생체 내 심근 수리를 위한 인간 iPS 세포에서 파생된 메쉬 모양의 조작된 심장 조직의 준비

요약

본 프로토콜은 인간 유도만능 줄기 세포에서 유래한 심혈관 세포를 포함하는 메쉬 모양의 엔지니어링 된 심장 조직을 생성하여 심장 질환에 대한 세포 이식 요법의 조사를 허용합니다.

초록

현재 프로토콜은 임상 사용의 목표를 향해 개발되는 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSCs)에서 파생 된 심혈관 세포로 구성된 확장 가능한 메쉬 모양의 엔지니어링 심장 조직 (ECT)을 생성하는 방법을 설명합니다. HiPSC 유래 심근세포, 내피 세포 및 혈관 벽화 세포는 젤 매트릭스와 혼합한 다음 직사각형 내부 비틀거림 기둥을 가진 폴리디메틸실록산(PDMS) 조직 금형에 부어 넣습니다. 문화의 날14 ECT는 직경 0.5mm의 myofiber 번들로 1.5cm x 1.5cm 메쉬 구조로 성숙합니다. 심근세포는 각 번들의 긴 축에 정렬되어 동기적으로 자발적으로 이길 수 있습니다. 이 방법은 구조 성숙과 기능을 유지하면서 더 큰 (3.0cm x 3.0cm) 메쉬 ECT까지 확장 할 수 있습니다. 따라서, hiPSC 유래 심장 세포로부터 생성된 메쉬 형 ECT는 심장 재생 패러다임에 대해 가능할 수 있다.

서문

수많은 전임상 연구및 임상시험은^{심장1, 2,23에}실패한 세포 기반 심장 재생 요법의^{효율을 확인했습니다.} 다양한 세포 유형 중, 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSCs)는 그들의 증식 능력, 다양한 심장 혈관^계보4,5및 동종성을 생성 할 수있는 잠재력에 의해 유망한 세포 소스입니다. 또한, 조직 공학 기술은 손상된 심장^,,5,6,7,8에수백만 개의 세포를 옮길 수 있게 하였다.⁷

이전에는 3D 생체 인공 조직에 대한 시판 가능한 배양 시스템을 사용하여 hiPSC 유래 심장 혈관 혈통으로부터 3차원(3D) 선형 엔지니어링 심장 조직(ECT)의^생성을보고하였다^5,7. 우리는 ECT 내심근세포와 벽화 세포의 공존이 구조적 및 전기생리조직 성숙을 촉진한다는 것을 발견했습니다. 더욱이, 우리는 심장 기능을 향상시키고, 심근을 재생하며, 혈관신생을 향상시키기 위하여 면역내성 쥐 심근 경색 모형에 이식된 hiPSC-ECTs의 치료 잠재력을 검증했습니다^5. 그러나, 이 방법에 의해 생성된 선형 ECT는 1mm by 10mm 실린더였고, 따라서 더 큰 동물 또는 임상적 사용을 가진 전임상 연구에서 이식에 적합하지 않았다.

쥐 골격 근막세포와 심근세포^9,인간 ESC 유래 심근세포¹⁰ 및 마우스 iPSCs^11을사용하여 다공성 엔지니어링 조직 형성을 생성하는 조직 금형의 성공적인 사용에 기초하여, 폴리디메틸실록산(PDMS)을 사용하여 확장 가능한 hiPSC 유래 더 큰 이식형 조직을 생성하는 프로토콜을 개발했습니다. 우리는 가장 효과적인 금형 특성을 결정하기 위해 금형 형상의 범위를 평가했다. 여러 번들 및 접합을 갖춘 메쉬 모양의 ECT는 모공이나 접합이 부족한 일반 시트 또는 선형 형식에 비해 세포 생존가능성, 조직 기능 및 확장성면에서 뛰어난 특성을 보였습니다. 우리는 쥐 심근 경색 모델에 메쉬 모양의 ECT를 이식하고 이식 된 원통형 ETs^12와유사한 치료 효과를 확인하였다. 여기서는 hiPSC 유래 메시 모양ECT를 생성하는 프로토콜을 설명합니다.

