In Vivo Miyokardiyal Onarım için İnsan iPS Hücrelerinden Elde Edilen Örgü Şekilli Mühendislik Kardiyak Dokuların Hazırlanması

Özet

Bu protokol, kalp hastalıkları için hücre implantasyon tedavisinin araştırılmasına olanak sağlamak için insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden elde edilen kardiyovasküler hücreleri içeren mesh şeklinde tasarlanmış kardiyak dokular üreder.

Özet

Mevcut protokol, klinik kullanım amacına yönelik olarak geliştirilen, insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden (hiPSC) elde edilen kardiyovasküler hücrelerden oluşan ölçeklenebilir, örgü şeklinde tasarlanmış kalp dokuları (ECTs) oluşturma yöntemlerini açıklamaktadır. HiPSC kaynaklı kardiyomiyositler, endotel hücreleri ve vasküler duvar hücreleri jel matrisi ile karıştırılır ve daha sonra dikdörtgen internal sendelenmiş direkler ile bir polidimetilsiloksane (PDMS) doku kalıbına dökülür. Kültür gününe göre 14 ECT, 0,5 mm çapında miyofiber demetleri ile 1,5 cm x 1,5 cm örgü yapıya dönüşür. Kardiyomiyositler her paketin uzun eksenine hizalanır ve kendiliğinden senkronize olarak yener. Bu yaklaşım, yapı olgunlaşması ve fonksiyonu korunarak daha büyük (3,0 cm x 3,0 cm) örgü EKT'ye kadar ölçeklendirilebilir. Bu nedenle, hiPSC kaynaklı kardiyak hücrelerden üretilen örgü şekilli ECT'ler kardiyak rejenerasyon paradigmaları için uygun olabilir.

Giriş

Çok sayıda preklinik çalışmalar ve klinik çalışmalar başarısız kalpler için hücre tabanlı kardiyak rejeneratif tedavilerin etkinliğini doğruladı^1,2,3. Çeşitli hücre tipleri arasında, insan kaynaklı pluripotent kök hücreler (hiPSCs) onların proliferatif yeteneği sayesinde hücre kaynakları umut verici, çeşitli kardiyovasküler soy oluşturmak için potansiyel^4,5, ve allojenite. Buna ek olarak, doku mühendisliği teknolojileri mümkün hasarlı bir kalp üzerine milyonlarca hücre aktarmak için yaptık^5,6,7,8.

Daha önce, hiPSC kaynaklı kardiyovasküler soylardan 3Boyutlu biyoyapay dokular için ticari olarak mevcut kültür sistemi kullanarak üç boyutlu (3D) lineer mühendislik kardiyak dokuların (ECTs) üretimi rapor^5,7. EKT içinde kardiyomiyositler ile vasküler endotel hücreleri ve duvar hücrelerinin birlikte bulunmasının yapısal ve elektrofizyolojik doku olgunlaşmasını kolaylaştırdığını bulduk. Ayrıca, kardiyak fonksiyonu geliştirmek için bağışıklık toleranslı sıçan miyokard infarktüs modelinde implante hiPSC-ECTs terapötik potansiyelini doğruladı, miyokardiyum yeniden, ve anjiyogenez geliştirmek^5. Ancak, bu yöntemle yapılan lineer ECT'ler 1 mm x 10 mm silindir olup, bu nedenle daha büyük hayvanlar veya klinik kullanımlı klinik öncesi çalışmalarda implantasyon için uygun değildir.

Sıçan iskelet miyoblastları ve kardiyomiyositler⁹, insan ESC türetilmiş kardiyomiyositler¹⁰ ve fare iPSCs¹¹kullanarak gözenekli mühendislik doku oluşumu oluşturmak için doku kalıplarının başarılı kullanımı dayanarak, biz polidimethylsiloxane kullanarak ölçeklenebilir hiPSC kaynaklı büyük implante doku oluşturmak için bir protokol geliştirdi (PDMS) kalıpları. En etkili kalıp özelliklerini belirlemek için çeşitli kalıp geometrilerini değerlendirdik. Birden fazla demet ve kavşakiçeren kafes şeklindeki ECT'ler, gözenek veya kavşaklardan yoksun düz veya doğrusal biçimlere kıyasla hücre canlılığı, doku fonksiyonu ve ölçeklenebilirlik açısından mükemmel özellikler sergiledi. Biz bir sıçan miyokard infarktüsü modelinde örgü şeklinde EKT implante ve implante silindirik ECTs benzer terapötik etkileri doğruladı¹². Burada hiPSC türetilmiş örgü şeklinde bir AKT oluşturmak için protokolü açıklıyoruz.

