Imagens de imunofluorescência de dna dano e reparo de focos em células cancerígenas de cólon humano

Resumo

A resposta de dano de DNA induzida por radiação ativada pelo feixe misto de nêutrons usado na terapia de captura de nêutrons de boro (BNCT) não foi totalmente estabelecida. Este protocolo fornece um procedimento passo-a-passo para detectar focos induzidos por radiação (RIF) de proteínas de reparação por manchas de imunofluorescência em linhas de células cancerígenas de cólon humano após a irradiação com o feixe misturado de nêutrons.

Resumo

O objetivo do manuscrito é fornecer um protocolo passo-a-passo para a realização de microscopia de imunofluorescência para estudar a resposta de dano de DNA induzida por radiação induzida pelo feixe misto de nêutrons usado na terapia de captura de nêutrons de boro (BNCT). Especificamente, a metodologia proposta é aplicada para a detecção de ativação de proteínas de reparo que podem ser visualizadas como focos usando anticorpos específicos para quebras de dupla cadeia de DNA (DNA-DSBs). Os focos de reparação de DNA foram avaliados por imunofluorescência em células cancerígenas de cólon (HCT-116) após irradiação com o feixe misto de nêutrons. Os DNA-DSBs são as lesões mais genotoxiicas e são reparados em células mamíferas por duas vias principais: via final não homólogo (NHEJ) e reparação de recombinação homologos (HRR). As frequências de focos, imunoquimicamente manchadas, para marcadores comumente usados em radiobiologia como γ-H2AX, 53BP1 estão associadas ao número DNA-DSB e são consideradas como marcadores eficientes e sensíveis para monitorar a indução e reparação de DNA-DSBs. Foi estabelecido que os focos γ-H2AX atraem proteínas de reparo, levando a uma maior concentração de fatores de reparo perto de um DSB. Para monitorar os danos do DNA no nível celular, foi planejada a análise de imunofluorescência para a presença de focos proteicos de reparação representativos de DNA-PKcs da via NHEJ e Rad52 da via HRR. Desenvolvemos e introduzimos um protocolo confiável de coloração de imunofluorescência confiável para a detecção de resposta a danos de DNA induzido por radiação com anticorpos específicos para fatores de reparo das vias NHEJ e HRR e focos induzidos por radiação (RIF). A metodologia proposta pode ser usada para investigar proteínas de reparo altamente ativadas no caso de radiação de feixe misturado de nêutrons, indicando assim o domínio da via de reparo.

Introdução

A resposta de dano de DNA induzida por radiação ativada pelo feixe misto de nêutrons usado na terapia de captura de nêutrons de boro (BNCT) não foi totalmente determinada. Este protocolo fornece um procedimento passo-a-passo para realizar a detecção de focos induzidos por radiação (RIF) de proteínas de reparação por manchas de imunofluorescência, por exemplo, na linha de células cancerígenas de cólon humano após a irradiação com o feixe misturado de nêutrons.

A radiação ionizante (IR) induz uma infinidade de diferentes tipos de dano de DNA (DNA-DSBs, DNA-SSBs, dano à base de DNA) dos quais as quebras de DNA duplo são as lesões de DNA mais genoóxicos¹. Quebras não reparadas podem causar morte celular, enquanto quebras mal reparadas aumentam a probabilidade de rearranjo de cromossomo, mutagênese e perda de informações genéticas decisivas. As vias de resposta a danos que respondem aos DSBs incluem caminhos de reparação de DNA como a junção final não homólogo (NHEJ), um mecanismo que requer Ku 70/80, DNA-PKcs, Xrcc4 e DNA ligase IV como fatores-chave^2,3,,4,,5,6. Nos mamíferos, a segunda principal via de reparação de DNA é a via de reparação de recombinação homologou (HRR), que requer componentes-chave - a família genética Rad52 epistasis – Rad51, Rad52, Rad54, Rad55, Rad57, Rad57 e Rad58⁷. Rad51 e Rad54 são os principais fatores de recombinação humana envolvidos em mecanismos de reparação relacionados ao estresse de replicação e quebras de DNA em eucariotes. Curiosamente, observou-se que a redução da via HRR melhora a via NHEJ, que é propensa a erros apontando a relevância da via de RH para a estabilidade do genoma⁸.