프로토콜

1. hiPSC 및 심혈관 차별화의 유지 보수

1. 인간 기본 섬유아세포 성장인자(hbFGF)를 가진 마우스 배아 섬유아세포(MEF-CM)로부터 추출한 조건부 배지에서 얇은 코트 지하 막 매트릭스(성장인자 감소, 1:60^희석)에대한 hiPSCs를 확장 및 유지한다.
   참고: hiPSC(4-계수(10월 4일, 삭스2, Klf4 및 c-Myc) 라인: 201B6)를 사용했습니다. 각 세포주에 대한 적절한 농도에서 hbFGF를 추가합니다. 라미닌-511 단편은 지하 막 매트릭스 대신 배양 접시의 코팅에도 사용될 수 있다. hiPSC의 피더 프리 문화를 위해 설계된 상용 배지는 MEF-CM의 대체품으로 사용할 수 있습니다.
2. 세포 결합이 90\u2012100%에 도달하면 Versene(0.48 mM 에틸렌디아민트라아세트산(EDTA) 용액을 사용하여 세포를 분리하고 분리한다.
   참고: 세포 해리를 위해 시판되는 다른 제품도 사용할 수 있습니다.
3. 2~3일 동안 HBFGF를 가진 MEF-CM에서 매트릭스 코팅 세포 배양 판에 10,000세포/mm^2의 밀도로 플레이트 세포.
4. 배양이 완전히 수렴되면 하루 동안 매트릭스 (MEF-CM로 1:60 희석)로 세포를 덮습니다.
5. MEF-CM을 RPMI 1640 + B27 배지로 교체합니다. 액티빈 A의 100 ng/mL과 Wnt3A의 100 ng/mL을 하루 동안 매체에 추가합니다.
   참고: 이 날은 차별화의 0일입니다. 표준 Wnt 시그널링을 업규제하기 위해 GSK3β 억제제는 Wnt3A 대신에도 사용할 수 있습니다.
6. 차별화 의 첫날에, 새로운 RPMI 1640 + B27에 매체를 변경 10 BMP4의 10 ng / mL 및 hbFGF의 10 ng / mL. 배지 변화 없이 2일(MC 프로토콜) 또는 4일(CM+EC 프로토콜) 일 동안 배양 셀^5.
   참고: CM+EC 프로토콜은 심근세포(CM) 및 혈관 내피 세포(EC)를 동시에 유도하도록 최적화되어 있습니다. MC 프로토콜은 혈관 벽화 세포(MC)를 우선 유도하도록 최적화되어 있습니다.
7. CM+EC 프로토콜은 CM 및 EC(도1A)의유도를 위한 것입니다.
   1. 5일째에 비화를 RPMI 1640 + B27로 교체하여 VEGF_165의50 ng/mL로 보충한다.
   2. 분화의 13\u201215일까지 48시간마다 배양 배지를 변경합니다.
8. 혈관 벽화 세포의 유도를 위한 MC 프로토콜(도 1B)
   1. 발화3일째에 RPMI1640 + 10% 태아소 혈청(FBS)으로 배지를 교체하십시오.
   2. 분화의 13\u201215일까지 48시간마다 배양 배지를 변경합니다.

2. 분화일에 대한 세포 수확 및 계보 분석 13\u201215

1. Ca²⁺ 및 Mg²⁺ 무료 인산염 완충식식염(PBS)으로 셀을 세척합니다.
2. 세포 배양 접시에 세포 해리 용액(프로테아제, 콜라게나아제 및 DNAses 포함)을 첨가하여 플레이트를 덮습니다. 플레이트를 37°C에서 5분 동안 배양합니다.
3. 배양 후 파이펫을 사용하여 배양 배지로 세포를 수집하고 분리합니다.
4. 유동 세포측정을 사용하여 계보 분석을 위해 1 x 10⁶ 셀을 할당합니다. 죽은 세포를 제거하기 위해, 고칠 수있는 생존 성 염료로 세포를 얼룩.
5. 5% FBS를 가진 PBS에 있는 막 표면 마커를 가진 세포를 얼룩. 형광 활성 세포 선별 (FACS) 염색 완충제에서 항체의 다음 희석을 사용하십시오: 안티 PDGFRβ (1:100), 안티-VE 카데린 (1:100), 항 TRA-1-60 (1:20).
6. 세포 내 단백질의 경우 PBS에서 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)로 세포를 다시 중단하고 수정하십시오.
7. PBS에서 트로포닌 T(cTnT)의 항심장 이소형을 가진 세포를 5% FBS와 0.75% 사포닌으로 염색한 다음 cTnT 항체에 488마우스 IgG1(희석 1:50)으로 라벨을 붙입니다.
8. 5% FBS로 PBS에 있는 스테인드 세포를 다시 중단하고 세포 여과기를 가진 FACS 관에 두십시오.
9. 유동 세포측정을 사용하여 각 분화 프로토콜에서 스테인드 셀의 세포 조성을 분석하여 정의된 계보 분포를 사용하여 세포 현탁액의 생성을 용이하게 한다.
   참고: 이 절차를 수행하는 동안 ECT의 나머지 셀 서스펜션은 4°C 냉장고에 보존됩니다.

