Vorbereitung von Mesh-Shaped Engineered Cardiac Tissues derived from Human iPS Cells for In Vivo Myokard repair

Zusammenfassung

Das vorliegende Protokoll erzeugt netzförmige stämmige Herzgewebe, das kardiovaskuläre Zellen enthält, die aus humaninduzierten pluripotenten Stammzellen gewonnen wurden, um die Untersuchung der Zellimplantationstherapie für Herzkrankheiten zu ermöglichen.

Zusammenfassung

Das aktuelle Protokoll beschreibt Methoden zur Erzeugung skalierbarer, netzförmiger Herzgewebe (ECTs), die aus kardiovaskulären Zellen bestehen, die aus humaninduzierten pluripotenten Stammzellen (HiPSCs) gewonnen werden und auf das Ziel der klinischen Anwendung hin entwickelt werden. HiPSC-abgeleitete Kardiomyozyten, Endothelzellen und vaskuläre Wandzellen werden mit Gelmatrix vermischt und dann in eine Polydimethylsiloxan (PDMS) Gewebeform mit rechteckigen inneren versetzten Pfosten gegossen. Am Kulturtag reifen 14 ECTs zu einer 1,5 cm x 1,5 cm Maschenöffnung mit Myofiberbündeln mit 0,5 mm Durchmesser. Cardiomyozyten richten sich an der Langachse jedes Bündels aus und schlagen spontan synchron. Dieser Ansatz kann auf einen größeren (3,0 cm x 3,0 cm) Mesh-ECT skaliert werden, wobei die Konstruktreifung und -funktion erhalten bleibt. So können netzförmige ECTs, die aus hiPSC-abgeleiteten Herzzellen erzeugt werden, für Kardialregenerationsparadigmen möglich sein.

Einleitung

Zahlreiche präklinische Studien und klinische Studien haben die Effizienz zellbasierter herzregenerativer Therapien bei versagenden Herzen^1,2,3bestätigt. Unter verschiedenen Zelltypen sind humaninduzierte pluripotente Stammzellen (HiPSCs) vielversprechende Zellquellen aufgrund ihrer proliferativen Fähigkeit, des Potenzials, verschiedene kardiovaskuläre Linien^4,,5, und Allogenität zu erzeugen. Darüber hinaus haben Gewebe-Engineering-Technologien es möglich gemacht, Millionen von Zellen auf ein geschädigtes Herz zu übertragen^5,6,7,8.

Zuvor berichteten wir über die Erzeugung dreidimensionaler (3D) linearer Herzgewebe (ECTs) aus hiPSC-abgeleiteten kardiovaskulären Linien mit einem kommerziell erhältlichen Kultursystem für biokünstliche 3D-Gewebe^5,7. Wir fanden heraus, dass die Koexistenz von vaskulären Endothelzellen und Wandzellen mit Kardiomyozyten innerhalb des ECT die strukturelle und elektrophysiologische Gewebereifung erleichterte. Darüber hinaus haben wir das therapeutische Potenzial implantierter HiPSC-ECTs in einem immuntoleranten Myokardinfarktmodell der Ratte validiert, um die Herzfunktion zu verbessern, Myokard zu regenerieren und die Angiogenese zu verbessern⁵. Die nach diesem Verfahren konstruierten linearen ECTs waren jedoch 1 mm x 10 mm Zylinder und daher nicht für die Implantation in präklinischen Studien mit größeren Tieren oder der klinischen Anwendung geeignet.