O primeiro passo da formação de DSBs é a fosforilação da histona γ-H2AX na Ser-139 por Ataxia telangiectasia mutada quinase (ATM) da família pi3 quinase^7,8. Curiosamente, a fosforilação H2AX pode ser visualizada facilmente pela técnica de imunofluorescência como focos (focos γ-H2AX) utilizando anticorpos específicos para H2AX⁶fosforilado . Há uma relação 1:1 entre o número de DSBs e os focos γ-H2AX, portanto, o marcador DSB, γ-H2AX, é estudado extensivamente através da caracterização da formação de focos, tamanho e quantidade^{6,,7,,8,,9,,10,,11}. A formação de focos γ-H2AX leva ao recrutamento e acúmulo de proteínas de resposta a danos de DNA (DDR) e fatores modificadores de cromatina, como 53BP1 (proteína de ligação p53 1), MDC1 (mediador do ponto de verificação de danos do DNA), BRCA1, Mre11/Rad50/Nbs1, PARP-1, e muitos outros fatores de reparação formando assim focos induzidos por radiação (RIF). Todas essas proteínas co-localizam com γ-H2AX através de ligação direta ou indireta^1,,11,12.

É importante detectar danos de DNA e reparar com um teste sensível adequado, portanto, mais atenção é dada ao desenvolvimento de técnicas altamente precisas¹³. No contexto de estudos de danos e reparos de DNA, a metodologia é crucial para a detecção sensível de danos no DNA do genoma, descrição da categoria de dano e quantificação de danos de DNA e mecanismos de reparação¹³. Para detectar células únicas com DNA danificado, o ensaio do cometa é comumente usado em estudos radiobiológicos¹⁴. Outros métodos citogenéticos disponíveis reconhecem aberrações cromossômicas, incluindo dicentrics, translocações, fragmentos centrados, anéis e aberrações do tipo cromátide, e danos cromossômicos micronucleos (Mn). O método mais utilizado na radiobiologia, especialmente na dosimetria biológica, é o ensaio do cromossomo dicêntrico devido à sua alta especificidade para radiação¹⁵. Por exemplo, o PCR, um método molecular clássico, não pode reconhecer o tipo de dano de DNA detectado. Neste caso, os métodos imunométricos passam o nível de sensibilidade porque as reações são específicas entre o antígeno e o anticorpo. A imagem de imunofluorescência fornece evidências visuais para o aparecimento de diferentes proteínas em focos distintos em resposta a agentes nocivos do DNA como a radiação ionizante¹⁶. No entanto, os níveis de ativação dos níveis de mRNA de danos e reparação de proteínas são facilmente detectáveis por PCR em tempo real, que é um método quantitativo adequado para estudos moleculares adicionais no contexto da resposta a danos no DNA¹⁷.

Levando em conta que os focos γ-H2AX atraem fatores de reparo¹⁸, para monitorar danos e reparos de DNA no nível celular, desenvolvemos um procedimento confiável de coloração de imunofluorescência, baseado na análise dos focos de proteína de reparação representativos da via NHEJ (DNA-PKcs) e Rad52 da via HRR.

Aqui, propomos o uso da imunodetocção para essas proteínas como procedimento eficiente e sensível para o monitoramento da indução e reparação do DNA-DSB. Até agora, não há dados disponíveis sobre DNA-DSBs baseados em focos de proteínas de reparo no nível celular após a irradiação de feixe misto de nêutrons para BNCT, exceto γ-H2AX e 53BP1 marcadores¹⁹. Sugerimos a adaptação da linha de células cancerígenas de cólon HCT-116, pois é rica em focos DSBs, como uma linha celular padrão para análise de danos ao DNA, porque os RIFs são facilmente detectáveis. Esta linha celular aderente é fácil de manter e adequada para procedimentos de irradiação. O procedimento proposto baseia-se em uma enorme quantidade de estudos anteriores relacionados ao procedimento geral de imunofluorescência da coloração γ-H2AX. No entanto, inclui todos os detalhes sobre a seleção de anticorpos apropriados com diluições testadas para cada proteína representativa pertencente a cada via de reparo. Além disso, descreve a utilização de um feixe único de nêutrons misturados usado na terapia BNCT. No entanto, recomendamos estender os estudos com ambos os métodos, mancha de imunofluorescência em primeiro lugar e, em seguida, com análise molecular de alto custo, conforme realizado anteriormente^4,17.

