הכנת רקמות לב מהונדסות בצורת רשת נגזר תאי iPS אנושיים לתיקון שריר הלב Vivo

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מייצר רקמות לב מהונדסות בצורת רשת המכילות תאי לב וכלי דם המופקים מתאי גזע פלורופוטנטיים אנושיים כדי לאפשר חקירה של טיפול השתלת תאים למחלות לב.

Abstract

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטות ליצירת רקמות לב מהונדסות (ECTs) מדרגיות בצורת רשת המורכבות מתאי לב וכלי דם המופקים מתאי גזע פלורופוטנטיים (hiPSCs) הנגרמים על ידי בני אדם, אשר מפותחים לקראת המטרה של שימוש קליני. קרדיומיוקיטים נגזר HiPSC, תאים אנדותל, ותאי ציור קיר כלי דם מעורבבים עם מטריצת ג'ל ולאחר מכן נשפכים לתוך עובש רקמה polydimethylsiloxane (PDMS) עם הודעות מלבניות פנימיות מטלטלות. ביום תרבות 14 ECTs להבשיל לתוך 1.5 ס"מ x 1.5 ס"מ רשת מבנה עם חבילות myofiber קוטר 0.5 מ"מ. קרדיומיוציטים ליישר את הציר הארוך של כל צרור ולנצח באופן ספונטני באופן סינכרוני. ניתן לשנות את קנה המידה של גישה זו עד ECT רשת גדולה יותר (3.0 ס"מ x 3.0 ס"מ) תוך שמירה על התבגרות ופונקציה של מבנה. לכן, ECTs בצורת רשת המופקת מתאי לב הנגזרים על-ידי hiPSC עשויים להיות אפשריים עבור פרדיגמות התחדשות הלב.

Introduction

מחקרים פרה-קליניים רבים וניסויים קליניים אישרו את היעילות של טיפולים התחדשות לב מבוססי תאים עבור^{לבבות כושלים 1,,2,,3}. בין סוגי תאים שונים, תאי גזע פלורופוטנטיים המושרה על ידי בני אדם (hiPSCs) מבטיחים מקורות תאים מכוח יכולת ההתפשטות שלהם, פוטנציאל לייצר תוחינות לב וכלי^{דם שונים 4,,5}, ו allogenicity. בנוסף, טכנולוגיות הנדסת רקמות אפשרו להעביר מיליוני תאים ללב^{פגום 5,6,,,7,,8}.

בעבר, דיווחנו על הדור של רקמות לב ליניאריות (3D) ליניאריים מהונדסים (ECTs) מ-hiPSC נגזר תחבולות לב וכלי דם באמצעות מערכת תרבות מסחרית זמינה עבור רקמות ביו-ארטיפיאליות 3D^5,7. מצאנו כי הדו-קיום של תאי אנדותל כלי דם ותאי ציור קיר עם קרדיומיוציטים בתוך ECT הקלה על התבגרות רקמות מבניות ואלקטרופיזיולוגיות. יתר על כן, אימתנו את הפוטנציאל הטיפולי של hiPSC-ECTs מושתל במודל אוטם שריר הלב חולדה סובלני חיסונית כדי לשפר את תפקוד הלב, לחדש את שריר הלב, ולשפר אנגיוגנזה^5. עם זאת, ECTs ליניארי שנבנה על ידי שיטה זו היו 1 מ"מ על 10 מ"מ צילינדרים ולכן לא מתאים להשתלה במחקרים פרה-קליניים עם בעלי חיים גדולים יותר או שימוש קליני.

בהתבסס על השימוש המוצלח של תבניות רקמות כדי ליצור היווצרות רקמות מהונדסות נקבוביות באמצעות myoblasts שלד חולדה ו cardiomyocytes⁹, אדם ESC נגזר cardiomyocytes^{10 ועכבר} iPSCs^11,פיתחנו פרוטוקול כדי ליצור מדרגי hiPSC נגזר רקמות מושתלות גדולות יותר באמצעות תבניות polydimethylsiloxane (PDMS). הערכנו מגוון של גיאומטריות עובש כדי לקבוע את מאפייני עובש היעילים ביותר. ECTs בצורת רשת עם חבילות וצמתים מרובים הציגו מאפיינים מצוינים בכדאיות התא, פונקציית רקמות ומדרגיות בהשוואה לפורמטים פשוטים או ליניאריים שחסרים נקבוביות או צמתים. השתלנו את ECT בצורת רשת במודל אוטם שריר הלב חולדה ואימת את השפעותיו הטיפוליות דומה ECTs גלילי^{מושתל 12.} כאן אנו מתארים את הפרוטוקול כדי ליצור ECT בצורת רשת שינוי נגזר hiPSC.

