Imágenes de inmunofluorescencia de daños en el ADN y dosis de focos en células de cáncer de colon humano

Resumen

No se ha establecido completamente la respuesta de daño del ADN inducida por radiación activada por el haz mixto de neutrones utilizado en la terapia de captura de neutrones de boro (BNCT). Este protocolo proporciona un procedimiento paso a paso para detectar focos inducidos por radiación (RIF) de proteínas de reparación mediante tinción de inmunofluorescencia en líneas celulares de cáncer de colon humano después de la irradiación con el haz mezclado con neutrones.

Resumen

El propósito del manuscrito es proporcionar un protocolo paso a paso para realizar microscopía de inmunofluorescencia para estudiar la respuesta de daño de ADN inducida por radiación inducida por el haz mixto de neutrones-gamma utilizado en la terapia de captura de neutrones de boro (BNCT). Específicamente, la metodología propuesta se aplica para la detección de la activación de proteínas de reparación que se pueden visualizar como focos utilizando anticuerpos específicos para roturas de doble cadena de ADN (ADN-DSB). Los focos de reparación del ADN fueron evaluados por inmunofluorescencia en células de cáncer de colon (HCT-116) después de la irradiación con el haz mezclado con neutrones. Los ADN-DSB son las lesiones más genotóxicas y se reparan en células de mamíferos por dos vías principales: vía de unión final no homóloga (NHEJ) y reparación de recombinación homóloga (HRR). Las frecuencias de los focos, inmunoquímicamente manchadas, para los marcadores de uso común en radiobiología como el H2AX, 53BP1 están asociadas con el número DNA-DSB y se consideran marcadores eficientes y sensibles para monitorear la inducción y reparación de ADN-DSB. Se estableció que los focos de la serie H2AX atraen proteínas de reparación, lo que llevó a una mayor concentración de factores de reparación cerca de un OSD. Para monitorear el daño del ADN a nivel celular, se planeó un análisis de inmunofluorescencia para la presencia de focos de proteína de reparación representativos de ADN-PKcs de la vía NHEJ y Rad52 de la vía HRR. Hemos desarrollado e introducido un protocolo de tinción de inmunofluorescencia fiable para la detección de la respuesta de daño del ADN inducida por radiación con anticuerpos específicos para factores de reparación de las vías NHEJ y HRR y focos observados por radiación (RIF). La metodología propuesta se puede utilizar para investigar la proteína de reparación que está altamente activada en el caso de la radiación de haz mezclado con neutrones, lo que indica el dominio de la vía de reparación.

Introducción

No se ha determinado completamente la respuesta al daño del ADN inducida por radiación activada por el haz mixto de neutrones utilizado en la terapia de captura de neutrones de boro (BNCT). Este protocolo proporciona un procedimiento paso a paso para realizar la detección de focos inducidos por radiación (RIF) de proteínas de reparación mediante tinción de inmunofluorescencia, por ejemplo, en la línea celular del cáncer de colon humano después de la irradiación con el haz mezclado con neutrones.

La radiación ionizante (IR) induce una multitud de tipos diferentes de daño del ADN (ADN-DSB, DNA-SSB, daño a la base de ADN) de los cuales las roturas de doble cadena de ADN son las lesiones de ADN más genotóxicas¹. Las roturas no reparadas pueden causar la muerte celular, mientras que las roturas mal reparadas aumentan la probabilidad de reordenamiento cromosómica, mutagénesis y pérdida de información genética decisiva. Las vías de respuesta al daño que responden a los DSB incluyen vías de reparación del ADN como la unión final no homóloga (NHEJ), un mecanismo que requiere Ku 70/80, DNA-PKcs, Xrcc4, y DNA ligasse IV como factores clave^2,,3,4,5,6. En los mamíferos, la segunda vía principal de reparación del ADN es la vía de reparación de recombinación homóloga (HRR) que requiere componentes clave - la familia del gen de la epistasis Rad52 - Rad51, Rad52, Rad54, Rad55, Rad57 y Rad58⁷. Rad51 y Rad54 son factores clave de recombinación humana implicados en mecanismos de reparación relacionados con el estrés de replicación y roturas de ADN en eucariotas. Curiosamente, se observó que la regulación descendente de la vía HRR mejora la vía NHEJ que es propensa a errores apuntando a la relevancia de la vía de RRHH para la estabilidad del genoma⁸.