Basierend auf der erfolgreichen Verwendung von Gewebeformen zur Erzeugung poröser, konstruierter Gewebebildung mit Ratenskelettmyoblasten und Kardiomyozyten⁹, humanen ESC-abgeleiteten Kardiomyozyten¹⁰ und Maus-iPSCs¹¹, haben wir ein Protokoll entwickelt, um skalierbares, von HiPSC abgeleitetes größeres implantierbares Gewebe mit Polydimethylsiloxan (PDMS)-Formen zu erzeugen. Wir haben eine Reihe von Formgeometrien ausgewertet, um die effektivsten Werkzeugeigenschaften zu bestimmen. Mesh-förmige ECTs mit mehreren Bündeln und Knoten wiesen hervorragende Eigenschaften in Zelllebensfähigkeit, Gewebefunktion und Skalierbarkeit im Vergleich zu einfachen Oder linearen Formaten auf, denen Poren oder Knoten fehlten. Wir implantierten die netzförmige ECT in ein Myokardinfarktmodell der Ratte und bestätigten ihre therapeutische Wirkung ähnlich den implantierten zylindrischen ECTs¹². Hier beschreiben wir das Protokoll zur Erzeugung eines hiPSC-abgeleiteten netzförmigen ECT.

Protokoll

1. Pflege von HiPSCs und kardiovaskuläre Differenzierung

1. Erweitern und pflegen Sie hiPSCs auf dünnschichtigen Kellermembranmatrix (Wachstumsfaktor reduziert, 1:60 Verdünnung) in konditionierten Medium aus Maus embryonalen Fibroblasten (MEF-CM) mit humanen Basis-Fibroblasten-Wachstumsfaktor (hbFGF)⁴extrahiert.
   HINWEIS: Wir haben eine hiPSCs (4-Faktor (Okt3/4, Sox2, Klf4 und c-Myc) Linie verwendet: 201B6). Fügen Sie hbFGF bei der entsprechenden Konzentration für jede Zelllinie hinzu. Laminin-511 Fragment kann auch für die Beschichtung von Kulturschale anstelle von Kellermembran Matrix verwendet werden. Kommerziell erhältliches Medium, das für die feederfreie Kultur von hiPSCs entwickelt wurde, kann als Ersatz für MEF-CM verwendet werden.
2. Verwenden Sie Versene (0,48 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)-Lösung), um Zellen zu lösen und zu dissoziieren, wenn die Zellkonfluenz 90-u2012100% erreicht.
   HINWEIS: Es können auch andere handelsübliche Produkte zur Zelldissoziation verwendet werden.
3. Plattenzellen mit einer Dichte von 10.000 Zellen/mm² auf matrixbeschichteten Zellkulturplatten in MEF-CM mit hbFGF und Kultur für zwei bis drei Tage.
4. Wenn die Kultur vollständig konfluent wird, decken Sie die Zellen für einen Tag mit Matrix (1:60 Verdünnung mit MEF-CM) ab.
5. Ersetzen Sie den MEF-CM durch RPMI 1640 + B27 medium. 100 ng/ml Activin A und 100 ng/ml Wnt3A für einen Tag in das Medium geben.
   HINWEIS: Dies ist Tag 0 der Differenzierung. Um die kanonische Wnt-Signalisierung zu regulieren, können anstelle von Wnt3A auch GSK3-Inhibitoren verwendet werden.
6. Ändern Sie am ersten Tag der Differenzierung das Medium auf das neue RPMI 1640 + B27 mit 10 ng/ml BMP4 und 10 ng/ml hbFGF. Kulturzellen für zwei (MC-Protokoll) oder vier (CM+EC-Protokoll) Tage ohne mittlere Veränderung⁵.
   HINWEIS: Das CM+EC-Protokoll ist so optimiert, dass gleichzeitig Kardiomyozyten (CMs) und vaskuläre Endothelzellen (ECs) induzieren. Das MC-Protokoll ist optimiert, um bevorzugt gefäßbildende Zellen (MCs) zu induzieren.
7. CM+EC-Protokoll zur Induktion von CMs und ECs (Abbildung 1A).
   1. Ersetzen Sie das Medium am 5. Tag der Differenzierung durch RPMI 1640 + B27, ergänzt durch 50 ng/ml VEGF₁₆₅.
   2. Ändern Sie das Kulturmedium alle 48 h bis zum Tag 13-201215 der Differenzierung.
8. MC-Protokoll zur Induktion von gefäßbildenden Wandzellen (Abbildung 1B)
   1. Ersetzen Sie das Medium an Tag 3 der Differenzierung durch RPMI1640 + 10% fetales Rinderserum (FBS).
   2. Ändern Sie das Kulturmedium alle 48 h bis zum Tag 13-201215 der Differenzierung.