Protocolo

1. Preparação da cultura celular e configuração experimental

1. Manter células cancerígenas de cólon humano, HCT-116 conforme recomendado pelo fornecedor, em monocamadas em frascos de cultura de 75 cm² contendo 10 mL de McCoy's 5a Medium Modified, complementado com soro bovino fetal de 10% e 1% de solução antimíctica antibiótico.
2. Cultivar células em um ambiente umidificado de 5% de CO₂ a 37 °C até 70% de confluência com renovação média a cada 2 a 3 dias.
3. Para ganhar feixe BNCT (por exemplo, feixe de nêutrons mais ¹⁰BPA) e efeito BNCT de matar células cancerígenas como partículas pesadas e depositar a maior parte de sua energia dentro das células cancerígenas contendo boro, um dia antes da irradiação, adicionar agente de entrega de boro ao meio da cultura celular – por exemplo, ¹⁰BPA, 4-Borono-L-fenillanina (10 μg ¹⁰B/mL, 0,925 mM final) 12-16 h (absorção máxima de boro) antes da irradiação, como estudado anteriormente para células cancerígenas de cólon e células cancerígenas da tireoide^20,21.
   NOTA: Se usar outra linha celular, para a qual não existem dados no caso do estudo BNCT, teste a captação de boro para cada linha celular para obter a concentração ideal de boro. Meça a captação celular ^{de 10}BPA por espectroscopia de emissão óptica de plasma indutivamente acoplada (ICP-OES) realizada pelo grupo Dagrosa²¹.
4. Após 12-16 h de entrega de boro, aspire o meio e lave as células com 10 mL de 1x PBS. Em seguida, tentepsinizar as células adicionando 2 mL de solução Trypsin-EDTA às células e incubar por 5 min a 37 °C para melhorar o descolamento celular. Quando as células começarem a se soltar, pare a ação de trippsina adicionando 10 mL de meio completo.
5. Aspire a suspensão celular no tubo de 15 mL e conte as células usando um contador automático de células adicionando 10 μL de 0,4% de trippan azul a 10 μL de células, misture e aliquoting 10 μL em um slide de contagem. Diluir a suspensão celular a uma concentração de 1 x 10⁶ células/mL do meio. Alíquota de 1 mL da suspensão celular por crioboto.
6. Prepare os dosímetros termoluminescentes (TLDs) para a medição de doses de raios gama e folhas de ouro para fluências de nêutrons e conecte TLDs aos criobotos ou frascos de cultura celular antes da irradiação.
7. Irradiar as células 1 x^{10 6/mL} com o feixe misto de nêutrons no fluxo de nêutrons térmicos recomendado de 5,9 x 10¹¹ (n/cm^-2 min⁻¹)⁴ em frascos de cultura ou criobofos, dependendo das capacidades de instalação.
   NOTA: Configure o tempo de irradiação antes para obter fluxo de nêutrons recomendado.
8. Após a irradiação, semente 1 mL de células irradiadas (1 x 10⁶ células/mL) em 22 x 22 mm de tampas em placas de Petri de 35 mm ou 6 placas de poço, complemente com 2 mL de meio necessário. Incubar células por um máximo de 3h a 37 °C em um ambiente umidificado de 5% de CO₂ para deixá-las anexadas às tampas. Observe a fixação das células de tempos em tempos sob um microscópio invertido com objetivo de 20x.
   NOTA: Para as células HCT-116 a densidade mínima é de 600.000 células para a semente. Para um procedimento de coloração mais rápido use lâminas de câmara, reduza a densidade celular em conformidade.

2. Fixação de células

1. Após a irradiação e incubação de células, remova o meio das células anexadas e lave as células uma vez com 2,5 mL de PBS.
2. Fixar células com 1 mL de 70% de etanol por 10 min na RT.
   NOTA: Use alternativamente 1%-3,7% paraformaldeído (PFA) para fixação conforme recomendado anteriormente¹⁹. O protocolo está pausado aqui. Armazene células fixas em etanol em um congelador a -20 °C por não mais do que algumas semanas para análise suplementar e coloração de imunofluorescência.

