JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

המושרה קרינה נזק DNA תגובה המופעלת על ידי מעורב נייטרון קרן המשמש בטיפול בורון נייטרון לכידת (BNCT) לא הוקמה במלואה. פרוטוקול זה מספק הליך צעד אחר צעד כדי לזהות וקדי המושרה קרינה (רי ' ף) של תיקון חלבונים על ידי immunofluorescence כתמים של סרטן המעי הגס האנושי התאים לאחר הקרנה עם הקורה מעורב נייטרונים.

Abstract

המטרה של כתב היד היא לספק פרוטוקול צעד אחר צעד לביצוע מיקרוסקופ אימונולואוורנסנציה כדי ללמוד את הקרינה המושרה DNA התגובה הנגרמת על ידי נייטרון-גמא מעורב-קרן המשמש לכידת בורון נייטרון (BNCT). באופן ספציפי, המתודולוגיה המוצעת מוחל על איתור חלבונים תיקון הפעלה אשר ניתן לדמיין כמו וקדי באמצעות נוגדנים ספציפיים הפסקות dna כפול סטרנד (dna-dsbs). תיקון DNA וקדי העריכו על ידי immunofluorescence בתאי סרטן המעי הגס (hct-116) לאחר הקרנה עם הקורה מעורב נייטרונים. DNA-DSBs הם נגעים הגנותיים ביותר והם מתוקנים בתאי היונקים על ידי שני מסלולים עיקריים: לא הומוולוגי המעבר מסלול (NHEJ) ותיקון שילוב מחדש הומוולוגי (HRR). התדרים של foci, חיסוני כימית, עבור סמנים בשימוש נפוץ ברדיוביולוגיה כמו γ-H2AX, 53BP1 קשורים עם מספר ה-DNA-DSB נחשבים סמנים יעיל ורגיש עבור ניטור אינדוקציה ותיקון של DNA-Dsb. הוא הוקם כי γ-H2AX וקדי למשוך חלבונים תיקון, המוביל ריכוז גבוה יותר של גורמי תיקון ליד dsb. כדי לנטר נזק לדנ א ברמה התאית, ניתוח immunofluorescence לנוכחות של DNA-PKcs הנציג לתקן חלבון וקדי מהשביל nhej ו Rad52 מהשביל hrr תוכנן. פיתחנו והציג פרוטוקול אמין immunofluorescence כתמים לזיהוי של הקרינה הנגרמת נזק DNA התגובה עם נוגדנים ספציפיים עבור גורמי תיקון משעולים nhej ו hrr ונצפו וקדי המושרה קרינה (ריף). המתודולוגיה המוצעת ניתן להשתמש לחקירת חלבון תיקון כי הוא מופעל מאוד במקרה של קרינה מעורבת-קרן הקורה, ובכך לציין את הדומיננטיות של מסלול התיקון.

Introduction

המושרה קרינה נזק DNA תגובה המופעלת על ידי מעורב נייטרון קרן המשמש בטיפול בורון נייטרון לכידת (BNCT) לא נקבע במלואו. פרוטוקול זה מספק הליך צעד אחר צעד כדי לבצע את הזיהוי של וקדי המושרה קרינה (ריף) של תיקון חלבונים על-ידי immunofluorescence מכתים כגון, בתור סרטן המעי הגס האנושי לאחר הקרנה עם הקורה מעורב נייטרונים.