El primer paso de la formación de los DSB es la fosforilación de la histona de la serie H2AX en ser-139 por Ataxia telangiectasia mutated kinase (ATM) de la familia PI3 quinasa^7,8. Curiosamente, la fosforilación H2AX se puede visualizar fácilmente mediante la técnica de inmunofluorescencia como focos (focis de H2AX) utilizando anticuerpos específicos para H2AX⁶fosforilado. Existe una relación de 1:1 entre el número de DSB y los focos de H2AX, por lo tanto, el marcador DSB, -H2AX, se estudia extensamente a través de la caracterización de la formación de focos, tamaño, y cantidad^{6,7,8,9,10,11}. La formación de focos de la serie H2AX conduce al reclutamiento y acumulación de proteínas de respuesta al daño del ADN (DDR) y factores modificadores de la cromatina, tales como 53BP1 (proteína de unión p53 1), MDC1 (mediador del punto de control de daño del ADN), BRCA1, Mre11/Rad50/Nbs1, PARP-1, y muchos otros factores de reparación formando así factores de radiación inducidas por la radiación (RIF). Todas estas proteínas se co-localizan con el valor de H2AX a través de la unión directa o indirecta^1,11,12.

Es importante detectar el daño y la reparación del ADN con una prueba sensible adecuada, por lo tanto, se presta más atención al desarrollo de técnicas de alta precisión¹³. En el contexto de los estudios de daño y reparación del ADN, la metodología es crucial para la detección sensible del daño del ADN genómico, la descripción de la categoría de daño y la cuantificación de los mecanismos de daño y reparación del ADN¹³. Para detectar células individuales con ADN dañado, el ensayo de cometas se utiliza comúnmente en estudios radiobiológicos¹⁴. Otros métodos citogenéticos disponibles reconocen aberraciones cromosómicas, incluyendo dicéntricos, translocaciones, fragmentos alcéricos, anillos y aberraciones de tipo cromático, y daño cromosómico micronúcleo (Mn). El método más utilizado en radiobiología, especialmente en la dosimetría biológica, es el ensayo cromosómica dicéntrica debido a su alta especificidad para la radiación^15. Por ejemplo, la PCR, un método molecular clásico, no puede reconocer el tipo de daño de ADN detectado. En este caso, los métodos inmunométricos pasan el nivel de sensibilidad porque las reacciones son específicas entre el antígeno y el anticuerpo. Las imágenes de inmunofluorescencia proporcionan evidencia visual para la aparición de diferentes proteínas en focos distintos en respuesta a agentes dañinos del ADN como la radiación ionizante¹⁶. Sin embargo, los niveles de activación del daño y los niveles de ARNm de las proteínas de reparación son fácilmente detectables por PCR en tiempo real, que es un método cuantitativo adecuado para estudios moleculares posteriores en el contexto de la respuesta al daño del ADN¹⁷.

Teniendo en cuenta que los focos de H2AX atraen los factores de reparación¹⁸, para monitorear el daño y la reparación del ADN a nivel celular, hemos desarrollado un procedimiento de tinción de inmunofluorescencia fiable, basado en el análisis de la reparación representativa de focis proteicos de la vía NHEJ (DNA-PKcs) y Rad52 de la vía HRR.

Aquí, proponemos el uso de inmunodetección para estas proteínas como el procedimiento eficiente y sensible para el seguimiento de la inducción y reparación del ADN-DSB. Hasta ahora, no ha habido datos disponibles sobre ADN-DSB basados en focos de proteínas de reparación a nivel celular después de la irradiación de¹⁹haz mixto de neutrones para BNCT, excepto los marcadores de 53BP1 y H2AX y 53BP1. Sugerimos la adaptación de la línea celular de cáncer de colon HCT-116, ya que es rica en focos DSB, como una línea celular estándar para el análisis de daños en el ADN, porque los RF son fácilmente detectables. Esta línea celular adherente es fácil de mantener y adecuada para los procedimientos de irradiación. El procedimiento propuesto se basa en una gran cantidad de estudios previos relacionados con el procedimiento general de inmunofluorescencia de la tinción de H2AX. Sin embargo, incluye todos los detalles relativos a la selección de anticuerpos apropiados con diluciones probadas para cada proteína representativa perteneciente a cada vía de reparación. Además, describe la utilización de un haz único mezclado con neutrones utilizado en la terapia BNCT. Sin embargo, recomendamos ampliar los estudios con ambos métodos, la tinción de inmunofluorescencia en primer lugar y luego, con análisis moleculares de alto costo como se realizó anteriormente^4,,17.