3. PDMS 조직 금형의 제조

1. 0.5mm 두께와 30mm 이상의 폴리디메틸실록산(PDMS) 층을 10:1의 비율로 혼합한 다음 80°C에서 3시간 동안 치료한다.
2. PDMS 시트를 자르고 실리콘 접착제로 결합하여 길이 7mm, 너비 0.5mm, 2.5mm 높이의 직사각형 기둥을 비틀거리는 자세로 21mm x 20.5mm 직사각형 트레이를 제작합니다. 두 줄 사이의 수평 포스트 간격은 2.5mm(그림 2B)입니다.
3. 트레이를 120°C에서 20분 동안 자동 클로 브려냅니다.
4. 1% 폴로사머 407로 트레이를 PBS에 1시간 동안 코팅합니다. 폴로사머(407)를 헹구고 사용하기 전에 PBS로 금형을 헹구십시오.

4. ECT 건설

1. 세포 계보 분석 후, CM+EC 및 MC 프로토콜으로부터 세포를 결합하여 MC의 최종 농도가 구성당 600만 개의 세포 수에서 10~20%가 되도록^5.
2. ECT 배양 배지에 혼합 된 6 백만 개의 세포 (10 % FBS, 50 μM 2-mercaptoethanol 및 100 U / mL 페니실린 - 스트렙토 마이신으로 보충 알파 최소 필수 매체)에 혼합 6 백만 세포를 중단합니다.
3. 매트릭스 솔루션 의 준비
   1. 133 μL의 산 수용성 쥐 꼬리 콜라겐 타입 I 용액(2 mg/mL, pH 3)을 10배 최소 필수 배지(MEM)의 17μL과 혼합한다. 그런 다음 용액을 알칼리 버퍼17 μL(0.2M NaHCO_3,0.2M HEPES 및 0.1 M NaOH)과 혼합합니다.
      참고: 콜라겐은 얼음(4°C)에 보관해야 합니다. 버퍼 색상을 확인하고 모든 솔루션이 혼합될 때 매체가 분홍빛이 도하지 않는 경우 매체에 알칼리 버퍼를 추가합니다. 혼합 단계는 콜라겐 I + 10x MEM을 혼합한 다음 알칼리 버퍼를 추가해야 합니다. 이 순서를 변경하지 마십시오. 혼합에 거품을 생성하지 마십시오.
   2. 중화 콜라겐 용액에 지하 멤브레인 매트릭스 67 μL을 추가합니다.
      참고: 혼합 용액은 얼음(4°C)에 보관해야 합니다.
4. 원심분리기는 1,100rpm(240 x g)에서600만 개의 세포를 함유한 준비된 세포 현탁액을 5분 동안 및 고혈당 DMEM + 20% FBS + 1% 페니실린-스트렙토마이신(100x)의 167μL로 세포를 재연한다.
5. 셀 서스펜션과 매트릭스 용액을 혼합합니다. 하나의 구조에 대한 셀/매트릭스 혼합물의 총 부피는 400 μL입니다.
   참고: 셀/매트릭스 혼합물은 점성이 없으며 이 단계에서 분홍빛이 도는 색상이어야 합니다. 젤이 실온에서 고화되기 때문에 얼음 위에 보관하십시오. 콜라겐 타입I의 최종 농도는 0.67 mg/mL입니다.
6. 6웰^{배양판(12)에}배치되는 폴로사머 407 코팅 PDMS 조직 몰드 위에 셀/매트릭스 혼합물을 고르게 붓는다.
   참고: 부어진 젤의 충진 결함을 방지하기 위해 거품이 발생하지 않도록 혼합물을 조심스럽게 붓습니다.
7. 표준 CO₂ 인큐베이터(37C, 5%_CO2)에서세포/매트릭스 혼합물을 60분 동안 배양한다.
8. 조직이 형성된 후, ECT 배양 배지의 4mL로 조직 몰드를 담급니다.
   참고: 셀/매트릭스가 60분 만에 교차 연결되지만 구조는 여전히 매우 취약합니다. 중간을 부드럽게 추가하여 손상되지 않도록 합니다.
9. 매일 중간 변화와 14 일 동안 조직을 배양.
10. ECT 이식 전에 살균된 미세 포셉을 사용하여 로딩 포스트에서 ECT를 부드럽게 제거합니다.
    참고: 금형에서 제거한 후 최종 ECT 치수는 원래 금형보다 작습니다. 2.1cm x 2.05 cm 금형은 약 1.5cm x 1.5cm의 방출된 ECT를 생성합니다. 3.9cm x 4.05cm 의 더 큰 금형은 약 3cm x 3cm의 ECT를 생성합니다. 언로드 된 ECT는 따뜻한 문화 매체에서 본질적인 자발적인 구타를 보여줍니다. 처음에는 메시 구조를 유지하지만 로드되지 않은 ECT는 시간이 지남에 따라 수축되고 응축됩니다. 미세한 집게로 조직을 부드럽게 고정한 다음 7-0 실크 봉합사를 사용하여 ECT를 에피카르듐에 부착할 수 있습니다.