קרינה מייננת (IR) משרה המון סוגים שונים של נזק DNA (DNA-DSBs, DNA-SSBs, בסיס DNA נזק) מתוך איזה הפסקות ה-DNA כפול הגדיל הם נגעים DNA הגנוסיים ביותר1. הפסקות שאינן מתוקנים יכולות לגרום למוות תאים, בעוד שהפסקות מטעות מעלה את ההסתברות לסידור מחדש של כרומוזום, מוטזיס ואובדן מידע גנטי מכריע. התגובה נזק מסלולים להגיב dsbs כוללים מסלולים של תיקון DNA כמו לא הומוולוגי הצטרפות (nhej), מנגנון הדורש Ku 70/80, dna – PKcs, Xrcc4, ו-DNA ליגאז IV כגורמי2מפתח 2,3,4,5,6. ב יונקים, הנתיב השני הראשי תיקון DNA הוא הומוולוגי תיקון שילוב (hrr) מסלול אשר דורש רכיבי מפתח-Rad52 אפיסטזה גן המשפחה – Rad51, Rad52, Rad54, Rad55, Rad57 ו-Rad587. Rad51 ו Rad54 הם גורמים מרכזיים שילוב מחדש של האנושי מעורב מנגנוני תיקון הקשורים למתח שכפול והפסקות DNA ב eukaryotes. מעניין, זה היה ציין כי downregulation של מסלול HRR משפר את מסלול NHEJ אשר מועדת שגיאה הצבעה על רלוונטיות מסלול HR עבור יציבות הגנום8.

הצעד הראשון של היווצרות dsbs הוא זרחון של γ-H2AX היסטון ב Ser-139 על ידי אטקסיה telangiectasia מוטציה קינאז (כספומט) ממשפחת PI3 קינאז7,8. מעניין, H2AX זרחון יכול להיות מדמיין בקלות על ידי טכניקת immunofluorescence כמו וקדי (γ-H2AX וקדי) באמצעות נוגדנים ספציפיים עבור זרחליום H2AX6. יש קשר 1:1 בין מספר dsbs ו γ-H2AX וקדי, ולכן, סמן dsbs, γ-H2AX, הוא למד בהרחבה באמצעות האפיון של היווצרות וקדי, גודל, וכמות6,7,8,9,10,11. היווצרות של γ-H2AX וקדי מוביל גיוס והצטברות של תגובה נזק DNA (DDR) חלבונים כרומטין-שינוי גורמים, כגון 53 bp1 (p53 מחייב חלבון 1), MDC1 (מגשר של מחסום נזק DNA), BRCA1, Mre11/Rad50/Nbs1, parp-1, ורבים אחרים לתקן גורמים ובכך יוצרים וקדי המושרה קרינה (ריף). כל אלה חלבונים שיתוף לוקליזציה עם γ-H2AX באמצעות קשירה ישירה או עקיפה1,11,12.

חשוב לזהות נזק DNA ולתקן עם מבחן רגיש הנכון, ולכן, יותר תשומת לב משולם לפיתוח של טכניקות מדויקות מאוד13. בהקשר של נזק DNA ולימודי תיקון, המתודולוגיה היא חיונית לאיתור רגיש של נזק DNA הגנום, תיאור של הקטגוריה נזק, ו כימות של DNA נזק ותיקון מנגנונים13. כדי לזהות תאים בודדים עם DNA פגום, שיטת השביט משמש בדרך כלל במחקרים רדיוביולוגיה14. שיטות אחרות ציטוגנטיות זמינות לזהות סטיות כרומוזומלית, כולל dicentrics, טרנסמייקומים, שברי האקצנטרי, טבעות, ו כרומאטיד הסוג סטיות, ו מיקרורוקליוס נזק כרומוזום (Mn). השיטה הנפוצה ביותר ברדיוביולוגיה, בעיקר בקרינה ביולוגית, היא שיטת הכרומוזום הדיצנטרי בשל הייחוד הגבוה שלה לקרינהבת 15. לדוגמה, ה-PCR, שיטה מולקולרית קלאסית, אינה יכולה לזהות את סוג הנזק לדנ א שזוהה. במקרה זה, שיטות אימונומטרי לעבור את רמת הרגישות כי התגובות הן ספציפיות בין האנטיגן והנוגדן. הדמיה immunofluorescence מספק ראיות חזותיות למראה של חלבונים שונים בתוך וקדי ברורים בתגובה לסוכנים הפוגעים DNA כמו קרינה מייננת16. עם זאת, רמות ההפעלה של נזק ותיקון חלבונים ' רמות mRNA ניתן לגילוי בקלות על ידי PCR בזמן אמת אשר היא שיטה כמותית נאותה למחקרים מולקולריים נוספים בהקשר של נזק DNA תגובה17.

