Preparazione di tessuti cardiaci ingegnerizzati a forma di mesh derivati da cellule iPS umane per la riparazione miocardia in Vivo

Riepilogo

L'attuale protocollo genera tessuti cardiaci ingegnerizzati a forma di maglia contenenti cellule cardiovascolari derivate da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo per consentire lo studio della terapia dell'impianto cellulare per le malattie cardiache.

Abstract

L'attuale protocollo descrive i metodi per generare tessuti cardiaci ingegnerizzati scalabili a forma di mesh (ET) composti da cellule cardiovascolari derivate da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (hiPSC), che vengono sviluppate verso l'obiettivo dell'uso clinico. I cardiomiociti derivati dall'HiPSC, le cellule endoteliali e le cellule murali vascolari vengono mescolati con la matrice gel e poi versati in uno stampo di tessuto polidimetlsiloxane (PDMS) con post interni rettangolari sfalsati. Entro il giorno della coltura 14 ET maturano in una struttura a maglia di 1,5 cm x 1,5 cm con fasci di miofibera di 0,5 mm di diametro. I cardiomiociti si allineano all'asse lungo di ogni fascio e battono spontaneamente in modo sincrono. Questo approccio può essere scalato fino a una mesh più grande (3,0 cm x 3,0 cm) ECT, preservando la maturazione e la funzione del costrutto. Pertanto, le ECT a forma di mesh generate da cellule cardiache derivate da hiPSC possono essere fattibili per i paradigmi di rigenerazione cardiaca.

Introduzione

Numerosi studi preclinici e studi clinici hanno confermato l'efficienza delle terapie cardiogenerative a base cellulare per i cuori^{che hanno mancato di cuore 1,2,3}. Tra i vari tipi di cellule, le cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (hiPSC) sono promettenti fonti cellulari in virtù della loro capacità prolifertiva, potenziale per generare varie linee cardiovascolari^4,5e allogenicità. Inoltre, le tecnologie di ingegneria tissu/tessuto hanno reso possibile il trasferimento di milioni di cellule su un cuore^{danneggiato 5,6,7,8}.

In precedenza, abbiamo segnalato la generazione di tessuti cardiaci lineari (ECT) tridimensionali (3D) da linee cardiovascolari derivate da hiPSC utilizzando un sistema di coltura disponibile in modo commerciale per i tessuti bioartifici^{3D 5,7}. Abbiamo scoperto che la coesistenza di cellule endoteliali vascolari e cellule murali con cardiomiociti all'interno dell'ECT ha facilitato la maturazione strutturale ed elettrofisiologica dei tessuti. Inoltre, abbiamo convalidato il potenziale terapeutico dell'hiPSC-ECT impiantato in un modello di infarto miocardico tollerante all'immunita' per migliorare la funzione cardiaca, rigenerare il miocardio e migliorare l'angiogenesi^5. Tuttavia, le ECT lineari costruite con questo metodo erano cilindri da 1 mm per 10 mm e quindi non adatti per l'impianto in studi preclinici con animali più grandi o uso clinico.

Sulla base dell'uso riuscito di stampi tisssidali per generare formazione di tessuto ingegnerizzato poroso utilizzando myoblast scheletrici e cardiomiociti^{scheletrici 9}, cardiomiociti umani derivati da ESC¹⁰ e iPSC del topo¹¹, abbiamo sviluppato un protocollo per generare tessuti impiantabili più grandi derivati da hiPSC scalabili utilizzando stampi polidimetillsiloxane (PDMS). Abbiamo valutato una gamma di geometrie di stampo per determinare le caratteristiche di stampo più efficaci. Le ET a forma di mesh con più fasci e giunzioni hanno mostrato eccellenti caratteristiche nella vitalità cellulare, nella funzione dei tessuti e nella scalabilità rispetto ai formati semplici o lineari privi di pori o giunzioni. Abbiamo impiantato l'ECT a forma di maglia in un modello di infarto miocardico e abbiamo confermato i suoi effetti terapeutici simili agli ECT cilindrici^{impiantati 12}. Qui descriviamo il protocollo per generare un ECT a forma di mesh derivato da hiPSC.