Protocolo

1. Preparación del cultivo celular y configuración experimental

1. Mantener las células de cáncer de colon humano, HCT-116 según lo recomendado por el proveedor, en monocapas en frascos de cultivo de 75 cm² que contienen 10 ml de 5a medio modificado de McCoy formulado, complementado con 10% de suero bovino fetal y 1% de solución antimicicótica antibiótica.
2. Células de cultivo en un ambiente humidificado de 5% de CO₂ a 37oC hasta el 70% de la confluencia con una renovación media cada 2 a 3 días.
3. Para obtener el haz BNCT (por ejemplo, haz de neutrones más ¹⁰BPA) y el efecto BNCT de matar las células cancerosas como partículas pesadas y depositar la mayor parte de su energía dentro de las células cancerosas que contienen boro, el día antes de la irradiación, añadir agente de administración de boro al medio de cultivo celular – por ejemplo, ¹⁰BPA, 4-Borono-L-fenilalanina (10 g ¹⁰B/mL, 0.925 mM final) 12–16 h (absorción máxima de boro) antes de la irradiación, como se estudió previamente para las células de colon de cáncer y las células cancerosas^{tiroideas 20,,21 .}
   NOTA: Si utiliza otra línea celular, para la que no existen datos en el caso del estudio BNCT, pruebe la absorción de boro para cada línea celular para obtener una concentración óptima de boro. Mida la absorción celular ¹⁰BPA mediante espectroscopia de emisión óptica plasmática acoplada inductivamente (ICP-OES) realizada por el grupo^{Dagrosa 21}.
4. Después de 12-16 h de entrega de boro, aspirar el medio y lavar las células con 10 ml de 1x PBS. A continuación, pruebe las células añadiendo 2 ml de solución de Tripppsin-EDTA a las células e incubar durante 5 minutos a 37 oC para mejorar el desprendimiento celular. Cuando las células comiencen a desprenderse, detenga la acción de la tripsina agregando 10 ml de medio completo.
5. Aspirar la suspensión celular en el tubo de 15 ml y contar las células utilizando un contador de células automatizado agregando 10 l de 0,4% de azul tripano a 10 ml de células, mezclar y alicuar 10 l en una diapositiva de conteo. Diluir la suspensión celular a una concentración de 1 x 10⁶ células/ml del medio. Aliquot 1 ml de la suspensión celular por criotubo.
6. Preparar dosímetros termoluminiscentes (TLD) para la medición de dosis de rayos gamma y láminas de oro para las fluencies de neutrones y fijar los TLD a los criotubos o matraz de cultivo celular antes de la irradiación.
7. Irradiar las 1 x 10⁶ células/ml con el haz mezclado con neutrones a un flujo térmico de neutrones mínimo recomendado de 5,9 x^{10 11} (n/cm^-2 min^{x 1)4} en frascos de cultivo o criotubos dependiendo de las capacidades de la instalación.
   NOTA: Configure el tiempo de irradiación antes de obtener el flujo de neutrones recomendado.
8. Después de la irradiación, semilla 1 ml de células irradiadas (1 x 10⁶ células/ml) en cubreobjetos de 22 x 22 mm en placas Petri de 35 mm o 6 placas de pozo, suplemento con 2 ml de medio requerido. Incubar células durante un máximo de 3 h a 37oC en un ambiente humidificado de 5% de_CO2 para que se adhieran a los cubreobjetos. Observe la unión de las células de vez en cuando bajo un microscopio invertido con objetivo 20x.
   NOTA: Para las células HCT-116 la densidad mínima es de 600.000 celdas a la semilla. Para un procedimiento de tinción posterior rápido, utilice portaobjetos de cámara, reduzca la densidad celular en consecuencia.

2. Fijación de las células

1. Después de la irradiación e incubación de las células, retire el medio de las células conectadas y lave las células una vez con 2,5 ml de PBS.
2. Fijar celdas con 1 ml de etanol al 70% durante 10 min en RT.
   NOTA: Alternativamente, utilice 1%-3.7% de paraformaldehído (PFA) para la fijación según lo recomendado anteriormente¹⁹. El protocolo está en pausa aquí. Almacene las células fijas en etanol en un congelador a -20 oC durante no más de unas semanas para un análisis posterior y la tinción de inmunofluorescencia.