2. Zellernte- und Abstammungsanalyse am Differenzierungstag 13-u201215

1. Waschen Sie die Zellen mit Ca²⁺ und Mg²⁺ freier Phosphat-gepufferter Saline (PBS).
2. Fügen Sie eine Zelldissoziationslösung (mit Proteasen, Kollagenen und DNAsen) in die Zellkulturschale ein, um die Platte zu bedecken. Inkubieren Sie die Platte für 5 min bei 37 °C.
3. Sammeln und dissoziieren Sie die Zellen mit Kulturmedium mit einer Pipette nach der Inkubation.
4. Weisen Sie 1 x 10⁶ Zellen für die Linienanalyse mit Durchflusszytometrie zu. Um abgestorbene Zellen zu beseitigen, färben Sie die Zellen mit fixierbarem Lebensfähigkeitsfarbstoff.
5. Färben Sie die Zellen mit Membranoberflächenmarkern in PBS mit 5% FBS. Verwenden Sie die folgenden Verdünnungen von Antikörpern in fluoreszenzaktivierten Zellsortierungspuffer (FACS): Anti-PDGFR (1:100), Anti-VE-Cadherin (1:100), Anti-TRA-1-60 (1:20).
6. Für intrazelluläre Proteine die Zellen mit 4% Paraformaldehyd (PFA) in PBS resuspendieren und fixieren.
7. Färben Sie die Zellen mit antikardialer Isoform von Troponin T (cTnT) in PBS mit 5% FBS und 0,75% Saponin, dann beschriften Sie den cTnT Antikörper mit 488 Maus IgG1 (Verdünnung 1:50).
8. Setzen Sie die gebeizten Zellen in PBS mit 5% FBS wieder auf und legen Sie sie in FACS-Röhren mit Zellsieb.
9. Analysieren Sie die Zellzusammensetzung der gefärbten Zellen aus jedem Differenzierungsprotokoll mit Durchflusszytometrie, um die Erzeugung von Zellsuspensionen mit definierten Linienverteilungen zu erleichtern.
   HINWEIS: Bei dieser Durchführung dieses Verfahrens wird die verbleibende Zellsuspension für ECTs in einem 4 °C-Kühlschrank aufbewahrt.

3. Herstellung von PDMS Gewebeform

1. Gießen Sie eine 0,5 mm dicke und über 30 mm x 30 mm Schicht Aus Polydimethylsiloxan (PDMS) durch Mischen des Prepolymers und der Vernetzungslösung im Verhältnis 10:1 und härten Sie dann bei 80 °C für 3 h aus.
2. Schneiden Sie das PDMS-Blatt und verkleben Sie es mit Silikonkleber, um ein rechteckiges Tablett mit einer Höhe von 7 mm, einer Länge von 0,5 mm und 2,5 mm hohen rechteckigen Pfosten in gestaffelter Position herzustellen. Der horizontale Pfostenabstand zwischen zwei Pfostenlinien beträgt 2,5 mm (Abbildung 2B).
3. Autoklavieren Sie das Fach bei 120 °C für 20 min.
4. Beschichten Sie das Fach mit 1% Poloxamer 407 in PBS für 1 h. Spülen Sie den Poloxamer 407 und spülen Sie die Form mit PBS ausreichend vor Gebrauch.