Protokol

1. HiPSC'lerin bakımı ve kardiyovasküler farklılaşma

1. Genişletmek ve ince kat bodrum membran matris hiPSCs korumak (büyüme faktörü azaltılmış, 1:60 seyreltme) insan temel fibroblast büyüme faktörü ile fare embriyonik fibroblastlar (MEF-CM) çıkarılan koşullu ortamda 4^.
   NOT: HiPSCs (4 faktörlü (Oct3/4, Sox2, Klf4 ve c-Myc) hattı: 201B6) kullandık. Her hücre hattı için uygun konsantrasyonda hbFGF ekleyin. Laminin-511 parçası da bodrum membran matris yerine kültür çanak kaplama için kullanılabilir. HiPSC'lerin besleyicisiz kültürü için tasarlanmış ticari olarak kullanılabilen ortam, MEF-CM'nin yerine kullanılabilir.
2. Hücre birleşmesi %90\u2012100%'e ulaştığında hücreleri ayırmak ve ayırmak için Versene (0,48 mM ethylenediaminetetraastic asit (EDTA) çözeltisi kullanın.
   NOT: Hücre ayrıştırması için ticari olarak kullanılabilen diğer ürünler de kullanılabilir.
3. MEF-CM'de 10.000 hücre/mm² yoğunluktaki plaka hücreleri hbFGF ve kültür ile iki ila üç gün süreyle.
4. Kültür tamamen kaynaştığında, hücreleri bir gün boyunca matrisle (MEF-CM ile 1:60 seyreltme) kaplayın.
5. MEF-CM'yi RPMI 1640 + B27 ortamı ile değiştirin. Bir gün için ortama 100 ng/mL Activin A ve 100 ng/mL Wnt3A ekleyin.
   NOT: Bu fark gün 0. Kanonik Wnt sinyalini düzenlemek için Wnt3A yerine GSK3β inhibitörleri de kullanılabilir.
6. Farklılaşmanın birinci gününde, ortamı yeni RPMI 1640 + B27 olarak 10 ng/mL BMP4 ve hbFGF 10 ng/mL ile değiştirin. İki (MC protokolü) veya dört (CM+EC protokolü) için kültür hücreleri orta değişiklik olmadan⁵.
   NOT: CM+EC protokolü aynı anda kardiyomiyosit (CM) ve vasküler endotel hücreleri (ECs) indüklemek için optimize edilmiştir. MC protokolü tercihen vasküler duvar hücreleri (MCs) indüklemek için optimize edilmiştir.
7. CM ve EC'lerin indüksiyonu için CM+EC protokolü (Şekil 1A).
   1. 5. gün farklılaşmanın ortasını RPMI 1640 + B27 ile değiştirin veVeGF_165'in50 ng/mL'si ile tamamlayınız.
   2. 13\u201215 güne kadar her 48 saatte bir kültür ortamını değiştirin.
8. Vasküler duvar hücrelerinin indüksiyonu için MC protokolü (Şekil 1B)
   1. Farklılaşmanın 3.
   2. 13\u201215 güne kadar her 48 saatte bir kültür ortamını değiştirin.

2. Farklılaşma gününde hücre hasadı ve soy analizi 13\u201215

1. Hücreleri Ca²⁺ ve Mg²⁺ serbest fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın.
2. Hücre kültür çanak tabla kapsayacak şekilde hücre bölünmesi çözeltisi (proteazlar, kolajneler ve NASEs içeren) ekleyin. Plakayı 37 °C'de 5 dk kuluçkaya yatırın.
3. Kuluçka dan sonra bir pipet kullanarak kültür ortamı ile hücreleri toplamak ve ayrıştırın.
4. Akış sitometrisi ile soy analizi için 1 x 10⁶ hücre ayırın. Ölü hücreleri ortadan kaldırmak için, sabitlenebilir canlılık boya ile hücreleri leke.
5. PBS'de hücreleri %5 FBS ile membran yüzey belirteçleriyle lekeleyin. Floresan aktif hücre sıralama (FACS) boyama tamponu antikor aşağıdaki seyreltme kullanın: anti-PDGFRβ (1:100), anti-VE kadherin (1:100), anti-TRA-1-60 (1:20).
6. Hücre içi proteinler için PBS'de %4 paraformaldehit (PFA) ile hücreleri yeniden askıya alın ve düzeltin.
7. PBS'de Troponin T (cTnT) antikardiyak izoformlu hücreleri %5 FBS ve %0,75 Saponin ile lekeleyin, ardından cTnT antikorlarını 488 fare IgG1 (seyreltme 1:50) ile etiketleyin.
8. PBS'deki lekeli hücreleri %5 FBS ile yeniden askıya alın ve hücre süzgeci ile FACS tüplerine koyun.
9. Tanımlanmış soy dağılımları ile hücre süspansiyonları oluşumunu kolaylaştırmak için akış sitometrisi ile her bir farklılaşma protokolünden lekeli hücrelerin hücre bileşimini analiz edin.
   NOT: Bu işlemi gerçekleştirirken, ECT'ler için kalan hücre süspansiyonu 4 °C'lik bir buzdolabında muhafaza edilir.

