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要約

ホウ素中性子捕捉療法(BNCT)に用いられる中性子混合ビームによる放射線誘発DNA損傷応答は完全には確立されていない。このプロトコルは、中性子混合ビームを照射した後のヒト大腸癌細胞株における免疫蛍光染色による修復タンパク質の放射線誘発病巣(RIF)を検出するためのステップバイステップの手順を提供する。

要約

本稿の目的は、ホウ素中性子捕捉療法(BNCT)で用いられる中性子ガンマの混合ビームによって誘導される放射線誘発DNA損傷応答を研究するための免疫蛍光顕微鏡を実施するためのステップバイステップのプロトコルを提供することにある。具体的には、DNA二本鎖切断(DNA-DSB)に特異的な抗体を用いて病巣として可視化できる、修復タンパク質活性化の検出に提案された方法論が適用される。DNA修復病巣は、中性子混合ビームを照射した後の大腸癌細胞(HCT-116)における免疫蛍光によって評価した。DNA-DSBは最も遺伝子毒性の病変であり、哺乳類細胞では、非相同のエンド結合経路(NHEJ)および相同組換え修復(HRR)の2つの主要経路によって修復される。γ-H2AXのような放射線生物学で一般的に使用されるマーカーについては、病巣の周波数は、免疫化学的染色、53BP1はDNA-DSB数に関連しており、DNA-DSBの誘導および修復を監視するための効率的で敏感なマーカーと考えられている。γ-H2AX病巣が修復タンパク質を引き付け、DSB付近の修復因子の濃度が高いことが確立されました。細胞レベルでのDNA損傷をモニタリングするために、NHEJ経路からのDNA-PKcs代表的な修復タンパク質病巣およびHRR経路からのRad52の存在に対する免疫蛍光分析が計画された。NHEJおよびHRR経路からの修復因子に特異的な抗体を用いた放射線誘発DNA損傷応答の検出および放射線誘発病巣(RIF)の観察のための信頼できる免疫蛍光染色プロトコルを開発し、導入しました。提案された方法論は、中性子混合ビーム放射の場合に高度に活性化される修復タンパク質の調査に使用することができ、それによって修復経路の優位性を示す。

概要

ホウ素中性子捕捉療法(BNCT)で使用される中性子混合ビームにより活性化された放射線によるDNA損傷応答は完全には決定されていない。このプロトコルは、免疫蛍光染色による修復タンパク質の放射線誘発病巣(RIF)の検出を、例えば、中性子混合ビームで照射した後のヒト大腸癌細胞株において、ステップバイステップの手順を提供する。

電離放射線(IR)は、DNA二本鎖の破断が最も遺伝子毒性のDNA病変であるDNA損傷(DNA-DSB、DNA-SSB、DNA塩基損傷)の多くの異なるタイプを誘導する。修復されていない休憩は細胞死を引き起こす可能性があり、誤って修復された休憩は染色体の再配置、突然変異、決定的な遺伝情報の喪失の確率を高める。DSBに応答する損傷応答経路には、非相同端結合(NHEJ)のようなDNA修復経路、Ku 70/80、DNA-PKcs、Xrcc4、およびDNAリガーゼIVを主要因子22、3、4、5、63,4,5,6として必要とするメカニズムが含まれる。哺乳類では、第2の主なDNA修復経路は、重要な構成要素を必要とする相同組換え修復(HRR)経路である - Rad52エピスタシス遺伝子ファミリー - Rad51、Rad52、Rad54、Rad55、Rad57およびRad587。Rad51とRad54は、真核生物の複製ストレスやDNA切断に関連する修復メカニズムに関与する重要なヒト再結合因子です。興味深いことに、HRR経路のダウンレギュレーションは、ゲノム安定性8に対するHR経路の関連性を指し示す誤差を起こしやすいNHEJ経路を増強することが観察された。