Protocollo

1. Manutenzione di hiPSC e differenziazione cardiovascolare

1. Espandere e mantenere iPSC sulla matrice di membrana seminterrato thin-coat (fattore di crescita ridotto, diluizione 1:60) in mezzo condizionato estratto da fibroblasti embrionali di topo (MEF-CM) con fattore di crescita fibroblasta di base umano (hbFGF)⁴.
   NOTA: Abbiamo usato una linea hiPSCs (4 fattori (oct3/4, Sox2, Klf4 e c-Myc): 201B6). Aggiungere hbFGF alla concentrazione appropriata per ogni linea cellulare. Il frammento laminin-511 può essere utilizzato anche per il rivestimento del piatto di coltura al posto della matrice della membrana seminterrato. Il mezzo disponibile in mercato progettato per la coltura senza alimentatori di hiPSC può essere utilizzato come sostituto di MEF-CM.
2. Utilizzare la soluzione Versene (0,48 mM di acido etilenediaminetetraacetico (EDTA) per staccare e dissociare le cellule quando la confluenza cellulare raggiunge il 90-u2012100%.
   NOTA: Possono essere utilizzati anche altri prodotti disponibili in mercato per la dissociazione cellulare.
3. Celle di piastra ad una densità di 10.000 cellule/mm² su piastre di coltura cellulari rivestite a matrice in MEF-CM con hbFGF e coltura per due o tre giorni.
4. Quando la coltura diventa completamente confluente, coprire le cellule con matrice (1:60 diluizione con MEF-CM) per un giorno.
5. Sostituire il MEF-CM con il supporto RPMI 1640 - B27. Aggiungere 100 ng/mL di Activin A e 100 ng/mL di Wnt3A al mezzo per un giorno.
   NOTA: questo è il giorno 0 di differenziazione. Per upregolare la segnalazione canonica Wnt, GSK3β inibitori possono essere utilizzati anche al posto di Wnt3A.
6. Il giorno 1 di differenziazione, cambiare il mezzo al nuovo RPMI 1640 - B27 con 10 ng/mL di BMP4 e 10 ng/mL di hbFGF. Celle di coltura per due (protocollo MC) o quattro giorni (protocollo CM-EC) senza variazione media⁵.
   NOTA: il protocollo CM-EC è ottimizzato per indurre simultaneamente cardiomiociti (CM) e cellule endoteliali vascolari (EC). Il protocollo MC è ottimizzato per indurre preferibilmente celle murali vascolari (MC).
7. Protocollo CM-EC per l'induzione di CMs e ECs (Figura 1A).
   1. Sostituire il mezzo il giorno 5 di differenziazione con RPMI 1640 - B27 integrato con 50 ng/mL di VEGF₁₆₅.
   2. Cambiare il mezzo di coltura ogni 48 h fino al giorno 13-u201215 di differenziazione.
8. Protocollo MC per l'induzione di celle murali vascolari (Figura 1B)
   1. Sostituire il mezzo con RPMI1640 - 10% siero bovino fetale (FBS) al giorno 3 di differenziazione.
   2. Cambiare il mezzo di coltura ogni 48 h fino al giorno 13-u201215 di differenziazione.

2. Analisi del raccolto cellulare e del lignaggio nel giorno di differenziazione 13-u201215

1. Lavare le cellule con ca^{2 e} Mg^{2 snodie} a cuscinetto di fosfati liberi (PBS).
2. Aggiungere la soluzione di dissociazione cellulare (contenente proteasi, collagene e DNAses) nel piatto di coltura cellulare per coprire la piastra. Incubare la piastra per 5 minuti a 37 gradi centigradi.
3. Raccogliere e dissociare le cellule con mezzo di coltura utilizzando una pipetta dopo l'incubazione.
4. Allocare 1 x 10^{6 celle per} l'analisi della derivazione con citometria di flusso. Per eliminare le cellule morte, macchiare le cellule con colorante di vitalità fissabile.
5. Macchiare le cellule con marcatori di superficie della membrana in PBS con 5% FBS. Utilizzare le seguenti diluizioni di anticorpi nel buffer di colorazione a fluorescenza attivata (FACS): anti-PDGFRβ (1:100), cadherin anti-VE (1:100), anti-TRA-1-60 (1:20).
6. Per le proteine intracellulari, riesospette e fissa le cellule con 4% di paraformaldeide (PFA) in PBS.
7. Macchiare le cellule con isoforme anti-cardiaci di Troponin T (cTnT) in PBS con 5% FBS e 0,75% Saponin, quindi etichettare l'anticorpo cTnT con 488 topO IgG1 (diluizione 1:50).
8. Rispendere le cellule macchiate in PBS con il 5% di FBS e metterle in tubi FACS con deformatore cellulare.
9. Analizzare la composizione cellulare delle cellule macchiate da ogni protocollo di differenziazione con citometria di flusso per facilitare la generazione di sospensioni cellulari con distribuzioni di lignaggio definite.
   NOTA: Durante l'esecuzione di questa procedura, la sospensione delle celle rimanenti per le ET viene conservata in un frigorifero a 4 gradi centigradi.