Protocol

1. תחזוקה של hiPSCs ובידול לב וכלי דם

1. להרחיב ולתחזק hiPSCs על מטריצת קרום מרתף מעיל דק (גורם גדילה מופחת, 1:60 דילול) בינוני מותנה מופק פיברובלסטים עוברי העכבר (MEF-CM) עם גורם גדילה פיברובלסט בסיסי אנושי (hbFGF)⁴.
   הערה: השתמשנו בקו hiPSCs (4 גורם (אוק3/4, Sox2, Klf4 ו- c-Myc) שורה: 201B6). הוסף hbFGF בריכוז המתאים עבור כל קו תא. שבר Laminin-511 יכול לשמש גם לציפוי של צלחת תרבות במקום מטריצת קרום מרתף. אמצעי זמין מסחרית המיועד לתרבות ללא הזנה של hiPSCs יכול לשמש כתחליף ל- MEF-CM.
2. השתמש Versene (0.48 mM אתילנדיאמין טטראצטי חומצה (EDTA) פתרון) כדי לנתק ולנתק תאים כאשר קונפלוננס התא מגיע 90\u2012100%.
   הערה: ניתן להשתמש גם במוצרים אחרים הזמינים מסחרית עבור דיסוציאציה של תאים.
3. תאי לוח בצפיפות של 10,000 תאים /מ"מ 2 על לוחות תרבות תא מצופה מטריצה ב MEF-CM עם hbFGF ותרבות במשך יומיים עד^שלושה ימים.
4. כאשר התרבות הופכת לתלת-תפלה מלאה, כסה את התאים במטריצה (דילול של 1:60 עם MEF-CM) ליום אחד.
5. החלף את MEF-CM ב- RPMI 1640 + B27 בינוני. להוסיף 100 ng/mL של Activin A ו 100 ng/mL של Wnt3A למדיום ליום אחד.
   הערה: זהו היום 0 של בידול. כדי לתזמן איתות WNT canonical, מעכבי GSK3β יכול לשמש גם במקום Wnt3A.
6. ביום הראשון של בידול, לשנות את המדיום RPMI חדש 1640 + B27 עם 10 ng/mL של BMP4 ו 10 ng/mL של hbFGF. תאי תרבות עבור שני ימים (פרוטוקול MC) או ארבעה (פרוטוקול CM+EC) ללא שינוי בינוני⁵.
   הערה: פרוטוקול CM+EC ממוטב כדי לגרום בו-זמנית לתאי קרדיומיוציטים (CMs) ותאי אנדותל כלי דם (ECs). פרוטוקול MC ממוטב לתאי ציור קיר של כלי דם (MCs).
7. פרוטוקול CM+EC עבור אינדוקציה של CMs ו- ECs (איור 1A).
   1. החלף את המדיום ביום 5 של בידול עם RPMI 1640 + B27 בתוספת 50 ng/mL של VEGF₁₆₅.
   2. שנה את מדיום התרבות כל 48 שעות עד היום 13\u201215 של בידול.
8. פרוטוקול MC עבור אינדוקציה של תאי קיר כלי דם (איור 1B)
   1. החלף את המדיום בסרום RPMI1640 + 10% סרום נקבי עוברי (FBS) ביום 3 של בידול.
   2. שנה את מדיום התרבות כל 48 שעות עד היום 13\u201215 של בידול.

2. ניתוח קציר תאים ו קוצר יוחות ביום בידול 13\u201215

1. לשטוף את התאים עם Ca²⁺ ו Mg²⁺ תמיסת מלח פוספט חינם אגירה (PBS).
2. הוסף פתרון דיסוציאציה של תאים (המכיל פרוטאזים, קולאזנס ו-DNAses) בצלחת תרבות התא כדי לכסות את הצלחת. דגירה את הצלחת במשך 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
3. לאסוף ולנתק את התאים עם מדיום תרבות באמצעות pipette לאחר הדגירה.
4. הקצה 1 x 10⁶ תאים לניתוח שושלת עם ציתום זרימה. כדי לחסל תאים מתים, להכתים את התאים עם צבע קיימא לתקן.
5. להכתים את התאים עם סמני משטח קרום PBS עם 5% FBS. השתמש דילולים הבאים של נוגדנים פלואורסצנטית מופעל תא מיון (FACS) כתמים מאגר: אנטי PDGFRβ (1:100), קאדרין נגד VE (1:100), anti-TRA-1-60 (1:20).
6. עבור חלבונים תאיים, לתקן את התאים עם 4% paraformaldehyde (PFA) ב PBS.
7. להכתים את התאים עם isoform אנטי לב של טרופונין T (cTnT) ב PBS עם 5% FBS ו 0.75% סאפונין, ואז לתייג את הנוגדן cTnT עם 488 עכבר IgG1 (דילול 1:50).
8. לתוסף מחדש את התאים המוכתמים ב PBS עם 5% FBS ולשים אותם בצינורות FACS עם מסננת תא.
9. נתח את הרכב התא של התאים המוכתמים מכל פרוטוקול בידול עם ציתום זרימה כדי להקל על יצירת מתלי תאים עם הפצות שושלת מוגדרות.
   הערה: בעת ביצוע הליך זה, מתלי התא הנותרים עבור ECTs נשמרים במקרר של 4°C.