3. Permeabilização das células

1. Após a fixação retire o etanol da placa de Petri e lave com 2,5 mL de 1x PBS.
   NOTA: Não deixe as células secarem entre as etapas de lavagem.
2. Adicione suavemente 1 mL de 0,2% de Triton X-100/PBS para cobrir as tampas com células em placas de Petri.
3. Incubar por 5 min na RT.
4. Lave as células 3x com 2,5 mL de 1x PBS.
   NOTA: Aumente o percentual de Triton X-100 em PBS até 0,5% se necessário (mais focos detectáveis, dependentes da linha celular testada). Realize lavagens adicionais com PBST (PBS com 0,5% Tween) para evitar a vinculação inespecífica.
5. Bloco de permeabilização passo com 1 mL de 2% BSA (Bovine Serum Fraction V albumin) diluído em PBS e incubar por um mínimo de 30 min ou 1h com 1% de BSA.
   NOTA: Esta etapa pode ser omitida e depende do tipo de anticorpo utilizado. Alternativamente, use 5% de FBS conforme recomendado no ref⁴.

4. Mancha de imunofluorescência

1. Adicione a quantidade adequada de anticorpo primário (Anti-ɣ-H2AX, Anti-DNA-PKcs e Anti-Rad52) diluído em PBS com BSA (2% Bovine Serum Fraction V albumin) conforme recomendado (ver Tabela 1 com diluições recomendadas) (100 μL é necessário por amostra).

Anticorpo primário	Função	Diluição recomendada	armazenamento [°C]
Anti-ɣ-H2AX	detecção de DNA-DSBs	1:1000 (PBS-BSA)	4
Anti-DNA-PKcs	detecção de RIFs de proteína DNA-PKcs pertencentes ao NHEJ	1:200 (PBS-BSA)	-20
Anti-Rad52	detecção de RIFs de proteína Rad52 pertencentes ao HRR	1:200 (PBS-BSA)	-20
Anticorpo secundário		No escuro
anti-mouse IgG FITC	ɣ-H2AX	1:400 (PBS-BSA)	4
Cabra Anti-Coelho IgG H&L (Alexa Fluor 488)	para NHEJ e HRR reparar proteínas focos	1:500 (PBS-BSA)	-20

Tabela 1: Diluições e notas recomendadas para o uso de anticorpos utilizados na seção 4.

2. Cubra a placa de Petri para manter a umidade em uma caixa de plástico com lignina hidratada usando água destilada e incubar por 30 min a 37 °C na incubadora.
   NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui. A incubação pode ser realizada a 4 °C durante a noite.
3. Após a incubação realizar 3 lavagens com 2,5 mL de PBS.
   NOTA: Não permita que o slide seque durante as etapas de lavagem.
4. Adicione a quantidade adequada de anticorpo secundário (anti-mouse IgG FITC, Goat Anti-Rabbit IgG (Alexa Fluor 488) diluído em PBS com BSA (ver Tabela 1) (100 μL é necessário por amostra). Para isso e os seguintes passos funcionam no escuro.
5. Cubra a placa de Petri novamente para manter a umidade em uma caixa de plástico com lignina hidratada e incubar por 30 min de mínima a 37 °C na incubadora.
6. Após a incubação realizar 3 lavagens com 2,5 mL de PBS.
7. Adicione 100 μL de DAPI diluído em PBS a uma concentração final de 1 μg/mL para neutralizar os núcleos.
8. Incubar em breve, por um máximo de 2 min na RT.
9. Após a incubação realizar 3 lavagens com 2,5 mL de PBS.
10. Retire o PBS e coloque delicadamente uma mancha de cobertura na parte superior do meio de montagem, evitando a formação de bolhas de ar e bordas de vedação da tampa com esmalte. Aguarde até que o verniz seque e pinte a tampa ao redor.
11. Aguarde o endurecimento do meio de montagem (até 3 h) antes da análise da imagem sob microscopia de fluorescência.
    NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui. Armazene lâminas de vidro em uma caixa de plástico a 4 °C no escuro.