נטילת בחשבון כי γ-H2AX וקדי מושכים לתיקון גורמים18, כדי לפקח על נזק DNA ותיקון ברמה התאית, פיתחנו הליך אמין immunofluorescence מבוסס על הניתוח של הנציג תיקון חלבון וקדי מן המסלול nhej (DNA-PKcs) ו Rad52 מהשביל hrr.

כאן, אנו מציעים את השימוש בזיהוי חיסוני עבור חלבונים אלה כמו הליך יעיל ורגיש עבור ניטור DNA-DSB אינדוקציה ותיקון. עד עכשיו, לא היו נתונים זמינים ב-DNA-dsbs מבוסס על וקדי של תיקון חלבונים ברמה התאית לאחר הקרנה מעורב נייטרון קרן עבור BNCT, למעט γ-H2AX ו-53 bp1 סמנים19. אנו ממליצים על הסתגלות של קו הסרטן HCT-116 המעי הגס, כפי שהוא עשיר עצמו ב-DSBs foci, כמו קו תא סטנדרטי עבור ניתוח DNA נזק, כי RIFs הם לזיהוי בקלות. קו התאים החסיד הזה קל לתחזוקה ולהליך הקרנה. ההליך המוצע מבוסס על כמות עצומה של מחקרים קודמים הקשורים להליך החיסונית הכללית של γ-H2AX כתמים. עם זאת, הוא כולל את כל הפרטים לגבי הבחירה של נוגדנים מתאימים עם מדלל נבדק עבור כל חלבון מייצג שייך לכל מסלול תיקון. כמו-כן, היא מתארת את הניצול של קרן נייטרון מעורבת ייחודית המשמשת בטיפול BNCT. עם זאת, אנו ממליצים להאריך את המחקרים עם שתי השיטות, immunofluorescence כתמים ראשית ולאחר מכן, עם ניתוח מולקולרי בעלות גבוהה כפי שבוצעה בעבר4,17.