3. Fabbricazione di stampo tissu tessuto PDMS

1. Lanciare uno strato di polidimetiloxane (PDMS) di 0,5 mm e di oltre 30 mm x 30 mm mescolando la soluzione prepolimera e cross-linking a un rapporto di 10:1 e quindi curare a 80 gradi centigradi per 3 h.
2. Tagliare il foglio PDMS e legarlo con adesivo in silicone per fabbricare un vassoio rettangolare da 21 mm x 20,5 mm con 7 mm di lunghezza, 0,5 mm di larghezza e 2,5 mm di altezza di pali rettangolari in posizione sfalsata. La spaziatura orizzontale tra due file di pali è di 2,5 mm (Figura 2B).
3. Autoclave il vassoio a 120 gradi centigradi per 20 min.
4. Rivestire il vassoio con 1% poloxamer 407 in PBS per 1 h. Sciacquare la poloxamer 407 e sciacquare lo stampo con PBS sufficientemente prima dell'uso.

4. Costruzione di ECT

1. Dopo l'analisi del lignaggio cellulare, combinare le cellule dei protocolli CM-EC e MC in modo che la concentrazione finale di MC sia dal 10 al 20% in un numero totale di cellule di sei milioni di celle per^{costrutto 5}.
2. Sospendere sei milioni di cellule miste nel mezzo di coltura ECT (mezzo essenziale minimo alfa integrato con il 10% di FBS, 50 M 2-mercaptoethanol e 100 U/mL Penicillina-Streptomycin).
3. Preparazione della soluzione a matrice
   1. Mescolare 133 L della soluzione di collagene di tipo I della coda di ratto solubile acida (2 mg/mL, pH 3) con 17 L di 10x mezzo essenziale minimo (MEM). Quindi mescolare la soluzione con 17 L di buffer alcali (0,2 M NaHCO₃, 0,2 M HEPES e 0,1 M NaOH).
      NOTA: Il collagene deve essere conservato sul ghiaccio (4 gradi centigradi). Controllare il colore del buffer e se il mezzo non diventa rosato quando tutte le soluzioni sono miste, aggiungere ulteriore buffer alcali al supporto. I passaggi di miscelazione devono essere mescolare collagene I - 10x MEM, e quindi aggiungere buffer alcali. NON modificare questo ordine. NON generare bolle nel mix.
   2. Aggiungere 67 L di matrice di membrana del seminterrato alla soluzione di collagene neutralizzato.
      NOTA: La soluzione mista deve essere tenuta su ghiaccio (4 gradi centigradi).
4. Centrifugare la sospensione cellulare preparata contenente sei milioni di cellule a 1.100 rpm(240 x g ) per 5 min e rispendere le cellule con 167 L di DMEM ad alto glucosio - 20% FBS - 1% penicillina-streptomicina (100x).
5. Mescolare la sospensione delle celle e la soluzione a matrice. Il volume totale della miscela di cellule/matrici per un costrutto è di 400 L.
   NOTA: La miscela cellulare/matrice deve essere non viscosa e un colore rosato in questo passaggio. Tenerlo sul ghiaccio come il gel si solidifica a temperatura ambiente. La concentrazione finale di collagene di tipo I è 0,67 mg/mL.
6. Versare la miscela cellulare/matrice uniformemente sopra lo stampo di tessuto PDMS rivestito poloxamer 407, che viene posto in una piastra di coltura a^{sei possiedi 12}.
   NOTA: Versare la miscela con attenzione per evitare di generare bolle al fine di evitare difetti di riempimento nel gel versato.
7. Incubare la miscela cellulare/matrice in un incubatore standard di CO₂ (37C, 5 % CO₂) per 60 min.
8. Dopo che il tessuto si è formato, immergere lo stampo del tessuto con 4 mL di mezzo di coltura ECT.
   NOTA: Anche se la cella/matrice è interconnessa in 60 min, il costrutto è ancora molto fragile. Aggiungere il mezzo delicatamente per evitare di danneggiarlo.
9. Coltura il tessuto per 14 giorni con cambiamento medio ogni giorno.
10. Prima dell'impianto ECT, rimuovere delicatamente l'ECT dai pali di carico utilizzando le forcelli sottili sterilizzati.
    NOTA: le quote ECT finali dopo la rimozione dallo stampo sono inferiori allo stampo originale. Uno stampo di 2,1 cm x 2,05 cm genera un ECT rilasciato di circa 1,5 cm x 1,5 cm. Uno stampo più grande di 3,9 cm x 4,05 cm genera un ECT di circa 3 cm x 3 cm. L'ECT scaricato mostra un battito spontaneo intrinseco nel mezzo di coltura calda. Anche se inizialmente mantiene una struttura mesh, un ECT scaricato si riduce e si condensa nel tempo. È possibile tenere il tessuto con le forcelle fini e quindi utilizzare la sutura di seta 7-0 per attaccare l'ECT all'epicardio.