4. ECT-Bau

1. Kombinieren Sie nach der Zelllinienanalyse die Zellen aus CM+EC- und MC-Protokollen so, dass die endletzte Konzentration von MCs bei einer Gesamtzellenzahl von sechs Millionen Zellen pro Konstrukt⁵10 bis 20 % beträgt.
2. Suspend gemischte sechs Millionen Zellen in ECT-Kulturmedium (alpha Minimum essentielle Medium ergänzt mit 10% FBS, 50 M 2-Mercaptoethanol und 100 U/ml Penicillin-Streptomycin).
3. Vorbereitung der Matrixlösung
   1. Mischen Sie 133 l säurelösliche Rattenschwanzkollagen Typ I Lösung (2 mg/ml, pH 3) mit 17 l von 10x Minimum Essential Medium (MEM). Mischen Sie dann die Lösung mit 17 l Alkalipuffer (0,2 M NaHCO₃, 0,2 m HEPES und 0,1 M NaOH).
      HINWEIS: Kollagen muss auf Eis (4 °C) gehalten werden. Überprüfen Sie die Pufferfarbe, und wenn das Medium nicht rosawird, wenn alle Lösungen gemischt werden, fügen Sie dem Medium zusätzlichen Alkalipuffer hinzu. Die Mischschritte müssen Kollagen I + 10x MEM mischen und dann Alkalipuffer hinzufügen. Ändern Sie diese Reihenfolge NICHT. Erzeugen Sie KEINE Blasen in der Mischung.
   2. Fügen Sie der neutralisierten Kollagenlösung 67 L Kellermembranmatrix hinzu.
      HINWEIS: Die Mischlösung muss auf Eis (4 °C) gehalten werden.
4. Zentrifugieren Sie die vorbereitete Zellsuspension mit sechs Millionen Zellen bei 1.100 U/min (240 x g) für 5 min und setzen Sie die Zellen mit 167 l hochglukosedmEM + 20% FBS + 1% Penicillin-Streptomycin (100x) wieder aus.
5. Mischen Sie die Zellsuspension und die Matrixlösung. Das Gesamtvolumen der Zell-Matrix-Mischung für ein Konstrukt beträgt 400 l.
   HINWEIS: Die Zell-Matrix-Mischung sollte in diesem Schritt nicht-viskos und rosafarben sein. Halten Sie es auf Eis, da das Gel bei Raumtemperatur erstarrt. Die Endkonzentration von Kollagen Typ I beträgt 0,67 mg/ml.
6. Gießen Sie die Zell-Matrix-Mischung gleichmäßig über die poloxamer 407 beschichtete PDMS-Gewebeform, die in eine Sechs-Well-Kulturplatte¹²gelegt wird.
   HINWEIS: Gießen Sie die Mischung sorgfältig, um Blasen zu vermeiden, um Füllfehler im gegossenen Gel zu vermeiden.
7. Inkubieren Sie das Zell-Matrix-Gemisch in einem Standard-CO2-Inkubator (37C, 5 %_CO2) für 60 min.₂
8. Nachdem das Gewebe gebildet wurde, tränken Sie die Gewebeform mit 4 ml ECT-Kulturmedium.
   HINWEIS: Obwohl die Zelle/Matrix in 60 min vernetzt ist, ist das Konstrukt immer noch sehr zerbrechlich. Fügen Sie Das Medium vorsichtig hinzu, um eine Beschädigung zu vermeiden.
9. Kultur das Gewebe für 14 Tage mit mittlerer Veränderung jeden Tag.
10. Entfernen Sie vor der ECT-Implantation den ECT vorsichtig mit sterilisierten Feinzangen von den Ladepfosten.
    HINWEIS: Die endgültigen ECT-Abmessungen nach dem Entfernen aus der Form sind kleiner als die ursprüngliche Form. Eine 2,1 cm x 2,05 cm große Form erzeugt einen freigesetzten ECT von ca. 1,5 cm x 1,5 cm. Eine größere Form von 3,9 cm x 4,05 cm erzeugt einen ECT von ca. 3 cm x 3 cm. Unloaded ECT zeigt intrinsische spontane Schläge im warmen Kulturmedium. Obwohl zunächst eine Netzstruktur beibehalten wird, schrumpft und kondensiert ein entladener ECT im Laufe der Zeit. Es ist möglich, das Gewebe mit feinen Zangen weich zu halten und dann 7-0 Seidennaht zu verwenden, um den ECT am Epikardie zu befestigen.