DSBs形成の第一段階は、PI3キナーゼファミリー77,88から運動失調性血管拡張症変異キナーゼ(ATM)によるSer-139におけるγ-H2AXヒストンのリン酸化である。興味深いことに、H2AXリン酸化は、リン酸化H2AX6に特異的な抗体を用いた病巣(γ-H2AX病巣)としての蛍光免疫技術によって容易に可視化することができる。6DSBとγ-H2AX病巣の数には1:1の関係があり、したがって、DSBマーカーであるγ-H2AX,は、病巣形成、サイズ、および量,,6、7、8、9、10、117の特性を通じて広範囲に研究されている。10,11689γ-H2AX病巣の形成は、53BP1(p53結合タンパク質1)、MDC1(DNA損傷チェックポイントのメディエーター)、BRCA1、Mre11/Rad50/Nbs1、PARP-1、および他の多くの修復因子などのDNA損傷応答(DDR)タンパク質およびクロマチン修飾因子の募集および蓄積につながる。これらのタンパク質はすべて、直接または間接結合1、11、12,11を介してγ-H2AXと12共に局地化する。

DNA損傷を検出し、適切な敏感なテストで修復することが重要であり、したがって、より注意が高い精度の技術13の開発に支払われます。DNA損傷および修復研究の文脈において、方法論はゲノムDNA損傷の敏感検出、損傷カテゴリーの記述、およびDNA損傷および修復機構の定量化13にとって極めて重要である。DNAを損傷した単一細胞を検出するために、彗星アッセイは、放射線生物学的研究14で一般的に使用される。他の利用可能な細胞遺伝学的方法は、二心、転位、アセントリックフラグメント、環状、クロマチド型収差、および微小染色体損傷(Mn)を含む染色体収差を認識する。放射線生物学で最も頻繁に使用される方法は、特に生物学的線量測定において、放射線15に対するその高い特異性による二心染色体アッセイである。例えば、古典的な分子法であるPCRは、検出されたDNA損傷の種類を認識できない。この場合、免疫学的方法は、抗原と抗体の間に特異的な反応があるため、感度レベルを通過する。免疫蛍光イメージングは、電離放射線16のようなDNA損傷剤に応答して、異なる病巣中の異なるタンパク質の出現に関する視覚的証拠を提供する。しかし、dna損傷応答17の関連においてさらなる分子研究のための適切な定量的方法であるリアルタイムPCRにより、損傷および修復タンパク質のmRNAレベルの活性化レベルを容易に検出できる。

γ-H2AX病巣が修復因子18を引き付けることを考慮し、細胞レベルでのDNA損傷および修復を監視するために、HRR経路からのNHEJ経路(DNA-PKcs)およびRad52からの代表的な修復タンパク質病巣の分析に基づいて、信頼性の高い免疫蛍光染色法を開発した。

ここでは、DNA-DSBの誘導・修復をモニタリングするための効率的かつ高感度な方法として、これらのタンパク質に対する免疫検出の利用を提案する。これまで、bnCTに対する中性子混合ビーム照射後の細胞レベルにおける修復タンパク質の病巣に基づくDNA-DSBに関する利用可能なデータは、γ-H2AXおよび53BP1マーカー19を除く。我々は、AIFが容易に検出可能であるため、DNA損傷分析のための標準的な細胞株として、DSB病巣に富んでいるため、HCT-116大腸癌細胞株の適応を提案する。この付着細胞株は、照射手順のために維持しやすく、適切である。提案された手順はγ-H2AX染色の一般的な免疫蛍光手順に関連する膨大な量の以前の研究に基づいている。しかし、各修復経路に属する各代表的なタンパク質に対して、試験された希釈を伴う適切な抗体の選択に関するすべての詳細が含まれる。さらに、BNCT療法で使用されるユニークな中性子混合ビームの利用について述べている。しかし、我々は、免疫蛍光染色を、先に,4、17を行った高コストの分子分析を用いて、両方の方法で研究4を拡張することを推奨する。