Protocol

1. הכנת תרבות התאים והגדרת הניסוי

  1. לשמור על התאים האנושיים סרטן המעי הגס, HCT-116 כפי שמומלץ על ידי הספק, ב monolayers ב 75 ס מ2 התרבות מבחנות המכיל 10 מ ל של המדיום של 5a ניסח של מקוי השתנה, שיושלם עם 10% סרום שור העובר 1% אנטיביוטיקה פתרון antimycotic.
  2. לגדול תאים בתוך מחולל שהוא 5%שיתוף הסביבה ב 37 ° c עד 70% השטף עם התחדשות בינונית מדי 2 עד 3 ימים.
  3. כדי להשיג BNCT,21קרן (למשל, קרן נייטרון פלוס 10BPA) ו BNCT ההשפעה של הריגת תאים סרטניים כמו חלקיקים כבדים להפקיד את רוב האנרגיה שלהם בתוך בורון המכיל תאים סרטניים, יום לפני הקרנה, להוסיף סוכן משלוח בורון למדיום תרבות התא – למשל, 10BPA, 4-בוראונו-L-פנילאלנין (10 μg 10B/mL, 0.925 מ"מ הסופי) 12 – 16 h (ספיגה מקסימלית של בורון) לפני ההקרנה, כפי שנחקרו בעבר עבור תאים סרטניים בבלוטת התריסתאים
    הערה: אם נעשה שימוש בשורה תא אחרת, שעבורה לא קיימים נתונים במקרה של מחקר BNCT, בדוק את ספיגת הבור עבור כל קו תא כדי לקבל ריכוז אופטימלי של בורון. למדוד את 10BPA קליטת הסלולר על ידי השראה מצמידים פלזמה פליטת פלסמה (הקאמרי הסלולרי) כפי שבוצעה על ידי קבוצת dagrosa21.
  4. לאחר 12-16 h של משלוח בורון, מטפי את המדיום ולשטוף את התאים עם 10 מ ל של 1x PBS. לאחר מכן, טריזיציזציה של התאים על-ידי הוספת 2 מ ל מפתרון טריפסין-EDTA לתאים ומודיית עבור 5 דקות ב-37 ° צ' כדי לשפר את הניתוק התאי. כאשר התאים מתחילים להתנתק, לעצור את הפעולה טריפסין על ידי הוספת 10 mL של בינוני מלא.
  5. מנושף את הבולם הסלולרי בצינור 15 מ ל ולספור את התאים באמצעות מונה תאים אוטומטי על-ידי הוספת 10 μL של 0.4% טריפי כחול ל 10 μL של תאים, לערבב, ומצטט 10 μL בשקופית ספירה. לדלל את ההשעיה התא לריכוז של 1 x 106 תאים/mL של המדיום. מחלק 1 מ ל של השעיית תא לקריומטר.
  6. הכינו את thermoluminescent (Tds) למדידה של מינונים של קרני גמא ומטילי זהב לפלוטים של נייטרונים וחברו את הקלדים להקפאה או לתוך הבקבוקון של תרבות התא לפני ההקרנה.
  7. הקרן 1 x 106 תאים/mL עם הקורה מעורב נייטרון על השטף המומלץ מינימלי ניטרוטרונים של 5.9 x 1011 (n/cm-2 דקות- 1)4 במבחנות תרבות או קריוצינורות בהתאם ליכולות המתקן.
    הערה: הגדר את זמן ההקרנה לפני השגת שטף נויטרוני מומלץ.
  8. לאחר הקרנה, זרע 1 מ ל של תאים לקרינה (1 x 106 תאים/ml) על 22 x 22 מ"מ שמיכות ב 35 mm מנות פטרי או 6 לוחות היטב, תוספת עם 2 מ ל של המדיום הנדרש. התאים הכליים עבור מקסימום של 3 h ב 37 ° c בתוך מחולל לחות 5% CO2 הסביבה לתת להם לצרף את הכיסויים. שימו לב להחזקה של תאים מפעם לפעם תחת מיקרוסקופ הפוך עם המטרה 20x.
    הערה: עבור התאים HCT-116 צפיפות מינימלית היא 600,000 תאים לזרעים. לצביעת מהיר יותר הליך שימוש שקופיות קאמרית, להפחית את צפיפות התא בהתאם.

2. קיבוע תאים

  1. לאחר הקרנה ודגירה של תאים, להסיר את המדיום מן התאים המחוברים ולשטוף את התאים פעם אחת עם 2.5 mL של PBS.
  2. תקן תאים עם 1 מ ל של 70% אתנול עבור 10 דקות ב RT.
    הערה: לחלופין, השתמש ב-1%-3.7% פאראפורמלדהיד (בכיוון ההוא) לקיבוע כמומלץ בעבר19. הפרוטוקול מושהה כאן. לאחסן תאים קבועים באתנול במקפיא ב-20 ° c עבור לא יותר מכמה שבועות לניתוח נוסף וכתמים אימונוofor, מובחנות.

3. החדירות של התאים

  1. לאחר קיבעון להסיר אתנול מצלחת פטרי ולשטוף עם 2.5 mL של 1x PBS.
    הערה: אל תתנו לתאים להתייבש בין צעדי השטיפה.
  2. להוסיף בעדינות 1 מ ל של 0.2% של טריטון X-100/PBS לכסות את הכיסויים עם תאים בצלחות פטרי.
  3. דגירה עבור 5 דקות ב RT.
  4. לשטוף את התאים 3x עם 2.5 mL של 1x PBS.
    הערה: הגדל את אחוז הטריטון X-100 ב-PBS עד 0.5% אם יש צורך (יותר מיותר לזיהוי, תלוי בקו התא נבדק). בצע שוטף נוסף עם PBST (PBS עם 0.5% יצירת רצף) כדי למנוע איגוד מסוים.
  5. שלב החדירות לחסום עם 1 מ ל של 2% BSA (סרום שור השבר V אלבומין) מדולל ב-PBS ו-דגירה עבור מינימום של 30 דקות או 1 h עם 1% BSA.
    הערה: ניתן להשמיט שלב זה והוא תלוי בסוג הנוגדן המשמש. לחילופין, השתמש ב-5% FBS כמומלץ ב-ref4.

