mm x 20,5 mm con 7 mm de largo, 0,5 mm de ancho y postes rectangulares de 2,5 mm de alto en una posición escalonada. El espaciado horizontal de los postes entre dos líneas de los postes es de 2,5 mm(Figura 2B).
3. Autoclave la bandeja a 120oC durante 20 min.
4. Cubrir la bandeja con 1% de poloxámero 407 en PBS durante 1 h. Enjuague el poloxámero 407 y enjuague el molde con PBS lo suficiente antes de usarlo.

4. Construcción de TEC

1. Después del análisis del linaje celular, combine las células de los protocolos CM+EC y MC para que la concentración final de MCs sea de 10 a 20% en un número de células total de seis millones de células por construcción⁵.
2. Suspenda seis millones de células mixtas en el medio de cultivo de ECT (medio esencial mínimo alfa complementado con 10% FBS, 50 m 2-mercaptoetanol y 100 U/mL Penicilina-Estreptomicina).
3. Preparación de la solución de matriz
   1. Mezclar 133 l de solución de colágeno de cola de rata soluble en ácido tipo I (2 mg/ml, pH 3) con 17 l de 10x medio esencial mínimo (MEM). A continuación, mezcle la solución con 17 l de tampón alcaldiano (0,2 M NaHCO₃, 0,2 M HEPES y 0,1 M NaOH).
      NOTA: El colágeno debe mantenerse sobre hielo (4 oC). Compruebe el color del búfer y si el medio no se vuelve rosado cuando todas las soluciones se mezclan, agregue búfer alcaldizo adicional al medio. Los pasos de mezcla deben ser mezclar colágeno I + 10x MEM, y luego añadir buffer alcalico. NO cambie este orden. NO genere burbujas en la mezcla.
   2. Añadir 67 l de matriz de membrana del sótano a la solución de colágeno neutralizado.
      NOTA: La solución mixta debe mantenerse sobre hielo (4 oC).
4. Centrifugar la suspensión celular preparada que contiene seis millones de células a 1.100 rpm (240 x g)durante 5 min y resuspenda las células con 167 l de DMEM de alta glucosa + 20% FBS + 1% penicilina-estreptomicina (100x).
5. Mezclar la suspensión celular y la solución de matriz. El volumen total de la mezcla de células/matrices para una construcción es de 400 l.
   NOTA: La mezcla de celda/matriz debe ser no viscosa y de color rosado en este paso. Manténgalo sobre hielo, ya que el gel se solidificará a temperatura ambiente. La concentración final de colágeno tipo I es de 0,67 mg/ml.
6. Vierta la mezcla celular/matriz uniformemente sobre el molde de tejido PDMS recubierto de poloxámero 407, que se coloca en una placa de cultivo de seis pozos¹².
   NOTA: Vierta la mezcla cuidadosamente para evitar la generación de burbujas con el fin de evitar defectos de llenado en el gel vertido.
7. Incubar la mezcla celular/matriz en una incubadora estándar de_CO2 (37C, 5 % CO₂) durante 60 min.
8. Después de que se forme el tejido, remoje el molde tisular con 4 ml de medio de cultivo de TEC.
   NOTA: Aunque la celda/matriz está reticulada en 60 min, la construcción sigue siendo muy frágil. Agregue suavemente el medio para evitar dañarlo.
9. Cultivo del tejido durante 14 días con cambio medio todos los días.
10. Antes de la implantación de la TEC, retire la TEC de los postes de carga con fórceps finos esterilizados.
    NOTA: Las dimensiones finales de ECT después de la eliminación del molde son menores que el molde original. Un molde de 2,1 cm x 2,05 cm genera un ECT liberado de aproximadamente 1,5 cm x 1,5 cm. Un molde más grande de 3,9 cm x 4,05 cm genera un ECT de aproximadamente 3 cm x 3 cm. La TEC descargada muestra golpes espontáneos intrínsecos en un medio de cultivo cálido. Aunque inicialmente mantiene una estructura de malla, un ECT descargado se encoge y se condensa con el tiempo. Es posible sostener el tejido suavemente con fórceps finos y luego usar sutura de seda 7-0 para unir el ECT al epicardio.

Resultados

El cuadro 1A, B muestra los esquemas del protocolo CM+EC y MC. Después de inducir los CM y los FC del protocolo CM+EC y los MC del protocolo MC, las células se mezclan ajustando las concentraciones finales de MC para representar entre el 10 y el 20% del total de células. El molde de tejido de 2 cm de ancho se fabrica de acuerdo con el dibujo de diseño de una hoja PDMS de 0,5 mm de espesor(Figura 2A,B). Seis millones de célu...

Discusión

Tras la finalización de nuestra investigación de un formato lineal, derivado de hiPSC ECT^5,adaptamos el protocolo para mezclar CM, EC y MC derivados de hiPSC para facilitar la expansión in vitro de las células vasculares dentro de las ECT y el posterior acoplamiento vascular in vivo entre las ECT y el miocardio receptor.

Para facilitar la generación de geometrías ECT de malla más grandes e implantables, utilizamos láminas delgadas de PDMS para diseñar los molde...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
Cell Culture Dishes 100x20 mm style	Falcon/ Thomas scientific	9380C51
Multiwell Plates For Cell Culture 6well 50/CS	Falcon / Thomas scientific	6902A01
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Dow Corning	761036
Reagents
Accumax	Innovative Cell Technologies	AM-105
BMP4, recombinant (10µg)	R&D	RSD-314-BP-010
Collagen, Type I solution from rat tail	Sigma	C3867
Growth factor-reduced Matrigel	Corning	356231
Human VEGF (165) IS, premium grade	Miltenyi	130-109-385
Pluronic F-127, 0.2 µm filtered (10% Solution in Water)	Molecular Probes	P-6866
Recombinant human bFGF	WAKO	060-04543
Recombinant Human/Mouse/Rat ActivinA (50µg)	R&D	338-AC-050
rh Wnt-3a (10µg)	R&D	5036-WN
Versene solution	Gibco	15040066
Culture medium and supplements
10x MEM	Invitrogen	11430
2 Mercaptro Ethanol	SIGMA	M6250
B27 supplement minus insulin	Gibco	A1895601
DMEM, high glucose	Gibco	11965084
Fetal Bovine Serum (500ml)	Any
Fetal Bovine Serum (500ml)	Any
L-Glutamine	Gibco	25030081
NaHCO3	Any
PBS 1x	Gibco	10010-031
Penicillin-Streptomycin (5000 U/mL)	Gibco	15070-063
RPMI1640 medium	Gibco	21870092
αMEM	Invitrogen	11900024
Flowcytometry
anti-TRA-1-60, FITC, Clone: TRA-1-60, BD Biosciences	BD / Fisher	560380
anti-Troponin T, Cardiac Isoform Ab-1, Clone: 13-11, Thermo Scientific Lab Vision	Fisher	MS-295-P0
BD FACS Clean Solution	BD	340345
BD FACSFlow Sheath Fluid	BD	342003
BD FACSRinse Solution	BD	340346
EDTA	Any
Falcon Tube with Cell Strainer Cap (Case of 500)	Corning	352235
Fetal Bovine Serum (500ml)	Any
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation	Molecular Probes	L34957
PDGFRb; anti-CD140b, R-PE, Clone: 28D4, BD Biosciences	BD / Fisher	558821
Saponin	Sigma-Aldrich	47306-50G-F
VEcad-FITC; anti-CD144, FITC, Clone: 55-7H1, BD Biosciences	BD / Fisher	560411
Zenon Alexa Fluor 488 Mouse IgG1 Labeling Kit	Molecular Probes	Z25002