プロトコル

1. 細胞培養の準備と実験のセットアップ

  1. ヒト大腸癌細胞を維持し、HCT-116はサプライヤーが推奨する、製剤マッコイ2の5a培地変性の10mLを含む75cm2培養フラスコ中の単層で、10%のウシ胎児血清および1%の抗抗抗抗抗抗抗抗抗球溶液を添加した。
  2. 加湿した5%CO2環境で、2~3日毎に培地リニューアルで合流率の70%まで、37°Cで細胞を成長させます。
  3. BNCTビーム(例えば、中性子ビーム,+10BPA)および重粒子として癌細胞を殺し、ホウ素含有癌細胞内のそれらのエネルギーの大部分を沈着させるBNCT効果を得るために、 照射前日に、細胞培養培地にホウ素送達剤を添加する - 例えば、10BPA、4-ボロノ-L-フェニルアラニン(10μg 10 B/mL、0.925 mM最終)12~16時間(ボロンの最大取り込み)を照射前に、大腸癌細胞および甲状腺癌細胞2011に対して以前に研究した。21
    注:BNCT研究の場合にデータが存在しない別の細胞株を使用する場合は、最適なホウ素濃度を得るために各細胞株のホウ素取り込み量をテストしてください。ダゴサ群21により行われる誘導結合プラズマ光学発光分光(ICP-OES)による10BPA細胞取り込み測定を行う。
  4. 12-16時間のホウ素分娩後、培地を吸引し、10mLの1xPBSで細胞を洗浄する。その後、細胞に2mLのトリプシン-EDTA溶液を加えて細胞をトリプシンし、37°Cで5分間インキュベートし、細胞剥離を増強する。細胞が剥離し始めたら、完全な培地の10 mLを加えることによってトリプシン作用を停止する。
  5. 15 mLチューブ内の細胞懸濁液を吸引し、10 μLの細胞に0.4%のトリパンブルーを10 μL加え、計数スライドで10μLを混合し、アリクォートすることにより、自動化されたセルカウンターを使用して細胞をカウントします。培地の1 x 106細胞/mLの濃度に細胞懸濁液を希釈します。アリコート1 mLの細胞懸濁液1個当たりクライオチューブ
  6. 中性子の蛍光度のためのガンマ線線量と金箔の測定のための熱発光線量計(TLD)を準備し、照射前に凍結管または細胞培養フラスコにTLDを取り付けます。
  7. 施設の能力に応じて、培養フラスコ6またはクライオチューブに推奨される最小熱中性子フラックス5.9 x 1011(n/cm -2 min−1)4で1 x 10 6細胞/mLを中性子混合ビームで照射します。4
    メモ:照射時間を設定して、推奨中性子フラックスを得る。
  8. 照射後、35 mmペトリ皿または6ウェルプレートの22 x 22 mmのカバーリップに照射された細胞(1 x 106細胞/mL)の種子1mL、必要な培地の2 mLで補う。加湿した5%CO2環境で37°Cで最大3時間培養し、カバーリップに2付着させます。20倍の目的で反転した顕微鏡で、時々細胞の付着を観察します。
    注: HCT-116 細胞の最小密度は 600,000 セルをシードします。チャンバースライドを使用して迅速な染色手順のために、それに応じてセル密度を低減します。

2. 細胞の固定

  1. 細胞を照射してインキュベーションした後、取り付けられた細胞から培地を取り出し、PBS 2.5 mLで細胞を1回洗浄します。
  2. RTで10分間、70%エタノールの1mLで細胞を固定します。
    注:または以前に推奨されるように1%-3.7%パラホルムアルデヒド(PFA)を使用して固定します。プロトコルはここで一時停止されています。固定細胞を-20°Cの冷凍庫に保存し、数週間以上保存して、さらなる分析と免疫蛍光染色を行います。