5. Aquisição e análise de imagens

1. Adquira imagens com um microscópio de fluorescência abaixo do objetivo de 100x com óleo de imersão.
   1. Analisar os focos nos núcleos com um microscópio de fluorescência equipado com os seguintes filtros para: Alexa Fluor 488: excitação⁄emissão (nm): 496/519, emissão verde; DAPI: excitação⁄emissão (nm): 358⁄461, cor de emissão azul.
      NOTA: A análise de DSBs ao longo de faixas de partículas únicas pode exigir microscopia avançada, como microscopia de varredura a laser confocal com maior resolução.
2. Salve imagens e processos adquiridos com software de imagem apropriado, por exemplo, ImageJ ou Image Pro^3,20.
   NOTA: Recomenda-se o uso de macros e plugins individuais desenvolvidos para análise automática ou desenvolvimento/compra de software bioinforático individual.
3. Se usar o software Image-Pro para análise de focos, processe imagens em arquivos TIFF: selecione Botão de Contagem/Tamanho e clique em Tipos [escolha o tipo de medição (por exemplo, diâmetro ou área)], clique em Intervalos [alcance definido da medição], clique em Objetos divididos se necessário. Para ajustar o brilho, clique em Bright [ajuste treshold]. Em seguida, clique em Contagem [botão vermelho].
4. Para exportar dados, clique em Data Table | Estatísticas | Exportar para o Excel. No software de planilha, desenhe gráficos com a análise estatística necessária.

Resultados

Em primeiro lugar, realizamos uma análise de um marcador padrão de detecção de DNA-DSBs, γH2AX focos em células cancerígenas de cólon, não irradiados e irradiados com o feixe misturado de nêutrons. Os focos γ-H2AX aparecem como pontos fluorescentes distintos e mostram a formação de DNA-DSBs (como cada ponto fluorescente γ-H2AX representa um único DSB) (ver Figura 1).

Discussão

As frequências de focos, imunoquimicamente manchadas para γ-H2AX e 53BP1 são comumente utilizadas em radiobiologia e estão associadas ao número DNA-DSB e são consideradas como marcadores eficientes e sensíveis para monitorar a indução e reparação de DNA-DSBs¹⁹. O procedimento de co-coloração de γ-H2AX e 53BP1 é um procedimento padrão para a detecção de DNA-DSBs. A formação de focos γ-H2AX está associada ao recrutamento de 53BP1, um regulador da resposta a danos de DNA

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
12 mm Coverslips	VWR	89015-725
35 mm Petri dishes	Sarstedt	7.183.390.000
4-Borono-L-phenylalanine	SIGMA-ALDRICH	17755
Antibiotic-Antimycotic (100X)	Gibco	15240062
Anti-DNA PKcs (phospho S2056) antibody - ChIP Grad	Abcam	AB18192
Anti-Mouse IgG (whole molecule)–FITC antibody produced in goat	SIGMA-ALDRICH	F0257
Anti-phospho-Histone H2A.X (Ser139) Antibody, clone JBW301	MerckMillipore	05-636
Anti-RAD52 antibody	Abcam	AB117097
Bovine Serum Albumin Fraction V (BSA)	Roche	BSAV-RO
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)	ThermoFisher SCIENTIFIC	D1306
Fetal Bovine Serum (Heat Inactivated)	SIGMA-ALDRICH	F9665
Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488)	Abcam	AB150077
HCT-116 cell line	ATCC	CCL-247™
ImageJ	National Institute of Health (NIH)	https://imagej.nih.gov/ij/
Image Pro	Media cybernetics	http://www.mediacy.com/imagepro
LUNA II Automated Cell Counter	Logos Biosystems	L40002
McCoy’s 5A Medium (Modified, with L-glutamine and sodium bicarbonate)	SIGMA-ALDRICH	M9309
microscope slides	ThermoFisher SCIENTIFIC	B-1198
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Hirszfeld Institute of Immunology and Experimental Therapy, PAS	20.59.52.0
Triton X-100	SIGMA-ALDRICH	X100
Trypan Blue Stain, 0.4%	Logos Biosystems	T13001
Trypsin-EDTA solution 0.25%	SIGMA-ALDRICH	T4049