3. ייצור של תבנית רקמת PDMS

1. הטלת שכבה בעובי 0.5 מ"מ ושכבה של מעל 30 מ"מ x 30 מ"מ של פולידימטילסילוקסן (PDMS) על-ידי ערבוב פתרון טרום-פולימר וחיבור צולב ביחס של 10:1 ולאחר מכן ריפוי ב-80°C למשך 3 שעות.
2. חותכים את גיליון ה-PDMS ומקשרים אותו עם דבק סיליקון כדי לפברק מגש מלבני של 21 מ"מ x 20.5 מ"מ באורך 7 מ"מ, ברוחב 0.5 מ"מ ובצבים מלבניים בגובה 2.5 מ"מ בתנוחה מלבנית. מרווח אופקי בין שתי שורות של פוסטים הוא 2.5 מ"מ(איור 2B).
3. אוטוקבל המגש ב-120 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
4. ציפוי המגש עם 1% poloxamer 407 ב PBS עבור 1 שעה. יש לשטוף את הפולוקסאמר 407 ולשטוף את התבנית ב-PBS מספיק לפני השימוש.

4. בניית ECT

1. לאחר ניתוח תוחם התא, שלב את התאים מפרוטוקולי CM+EC ו- MC כך שהריכוז הסופי של MCs הוא 10 עד 20% במספר תא כולל של שישה מיליון תאים לכל^{מבנה 5}.
2. להשעות מעורב שישה מיליון תאים במדיום תרבות ECT (אלפא מינימום חיוני בינוני בתוספת עם 10% FBS, 50 μM 2-mercaptoethanol ו 100 U /mL פניצילין-סטרפטומיצין).
3. הכנת פתרון מטריקס
   1. לערבב 133 μL של חומצה מסיסה זנב חולדה זנב קולגן סוג אני פתרון (2 מ"ג / מ"ל, pH 3) עם 17 μL של 10x מינימום חיוני בינוני (MEM). לאחר מכן לערבב את הפתרון עם 17 μL של מאגר אלקלי (0.2 M NaHCO₃, 0.2 M HEPES, ו 0.1 M NaOH).
      הערה: יש לשמור על קולגן על קרח (4°C). בדוק את צבע המאגר ואם המדיום אינו הופך ורדש כאשר כל הפתרונות מעורבבים, הוסף מאגר אלקלי נוסף למדיום. שלבי ערבוב חייבים להיות שילוב קולגן I + MEM 10x ולאחר מכן להוסיף מאגר אלקלי. אל תשנה הזמנה זו. אל תיצור בועות בתמהיל.
   2. הוסף 67 μL של מטריצת קרום מרתף לפתרון קולגן מנוטרל.
      הערה: יש לשמור את הפתרון המעורב על קרח (4 °C).
4. צנטריפוגה מתלי התא המוכן המכיל שישה מיליון תאים ב 1,100 סל"ד (240 x g)במשך 5 דקות ולתחל מחדש את התאים עם 167 μL של DMEM גלוקוז גבוה + 20% FBS + 1% פניצילין סטרפטומיצין (100x).
5. ערבב את מתלי התא ואת פתרון המטריצה. הנפח הכולל של תערובת תא / מטריצה עבור מבנה אחד הוא 400 μL.
   הערה: תערובת התא/מטריקס צריכה להיות לא צמיגית וצבע ורדיד בשלב זה. שמור אותו על קרח כמו הג'ל יתגבש בטמפרטורת החדר. הריכוז הסופי של קולגן סוג אני הוא 0.67 מ"ג/מ"ל.
6. יוצקים את תערובת התא / מטריקס באופן שווה על פולוקסאמר 407 מצופה PDMS רקמת עובש, אשר ממוקם בצלחת תרבות שש באר^12.
   הערה: יוצקים את התערובת בזהירות כדי למנוע יצירת בועות כדי למנוע מילוי פגמים בג'ל שנשפך.
7. דגירה את תערובת התא / מטריקס באינקובטור CO₂ סטנדרטי (37C, 5 % CO_{2) במשך}60 דקות.
8. לאחר הרקמה נוצרת, להשרות את עובש הרקמה עם 4 מ"ל של ECT תרבות בינונית.
   הערה: למרות התא / מטריצה הוא crosslinked בתוך 60 דקות, המבנה הוא עדיין שביר מאוד. מוסיפים בעדינות מדיום כדי למנוע פגיעה בו.
9. תרבות הרקמה במשך 14 ימים עם שינוי בינוני בכל יום.
10. לפני השתלת ECT, הסר את ECT מעמדות הטעינה בעדינות באמצעות מפלצות עדינות מעוטרות.
    הערה: ממדי ECT הסופיים לאחר ההסרה מהתבנית הם פחות מהתבנית המקורית. תבנית 2.1 ס"מ על 2.05 ס"מ יוצרת ECT משוחרר של כ 1.5 ס"מ x 1.5 ס"מ. תבנית גדולה יותר באורך 3.9 ס"מ על 4.05 ס"מ יוצרת ECT של כ-3 ס"מ על 3 ס"מ. ECT לא פרוק מראה מכות ספונטניות פנימיות במדיום תרבות חמה. למרות שבתחילה הוא שומר על מבנה רשת שינוי, ECT לא פורק מתכווץ ומתעב לאורך זמן. ניתן להחזיק את הרקמה ברכות עם מלקות עדינות ולאחר מכן להשתמש בתפר משי 7-0 כדי לחבר את ECT לאפיקארדיום.