3. 細胞の透過性

  1. 固定後、ペトリ皿からエタノールを取り除き、2.5 mLの1x PBSで洗浄します。
    注:リンスステップの間に細胞を乾燥させないでください。
  2. トリトンX-100/PBSの0.2%を1 mL加えて、ペトリ皿の細胞でカバーリップを覆います。
  3. RTで5分間インキュベートします。
  4. 2.5 mLの1x PBSで細胞3倍を洗浄します。
    注:必要に応じて、PBSのTriton X-100の割合を0.5%まで増やします(テストされた細胞株に依存して、より多くの病巣検出可能)。非特異的結合を避けるためにPBST(0.5%TweenのPBS)で追加のスッシュを行います。
  5. ブロック透過工程は、PBSで希釈した2%BSA(牛血清画分Vアルブミン)の1mLで、最低30分間または1%BSAで1時間インキュベートする。
    注:このステップは省略することができ、使用する抗体の種類に依存します。または、ref4で推奨される 5% FBS を使用します。

4. 免疫蛍光染色

  1. 推奨されるようBSA(2%牛血清分画Vアルブミン)でPBSで希釈された一次抗体(抗ɣH2AX、抗DNA-PKcs、および抗Rad52)を推奨する(サンプルあたり100 μLが必要)を追加します。
一次抗体関数推奨希釈ストレージ [°C]
抗ɣ-H2AXDNA-DSBの検出1:1000 (PBS-BSA)4
抗DNA-PKcsNHEJに属するDNA-PKcsタンパク質のRIFの検出1:200 (PBS-BSA)-20
アンチ・ラッド52HRRに属するRad52タンパク質のRIFの検出1:200 (PBS-BSA)-20
二次抗体分からない
アンチマウス IgG FITCɣ-H2AX フォチ1:400 (PBS-BSA)4
ヤギアンチラビットIgG H&L (アレクサフルーター488)NHEJおよびHRR修復タンパク質の病巣1:500 (PBS-BSA)-20

表1:セクション4で使用される抗体の使用に関する推奨希釈および注意事項。

  1. ペトリ皿を覆い、蒸留水を使用して保湿リグニンでプラスチックボックスの湿度を維持し、インキュベーターで37°Cで30分間インキュベートします。
    注: プロトコルはここで一時停止することができます。インキュベーションは、一晩4°Cで行うことができる。
  2. インキュベーション後、2.5 mLのPBSで3つのスリーチを行います。
    注: リンスのステップ中にスライドが乾かないようにしてください。
  3. BSAでPBSで希釈した二次抗体(抗マウスIgG FITC、ヤギ抗ウサギIgG(アレクサフルーター488)を添加(表1参照)(1サンプルあたり100μLが必要)これと次の手順では、暗闇の中で動作します。
  4. ペトリ皿を再び覆い、保湿リグニンでプラスチックボックスの湿度を維持し、インキュベーターで37°Cで最低30分間インキュベートします。
  5. インキュベーション後、2.5 mLのPBSで3つのスリーチを行います。
  6. PBSで希釈したDAPIの100 μLを1μg/mLの最終濃度に加えて、核に対抗します。
  7. まもなく、RTで最大2分間インキュベートします。
  8. インキュベーション後、2.5 mLのPBSで3つのスリーチを行います。
  9. PBSを取り外し、取り付け媒体の上部にカバースリップをそっと置き、マニキュアでカバースリップの気泡とシールエッジの形成を避けます。ワニスが乾燥し、周りのカバースリップをペイントするまで待ちます。
  10. 蛍光顕微鏡で画像分析を行う前に、取り付け媒体(最大3時間)の硬化を待ちます。
    注: プロトコルはここで一時停止することができます。暗闇の中で4°Cのプラスチック製の箱にガラススライドを保管してください。