3. Permeabilización de las células

1. Después de la fijación, retire el etanol de la placa Petri y lave con 2,5 ml de 1x PBS.
   NOTA: No deje que las células se sequen entre los pasos de enjuague.
2. Agregue suavemente 1 ml del 0,2% de Triton X-100/PBS para cubrir los cubreobjetos con las células de los platos Petri.
3. Incubar durante 5 min en RT.
4. Lavar las células 3x con 2,5 ml de 1x PBS.
   NOTA: Aumente el porcentaje de Tritón X-100 en PBS hasta un 0,5% si es necesario (más focos detectables, dependiendo de la línea celular probada). Realice lavados adicionales con PBST (PBS con 0,5% de interpolación) para evitar la unión inespecífica.
5. Paso de permeabilización de bloque con 1 ml de 2% de BSA (fracción búrica bovina V albúmina) diluida en PBS e incubar durante un mínimo de 30 min o 1 h con 1% de BSA.
   NOTA: Este paso se puede omitir y depende del tipo de anticuerpo utilizado. Alternativamente, utilice 5% FBS como se recomienda en la referencia⁴.

4. Tinción de inmunofluorescencia

1. Añadir la cantidad adecuada de anticuerpos primarios (Anti-ɣ-H2AX, Anti-DNA-PKcs y Anti-Rad52) diluidos en PBS con BSA (2% Fracción Suero Bovino V V) según lo recomendado (ver Tabla 1 con diluciones recomendadas) (100 l es necesario por muestra).

Anticuerpo primario	Función	Dilución recomendada	almacenamiento [C]
Anti-ɣ-H2AX	detección de ADN-DSB	1:1000 (PBS-BSA)	4
Anti-DNA-PKcs	detección de RF de proteína DNA-PKcs pertenecientes a NHEJ	1:200 (PBS-BSA)	-20
Anti-Rad52	detección de RITO de proteína Rad52 pertenecientes a HRR	1:200 (PBS-BSA)	-20
Anticuerpo secundario		A oscuras
anti-ratón IgG FITC	focos ɣ-H2AX	1:400 (PBS-BSA)	4
Cabra Anti-Conejo IgG H&L (Alexa Fluor 488)	para los focos de proteínas de reparación NHEJ y HRR	1:500 (PBS-BSA)	-20

Tabla 1: Diluciones recomendadas y notas para el uso de anticuerpos utilizados en la sección 4.

2. Cubra el plato Petri para mantener la humedad en una caja de plástico con lignina hidratada con agua destilada e incubar durante 30 minutos a 37oC en la incubadora.
   NOTA: El protocolo se puede pausar aquí. La incubación se puede realizar a 4oC durante la noche.
3. Después de la incubación realizar 3 lavados con 2,5 ml de PBS.
   NOTA: No deje que la diapositiva se seque durante los pasos de enjuague.
4. Añadir la cantidad adecuada de anticuerpos secundarios (antiratón IgG FITC, Goat Anti-Rabbit IgG (Alexa Fluor 488) diluido en PBS con BSA (ver Tabla 1) (se necesitan 100 l por muestra). Para esto y los siguientes pasos funcionan en la oscuridad.
5. Cubra el plato Petri de nuevo para mantener la humedad en una caja de plástico con lignina hidratada e incubar durante 30 minutos como mínimo a 37oC en la incubadora.
6. Después de la incubación realizar 3 lavados con 2,5 ml de PBS.
7. Añadir 100 l de DAPI diluido en PBS a una concentración final de 1 g/ml para contrarrestar los núcleos.
8. Incubar en breve, durante un máximo de 2 minutos en RT.
9. Después de la incubación realizar 3 lavados con 2,5 ml de PBS.
10. Retire el PBS y coloque suavemente un cubreobjetos en la parte superior del medio de montaje, evitando la formación de burbujas de aire y bordes de sellado del cubreobjetos con esmalte de uñas. Espere hasta que el barniz se seque y pinte el cubreobjetos alrededor.
11. Espere el endurecimiento del medio de montaje (hasta 3 h) antes del análisis de imagen bajo microscopía de fluorescencia.
    NOTA: El protocolo se puede pausar aquí. Almacene los toboganes de vidrio en una caja de plástico a 4 oC en la oscuridad.