תוצאות

איור 1A,B מציג את השרטוטים של פרוטוקול CM+EC ו- MC. לאחר גורם CMs ו- ECs מפרוטוקול CM + EC ו- MCs פרוטוקול MC, התאים מעורבים התאמת ריכוזי MC הסופי לייצג 10 עד 20% של תאים הכולל. תבנית רקמה ברוחב 2 ס"מ מפוברקת על פי ציור העיצוב מגליון PDMS בעובי 0.5 מ"מ(איור 2א', ב). שיש?...

Discussion

לאחר השלמת החקירה שלנו של פורמט ליניארי, hiPSC נגזר ECT⁵, התאמנו את הפרוטוקול כדי לערבב cMs נגזר hiPSC, ECs, ו- MCs כדי להקל על הרחבת מבחנה של תאי כלי דם בתוך ECTs ולאחר מכן צימוד כלי דם vivo בין ECTs ו שריר הלב הנמען.

כדי להקל על יצירת גיאומטריות ECT גדולות יותר, הניתנות להשתלה, השתמשנ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
Cell Culture Dishes 100x20 mm style	Falcon/ Thomas scientific	9380C51
Multiwell Plates For Cell Culture 6well 50/CS	Falcon / Thomas scientific	6902A01
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Dow Corning	761036
Reagents
Accumax	Innovative Cell Technologies	AM-105
BMP4, recombinant (10µg)	R&D	RSD-314-BP-010
Collagen, Type I solution from rat tail	Sigma	C3867
Growth factor-reduced Matrigel	Corning	356231
Human VEGF (165) IS, premium grade	Miltenyi	130-109-385
Pluronic F-127, 0.2 µm filtered (10% Solution in Water)	Molecular Probes	P-6866
Recombinant human bFGF	WAKO	060-04543
Recombinant Human/Mouse/Rat ActivinA (50µg)	R&D	338-AC-050
rh Wnt-3a (10µg)	R&D	5036-WN
Versene solution	Gibco	15040066
Culture medium and supplements
10x MEM	Invitrogen	11430
2 Mercaptro Ethanol	SIGMA	M6250
B27 supplement minus insulin	Gibco	A1895601
DMEM, high glucose	Gibco	11965084
Fetal Bovine Serum (500ml)	Any
Fetal Bovine Serum (500ml)	Any
L-Glutamine	Gibco	25030081
NaHCO3	Any
PBS 1x	Gibco	10010-031
Penicillin-Streptomycin (5000 U/mL)	Gibco	15070-063
RPMI1640 medium	Gibco	21870092
αMEM	Invitrogen	11900024
Flowcytometry
anti-TRA-1-60, FITC, Clone: TRA-1-60, BD Biosciences	BD / Fisher	560380
anti-Troponin T, Cardiac Isoform Ab-1, Clone: 13-11, Thermo Scientific Lab Vision	Fisher	MS-295-P0
BD FACS Clean Solution	BD	340345
BD FACSFlow Sheath Fluid	BD	342003
BD FACSRinse Solution	BD	340346
EDTA	Any
Falcon Tube with Cell Strainer Cap (Case of 500)	Corning	352235
Fetal Bovine Serum (500ml)	Any
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation	Molecular Probes	L34957
PDGFRb; anti-CD140b, R-PE, Clone: 28D4, BD Biosciences	BD / Fisher	558821
Saponin	Sigma-Aldrich	47306-50G-F
VEcad-FITC; anti-CD144, FITC, Clone: 55-7H1, BD Biosciences	BD / Fisher	560411
Zenon Alexa Fluor 488 Mouse IgG1 Labeling Kit	Molecular Probes	Z25002