3. PDMS doku kalıbının imalatı

1. Prepolimer ve çapraz bağlama çözeltisini 10:1 oranında karıştırarak 0,5 mm kalınlığında ve 30 mm x 30 mm'nin üzerinde polidimethylsiloxane (PDMS) atın ve ardından 80 °C'de 3 saat boyunca tedavi edin.
2. PDMS levhayı kesin ve 7 mm uzunluğunda, 0,5 mm genişliğinde ve 2,5 mm yüksekliğinde dikdörtgen direklere sahip 21 mm x 20,5 mm dikdörtgen tepsiyi şaşırtıcı bir konumda imal etmek için silikon yapıştırıcı ile bağlayın. İki çizgi direk arasındaki yatay direk aralığı 2,5 mm 'dir (Şekil 2B).
3. Tepsiyi 120 °C'de 20 dk.'da otoklavlayın.
4. 1 saat pbs% 1 poloxamer 407 ile tepsi katlayın. Poloxamer 407'yi durula ve kullanmadan önce kalıbı PBS ile yeterince durula.

4. EKT inşaatı

1. Hücre soy analizinden sonra CM+EC ve MC protokollerinden hücreleri birleştirerek, toplam hücre sayısı nın toplam hücre sayısı olan 5'i oluşturan mC'lerin toplam konsantrasyonunun %10 ila %20'si kadar^dır.
2. EKT kültür ortamında karışık altı milyon hücreyi askıya alın (alfa minimum esansiyel orta %10 FBS, 50 μM 2-merkaptoetanol ve 100 U/mL Penisilin-Streptomisin ile desteklenmiştir).
3. Matris çözeltisinin hazırlanması
   1. 133 μL asit çözünen sıçan kuyruk kollajen tip I çözeltisi (2 mg/mL, pH 3) ile 17 μL 10x minimum esansiyel ortam (MEM) ile karıştırın. Daha sonra çözeltiyi 17 μL alkali tampon (0,2 M NaHCO_3,0,2 M HEPES ve 0,1 M NaOH) ile karıştırın.
      NOT: Kollajen buzda (4 °C) tutulmalıdır. Arabellek rengini kontrol edin ve tüm çözümler karıştırıldığında ortam pembemsi olmazsa, ortama ek alkali tampon ekleyin. Karıştırma adımları karışımı kollajen I + 10x MEM olmalı ve sonra alkali tampon ekleyin. Bu sırayı DEĞIŞTIRMEYIN. Karışımda kabarcıklar üretmeyin.
   2. Nötralize kollajen çözeltisine 67 μL'lik bazal membran matrisi ekleyin.
      NOT: Karışık çözelti buzda (4 °C) tutulmalıdır.
4. 5 dakika boyunca 1.100 rpm (240 x g)altı milyon hücre içeren hazırlanan hücre süspansiyonsantrifuge ve yüksek glikoz DMEM 167 μL ile hücreleri resuspend + 20% FBS + 1% penisilin-streptomisin (100x).
5. Hücre süspansiyonu ve matris çözeltisini karıştırın. Bir yapı için hücre/matris karışımının toplam hacmi 400 μL'dir.
   NOT: Bu adımda hücre/matris karışımı viskoz olmayan ve pembemsi bir renk olmalıdır. Jel oda sıcaklığında katılaşmak gibi buz üzerinde tutun. Kollajen tip I'in son konsantrasyonu 0.67 mg/mL'dir.
6. Altı kuyulu kültür plaka¹²yerleştirilir poloxamer 407 kaplı PDMS doku kalıbı üzerinde eşit olarak hücre / matris karışımı dökün.
   NOT: Dökülen jeldeki dolgu hatalarını önlemek için kabarcıkların oluşmasını önlemek için karışımı dikkatlice dökün.
7. Hücre/matris karışımını 60 dakika boyunca standart bir CO₂ kuluçka makinesinde (37C, %5 CO₂₎kuluçkaya yatırın.
8. Doku oluşturulduktan sonra doku kalıbını 4 mL EKT kültür ortamı ile ıslatın.
   NOT: Hücre/matris 60 dakikada çapraz bağlantı olmasına rağmen yapı hala çok kırılgandır. Zarar vermemek için hafifçe orta ekleyin.
9. Kültür 14 gün boyunca doku orta değişim ile her gün.
10. EKT implantasyonundan önce, sterilize ince pratisyen ler kullanarak EKT'yi yükleme direklerinden hafifçe çıkarın.
    NOT: Kalıptan çıkarıldıktan sonraki son EKT boyutları orijinal kalıptan daha azdır. 2,1 cm x 2,05 cm'lik bir kalıp, yaklaşık 1,5 cm x 1,5 cm'lik bir akt üretir. Daha büyük bir 3.9 cm x 4.05 cm kalıp yaklaşık 3 cm x 3 cm ekt oluşturur. Boşaltılmış EKT sıcak kültür ortamda içsel spontan dayak gösterir. Başlangıçta bir kafes yapısına sahiptir, ancak boş bir EKT zaman içinde küçülür ve yoğunlaşır. Dokuyu ince prömiyerlerle yumuşak bir şekilde tutmak ve epikardiyuma EKT eklemek için 7-0 ipek sütür kullanmak mümkündür.