5. Adquisición y análisis de imágenes

1. Adquiera imágenes con un microscopio de fluorescencia bajo el objetivo 100x con aceite de inmersión.
   1. Analizar los focos en los núcleos con un microscopio de fluorescencia equipado con los siguientes filtros para: Alexa Fluor 488: excitación/emisión (nm): 496/519, color de emisión verde; DAPI: excitación/emisión (nm): 358-461, color de emisión azul.
      NOTA: El análisis de DSB a lo largo de pistas de una sola partícula puede requerir una microscopía avanzada como microscopía de escaneo láser confocal con mayor resolución.
2. Guarde las imágenes adquiridas y procese con el software de imagen adecuado, por ejemplo, ImageJ o Image Pro^3,,20.
   NOTA: Se recomienda el uso de macros y plugins individuales desarrollados para el análisis automático o el desarrollo/compra de software bioinformático individual.
3. Si utiliza el software Image-Pro para el análisis de focos, procese imágenes en archivos TIFF: seleccione El botón Recuento/Tamaño y, a continuación, haga clic en Tipos [elija el tipo de medida (por ejemplo, diámetro o área)], haga clic en Rangos [establecer rango de la medida], haga clic en Dividir objetos si es necesario. Para ajustar el brillo, haga clic en Brillo [ajustar desajuste]. A continuación, haga clic en Recuento [botón rojo].
4. Para exportar datos, haga clic en Tabla de datos ? Estadísticas ? Exportar a Excel. En el software de hoja de cálculo, dibuje gráficos con el análisis estadístico requerido.

Resultados

En primer lugar, realizamos un análisis de un marcador estándar de detección de ADN-DSB, focos de H2AX en células de cáncer de colon, no irradiados e irradiados con el haz mezclado con neutrones. Los focos H2AX aparecen como puntos fluorescentes distintos y muestran la formación de ADN-DSB (ya que cada punto fluorescente de H2AX representa un solo DSB) (véase la Figura 1).

Discusión

Las frecuencias de los focos, teñidas inmunoquímicamente para los puntos de venta de las normas H2AX y 53BP1 se utilizan comúnmente en radiobiología y se asocian con el número DNA-DSB y se consideran marcadores eficientes y sensibles para supervisar la inducción y reparación de los ADN-DSB^19. El procedimiento de co-tinción de los puntos de vista de los datos de la serie de residuos de H2AX y 53BP1 es un procedimiento estándar para la detección de ADN-DSB. La formación de los focos de H2...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
12 mm Coverslips	VWR	89015-725
35 mm Petri dishes	Sarstedt	7.183.390.000
4-Borono-L-phenylalanine	SIGMA-ALDRICH	17755
Antibiotic-Antimycotic (100X)	Gibco	15240062
Anti-DNA PKcs (phospho S2056) antibody - ChIP Grad	Abcam	AB18192
Anti-Mouse IgG (whole molecule)–FITC antibody produced in goat	SIGMA-ALDRICH	F0257
Anti-phospho-Histone H2A.X (Ser139) Antibody, clone JBW301	MerckMillipore	05-636
Anti-RAD52 antibody	Abcam	AB117097
Bovine Serum Albumin Fraction V (BSA)	Roche	BSAV-RO
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)	ThermoFisher SCIENTIFIC	D1306
Fetal Bovine Serum (Heat Inactivated)	SIGMA-ALDRICH	F9665
Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488)	Abcam	AB150077
HCT-116 cell line	ATCC	CCL-247™
ImageJ	National Institute of Health (NIH)	https://imagej.nih.gov/ij/
Image Pro	Media cybernetics	http://www.mediacy.com/imagepro
LUNA II Automated Cell Counter	Logos Biosystems	L40002
McCoy’s 5A Medium (Modified, with L-glutamine and sodium bicarbonate)	SIGMA-ALDRICH	M9309
microscope slides	ThermoFisher SCIENTIFIC	B-1198
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Hirszfeld Institute of Immunology and Experimental Therapy, PAS	20.59.52.0
Triton X-100	SIGMA-ALDRICH	X100
Trypan Blue Stain, 0.4%	Logos Biosystems	T13001
Trypsin-EDTA solution 0.25%	SIGMA-ALDRICH	T4049