Risultati

Figura 1A,B mostra gli schemi del protocollo CM-EC e MC. Dopo aver indotto cMs e ECs dal protocollo CM-EC e MCs dal protocollo MC, le cellule sono mescolate regolando le concentrazioni mc finali per rappresentare il 10-20% delle cellule totali. Lo stampo vessu su tessuto largo 2 cm viene fabbricato secondo il disegno di progettazione da un foglio PDMS di 0,5 mm di spessore(Figura 2A,B). Sei milioni di cellule CM-EC-MC sono combi...

Discussione

Dopo il completamento della nostra indagine su un formato lineare, derivato da hiPSC ECT⁵, abbiamo adattato il protocollo per mescolare CIC, EC e MC derivati da hiPSC per facilitare l'espansione in vitro delle cellule vascolari all'interno delle ECT e il successivo accoppiamento vascolare in vivo tra ECT e miocardio ricevente.

Per facilitare la generazione di geometrie ECT mesh più grandi e impiantabili abbiamo usato sottili fogli PDMS per progettare gli stampi 3D con ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
Cell Culture Dishes 100x20 mm style	Falcon/ Thomas scientific	9380C51
Multiwell Plates For Cell Culture 6well 50/CS	Falcon / Thomas scientific	6902A01
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Dow Corning	761036
Reagents
Accumax	Innovative Cell Technologies	AM-105
BMP4, recombinant (10µg)	R&D	RSD-314-BP-010
Collagen, Type I solution from rat tail	Sigma	C3867
Growth factor-reduced Matrigel	Corning	356231
Human VEGF (165) IS, premium grade	Miltenyi	130-109-385
Pluronic F-127, 0.2 µm filtered (10% Solution in Water)	Molecular Probes	P-6866
Recombinant human bFGF	WAKO	060-04543
Recombinant Human/Mouse/Rat ActivinA (50µg)	R&D	338-AC-050
rh Wnt-3a (10µg)	R&D	5036-WN
Versene solution	Gibco	15040066
Culture medium and supplements
10x MEM	Invitrogen	11430
2 Mercaptro Ethanol	SIGMA	M6250
B27 supplement minus insulin	Gibco	A1895601
DMEM, high glucose	Gibco	11965084
Fetal Bovine Serum (500ml)	Any
Fetal Bovine Serum (500ml)	Any
L-Glutamine	Gibco	25030081
NaHCO3	Any
PBS 1x	Gibco	10010-031
Penicillin-Streptomycin (5000 U/mL)	Gibco	15070-063
RPMI1640 medium	Gibco	21870092
αMEM	Invitrogen	11900024
Flowcytometry
anti-TRA-1-60, FITC, Clone: TRA-1-60, BD Biosciences	BD / Fisher	560380
anti-Troponin T, Cardiac Isoform Ab-1, Clone: 13-11, Thermo Scientific Lab Vision	Fisher	MS-295-P0
BD FACS Clean Solution	BD	340345
BD FACSFlow Sheath Fluid	BD	342003
BD FACSRinse Solution	BD	340346
EDTA	Any
Falcon Tube with Cell Strainer Cap (Case of 500)	Corning	352235
Fetal Bovine Serum (500ml)	Any
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation	Molecular Probes	L34957
PDGFRb; anti-CD140b, R-PE, Clone: 28D4, BD Biosciences	BD / Fisher	558821
Saponin	Sigma-Aldrich	47306-50G-F
VEcad-FITC; anti-CD144, FITC, Clone: 55-7H1, BD Biosciences	BD / Fisher	560411
Zenon Alexa Fluor 488 Mouse IgG1 Labeling Kit	Molecular Probes	Z25002