5. 画像の取得と解析

  1. 浸漬オイルで100xの目的の下で蛍光顕微鏡で画像を取得します。
    1. 次のフィルターを装備した蛍光顕微鏡で核内の病巣を分析する:アレクサFluor 488:励起⁄放出(nm):496/519、発光色緑色;DAPI: 励起⁄放出(nm):358⁄461、発光色ブルー。
      注: 単粒子トラックに沿った DSB の分析には、高い解像度の共焦点レーザー走査顕微鏡のような高度な顕微鏡検査が必要な場合があります。
  2. 取得した画像を保存し、適切なイメージングソフトウェアを使用して処理します。3,20
    注:個々のバイオインフォマティクスソフトウェアの自動分析または開発/購入のために開発された個々のマクロやプラグインの使用をお勧めします。
  3. Image-Pro ソフトウェアを使用してフォリッチ解析を行う場合は、TIFF ファイルで画像を処理する:[カウント/サイズボタン]を選択し、[種類]をクリックして[測定の種類(直径または面積の設定)]、範囲[測定範囲の設定]をクリックし、必要に応じてオブジェクトを分割します。明るさを調整するには、[明るい]をクリックします。次に[赤いボタン]をカウントをクリックします。
  4. データをエクスポートするには、データ テーブル |統計 |Excel にエクスポートします。スプレッドシート ソフトウェアで、必要な統計分析を使用してグラフを描画します。

結果

まず、DNA-DSBの検出、大腸癌細胞におけるγH2AX病巣、非放射、中性子混合ビームの標準的マーカーの解析を行った。γ-H2AX病巣は、別個の蛍光ドットとして現れ、DNA-DSBの形成を示す(各γ-H2AX蛍光ドットが単一のDSBを表す)(図1を参照)。

figure-results-245
図1:細胞株HCT-116の大腸?...

ディスカッション

γ-H2AXおよび53BP1に対して免疫染色された病巣の周波数は、放射線生物学において一般的に使用され、DNA-DSB数と関連しており、DNA-DSBs19の誘導および修復をモニタリングするための効率的で敏感な19マーカーと考えられている。γ-H2AXおよび53BP1の共染色手順は、DNA-DSBの検出のための標準的な手順である。23しかしながら、異なる細胞株はγ-H2AX/53BP1病巣

開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

中性子/ガンマ線で構成された中性子混合ビームは、ポーランド国立原子核研究センターのマリア研究炉からアクセスされた。K.M.O.は、ポーランド国立科学センター(Miniatura 2)助成金#2018/02/X/NZ5/02849によって支援されました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
12 mm CoverslipsVWR89015-725
35 mm Petri dishesSarstedt7.183.390.000
4-Borono-L-phenylalanineSIGMA-ALDRICH17755
Antibiotic-Antimycotic (100X)Gibco15240062
Anti-DNA PKcs (phospho S2056) antibody - ChIP GradAbcamAB18192
Anti-Mouse IgG (whole molecule)–FITC antibody produced in goatSIGMA-ALDRICHF0257
Anti-phospho-Histone H2A.X (Ser139) Antibody, clone JBW301MerckMillipore05-636
Anti-RAD52 antibodyAbcamAB117097
Bovine Serum Albumin Fraction V (BSA)RocheBSAV-RO
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)ThermoFisher SCIENTIFICD1306
Fetal Bovine Serum (Heat Inactivated)SIGMA-ALDRICHF9665
Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488)AbcamAB150077
HCT-116 cell lineATCCCCL-247™
ImageJNational Institute of Health (NIH)https://imagej.nih.gov/ij/
Image ProMedia cyberneticshttp://www.mediacy.com/imagepro
LUNA II Automated Cell CounterLogos BiosystemsL40002
McCoy’s 5A Medium (Modified, with L-glutamine and sodium bicarbonate)SIGMA-ALDRICHM9309
microscope slidesThermoFisher SCIENTIFICB-1198
Phosphate Buffered Saline (PBS)Hirszfeld Institute of Immunology and Experimental Therapy, PAS20.59.52.0
Triton X-100SIGMA-ALDRICHX100
Trypan Blue Stain, 0.4%Logos BiosystemsT13001
Trypsin-EDTA solution 0.25%SIGMA-ALDRICHT4049

参考文献

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