Sonuçlar

Şekil 1A,B CM+EC ve MC protokolüşemalarını gösterir. CM+EC protokolünden cm ve EC'ler ve MC protokolünden MC'ler indüklendikten sonra, hücreler toplam hücrelerin %10-20'sini temsil edecek şekilde son MC konsantrasyonlarını ayarlayarak karıştırılır. 2 cm genişliğindeki doku kalıbı, 0,5 mm kalınlığındaki PDMS levhadan(Şekil 2A,B)tasarım çizimine göre imal edilmiştir. Cm + EC + MC hücrelerinin altı...

Tartışmalar

Doğrusal bir format, hiPSC türetilmiş EKT⁵araştırmamızın tamamlanmasından sonra, eBT'ler içinde vasküler hücrelerin in vitro genişlemesini kolaylaştırmak ve ait etkenler ile alıcı miyokardyum arasında in vivo vasküler kaplini kolaylaştırmak için hiPSC kaynaklı CM'ler, EK'lar ve MC'leri karıştırmak için protokolü uyarladık.

Daha büyük, implante edilebilir örgü ECT geometrilerinin oluşumunu kolaylaştırmak için, 3B kalıpları şaşırt?...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
Cell Culture Dishes 100x20 mm style	Falcon/ Thomas scientific	9380C51
Multiwell Plates For Cell Culture 6well 50/CS	Falcon / Thomas scientific	6902A01
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Dow Corning	761036
Reagents
Accumax	Innovative Cell Technologies	AM-105
BMP4, recombinant (10µg)	R&D	RSD-314-BP-010
Collagen, Type I solution from rat tail	Sigma	C3867
Growth factor-reduced Matrigel	Corning	356231
Human VEGF (165) IS, premium grade	Miltenyi	130-109-385
Pluronic F-127, 0.2 µm filtered (10% Solution in Water)	Molecular Probes	P-6866
Recombinant human bFGF	WAKO	060-04543
Recombinant Human/Mouse/Rat ActivinA (50µg)	R&D	338-AC-050
rh Wnt-3a (10µg)	R&D	5036-WN
Versene solution	Gibco	15040066
Culture medium and supplements
10x MEM	Invitrogen	11430
2 Mercaptro Ethanol	SIGMA	M6250
B27 supplement minus insulin	Gibco	A1895601
DMEM, high glucose	Gibco	11965084
Fetal Bovine Serum (500ml)	Any
Fetal Bovine Serum (500ml)	Any
L-Glutamine	Gibco	25030081
NaHCO3	Any
PBS 1x	Gibco	10010-031
Penicillin-Streptomycin (5000 U/mL)	Gibco	15070-063
RPMI1640 medium	Gibco	21870092
αMEM	Invitrogen	11900024
Flowcytometry
anti-TRA-1-60, FITC, Clone: TRA-1-60, BD Biosciences	BD / Fisher	560380
anti-Troponin T, Cardiac Isoform Ab-1, Clone: 13-11, Thermo Scientific Lab Vision	Fisher	MS-295-P0
BD FACS Clean Solution	BD	340345
BD FACSFlow Sheath Fluid	BD	342003
BD FACSRinse Solution	BD	340346
EDTA	Any
Falcon Tube with Cell Strainer Cap (Case of 500)	Corning	352235
Fetal Bovine Serum (500ml)	Any
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation	Molecular Probes	L34957
PDGFRb; anti-CD140b, R-PE, Clone: 28D4, BD Biosciences	BD / Fisher	558821
Saponin	Sigma-Aldrich	47306-50G-F
VEcad-FITC; anti-CD144, FITC, Clone: 55-7H1, BD Biosciences	BD / Fisher	560411
Zenon Alexa Fluor 488 Mouse IgG1 Labeling Kit	Molecular Probes	Z25002