Ergebnisse

Abbildung 1A,B zeigt die Schaltpläne des CM+EC- und MC-Protokolls. Nach der Induktion von CMs und ECs aus cm+EC-Protokoll und MCs aus dem MC-Protokoll werden die Zellen gemischt und passen die endgültigen MC-Konzentrationen an 10 bis 20 % der Gesamtzellen an. Die 2 cm breite Gewebeform wird nach der Konstruktionszeichnung aus 0,5 mm dickem PDMS-Blatt gefertigt(Abbildung 2A,B). Sechs Millionen CM+EC+MC-Zellen werden mit Kollage...

Diskussion

Nach Abschluss unserer Untersuchung eines linearen Formats, hiPSC abgeleitet ECT⁵, passten wir das Protokoll an, um hiPSC-abgeleitete CMs, ECs und MCs zu mischen, um die In-vitro-Expansion von Gefäßzellen innerhalb von ECTs und die anschließende in vivo-Gefäßkopplung zwischen ECTs und Empfängermyokard zu erleichtern.

Um die Erzeugung größerer, implantierbarer Netz-ECT-Geometrien zu erleichtern, verwendeten wir dünne PDMS-Platten, um die 3D-Formen mit Ladepfoste...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
Cell Culture Dishes 100x20 mm style	Falcon/ Thomas scientific	9380C51
Multiwell Plates For Cell Culture 6well 50/CS	Falcon / Thomas scientific	6902A01
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Dow Corning	761036
Reagents
Accumax	Innovative Cell Technologies	AM-105
BMP4, recombinant (10µg)	R&D	RSD-314-BP-010
Collagen, Type I solution from rat tail	Sigma	C3867
Growth factor-reduced Matrigel	Corning	356231
Human VEGF (165) IS, premium grade	Miltenyi	130-109-385
Pluronic F-127, 0.2 µm filtered (10% Solution in Water)	Molecular Probes	P-6866
Recombinant human bFGF	WAKO	060-04543
Recombinant Human/Mouse/Rat ActivinA (50µg)	R&D	338-AC-050
rh Wnt-3a (10µg)	R&D	5036-WN
Versene solution	Gibco	15040066
Culture medium and supplements
10x MEM	Invitrogen	11430
2 Mercaptro Ethanol	SIGMA	M6250
B27 supplement minus insulin	Gibco	A1895601
DMEM, high glucose	Gibco	11965084
Fetal Bovine Serum (500ml)	Any
Fetal Bovine Serum (500ml)	Any
L-Glutamine	Gibco	25030081
NaHCO3	Any
PBS 1x	Gibco	10010-031
Penicillin-Streptomycin (5000 U/mL)	Gibco	15070-063
RPMI1640 medium	Gibco	21870092
αMEM	Invitrogen	11900024
Flowcytometry
anti-TRA-1-60, FITC, Clone: TRA-1-60, BD Biosciences	BD / Fisher	560380
anti-Troponin T, Cardiac Isoform Ab-1, Clone: 13-11, Thermo Scientific Lab Vision	Fisher	MS-295-P0
BD FACS Clean Solution	BD	340345
BD FACSFlow Sheath Fluid	BD	342003
BD FACSRinse Solution	BD	340346
EDTA	Any
Falcon Tube with Cell Strainer Cap (Case of 500)	Corning	352235
Fetal Bovine Serum (500ml)	Any
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation	Molecular Probes	L34957
PDGFRb; anti-CD140b, R-PE, Clone: 28D4, BD Biosciences	BD / Fisher	558821
Saponin	Sigma-Aldrich	47306-50G-F
VEcad-FITC; anti-CD144, FITC, Clone: 55-7H1, BD Biosciences	BD / Fisher	560411
Zenon Alexa Fluor 488 Mouse IgG1 Labeling Kit	Molecular Probes	Z25002