결과

그림 1A, B는 CM+EC 및 MC 프로토콜의 회로도를 나타낸다. MC 프로토콜에서 CM+EC 프로토콜 및 MC로부터 C와 IC를 유도한 후, 세포는 최종 MC 농도를 혼합하여 전체 셀의 10~20%를 나타냅니다. 2cm 폭의 티슈 몰드는 0.5mm 두께의 PDMS시트(도 2A,B)에서도면을 그리는 설계에 따라 제작된다. 600만 개의 CM+EC+MC 세포가 콜라겐 I와 결합되고, 매트릭?...

토론

선형 형식의 조사를 마친 후 hiPSC 파생 ECT^5는ET 내 혈관 세포의 체외 확장을 용이하게 하고 ECT와 수령인 심근 사이 생체 혈관 커플링을 용이하게 하기 위해 hiPSC 유래 C, EC 및 MC를 혼합하는 프로토콜을 조정했습니다.

더 크고 이식형 메쉬 ECT 형상의 생성을 용이하게 하기 위해 얇은 PDMS 시트를 사용하여 엇갈린 위치에 배치된 로딩 포스트로 3D 금형을 설계했습니...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
Cell Culture Dishes 100x20 mm style	Falcon/ Thomas scientific	9380C51
Multiwell Plates For Cell Culture 6well 50/CS	Falcon / Thomas scientific	6902A01
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Dow Corning	761036
Reagents
Accumax	Innovative Cell Technologies	AM-105
BMP4, recombinant (10µg)	R&D	RSD-314-BP-010
Collagen, Type I solution from rat tail	Sigma	C3867
Growth factor-reduced Matrigel	Corning	356231
Human VEGF (165) IS, premium grade	Miltenyi	130-109-385
Pluronic F-127, 0.2 µm filtered (10% Solution in Water)	Molecular Probes	P-6866
Recombinant human bFGF	WAKO	060-04543
Recombinant Human/Mouse/Rat ActivinA (50µg)	R&D	338-AC-050
rh Wnt-3a (10µg)	R&D	5036-WN
Versene solution	Gibco	15040066
Culture medium and supplements
10x MEM	Invitrogen	11430
2 Mercaptro Ethanol	SIGMA	M6250
B27 supplement minus insulin	Gibco	A1895601
DMEM, high glucose	Gibco	11965084
Fetal Bovine Serum (500ml)	Any
Fetal Bovine Serum (500ml)	Any
L-Glutamine	Gibco	25030081
NaHCO3	Any
PBS 1x	Gibco	10010-031
Penicillin-Streptomycin (5000 U/mL)	Gibco	15070-063
RPMI1640 medium	Gibco	21870092
αMEM	Invitrogen	11900024
Flowcytometry
anti-TRA-1-60, FITC, Clone: TRA-1-60, BD Biosciences	BD / Fisher	560380
anti-Troponin T, Cardiac Isoform Ab-1, Clone: 13-11, Thermo Scientific Lab Vision	Fisher	MS-295-P0
BD FACS Clean Solution	BD	340345
BD FACSFlow Sheath Fluid	BD	342003
BD FACSRinse Solution	BD	340346
EDTA	Any
Falcon Tube with Cell Strainer Cap (Case of 500)	Corning	352235
Fetal Bovine Serum (500ml)	Any
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation	Molecular Probes	L34957
PDGFRb; anti-CD140b, R-PE, Clone: 28D4, BD Biosciences	BD / Fisher	558821
Saponin	Sigma-Aldrich	47306-50G-F
VEcad-FITC; anti-CD144, FITC, Clone: 55-7H1, BD Biosciences	BD / Fisher	560411
Zenon Alexa Fluor 488 Mouse IgG1 Labeling Kit	Molecular Probes	Z25002