4. כתמים אימונולואונסנציה

  1. להוסיף את הכמות הנכונה של הנוגדן העיקרי (Anti-ɣ-H2AX, אנטי-DNA-PKcs, ו Anti-Rad52) מדולל ב-PBS עם BSA (2% סרום שור השבר V אלבומין) כמומלץ (ראה טבלה 1 עם דילול מומלץ) (100 μl נדרש לכל מדגם).
נוגדן ראשיפונקציהמומלץ דילולאחסון [° c]
אנטי-ɣ-H2AXזיהוי של ה-DNA-DSBs1:1000 (PBS-BSA)4
אנטי-DNA-PKcsזיהוי של RIFs חלבון ה-DNA-PKcs שייך NHEJ1:200 (PBS-BSA)? בן כמה אתה. עשרים
אנטי Rad52זיהוי של RIFs של חלבון Rad52 השייכים ל-HRR1:200 (PBS-BSA)? בן כמה אתה. עשרים
נוגדן משנילהיות לא מיודע
מניעת העכבר-IgG FITCɣ-H2AX וקדי1:400 (PBS-BSA)4
עז אנטי-ראביט & L (אלקסה Fluor 488)עבור NHEJ ו HRR לתקן חלבונים מסוימים1:500 (PBS-BSA)? בן כמה אתה. עשרים

טבלה 1: דילול מומלץ והערות לשימוש בנוגדנים בסעיף 4.

  1. לכסות את צלחת פטרי לשמור על לחות בקופסת פלסטיק עם לחות ליגנין באמצעות מים מזוקקים ו דגירה עבור 30 דקות ב 37 ° c בחממה.
    הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן. ניתן לבצע דגירה ב-4 ° c עבור הלילה.
  2. לאחר דגירה לבצע 3 שוטף עם 2.5 mL של PBS.
    הערה: אל תאפשר לשקופית להתייבש במהלך צעדי שטיפה.
  3. להוסיף את הכמות הנכונה של הנוגדן המשני (אנטי עכבר FITC, משחק עז נגד ארנב (אלקסה Fluor 488) מדולל ב-PBS עם BSA (לראות את הטבלה 1) (100 μl נדרש לכל מדגם). בשביל זה והשלבים הבאים פועלים בחשכה.
  4. לכסות את צלחת פטרי שוב כדי לשמור על לחות בקופסת פלסטיק עם ליגנין לחות ו דגירה עבור 30 דקות מינימום ב 37 ° c בחממה.
  5. לאחר דגירה לבצע 3 שוטף עם 2.5 mL של PBS.
  6. הוסף 100 μL של DAPI מדולל ב-PBS לריכוז הסופי של 1 μg/mL כדי להכתים את הגרעינים.
  7. דגירה בקרוב, עבור מקסימום של 2 דקות בשעה RT.
  8. לאחר דגירה לבצע 3 שוטף עם 2.5 mL של PBS.
  9. להסיר את ה-PBS ובעדינות לשים שמיכות על החלק העליון של בינוני הרכבה, הימנעות היווצרות בועות אוויר הקצוות חותם של שמיכות עם לק ציפורניים. חכה עד שציפוי הלכה יתייבש. ויצייר את הסרבל בסביבה
  10. המתן לחיסום של מדיום ההרכבה (עד 3 שעות) לפני ניתוח תמונה תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטית.
    הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן. לאחסן שקופיות זכוכית בתוך קופסת פלסטיק ב -4 ° c בחשיכה.

5. רכישת תמונה וניתוח

  1. לרכוש תמונות עם מיקרוסקופ פלואורסצנטית תחת מטרה 100x עם שמן טבילה.
    1. לנתח וקדי בגרעין עם מיקרוסקופ פלואורסצנטית מצויד במסננים הבאים עבור: אלקסה fluor 488: עירור ⁄ פליטה (nm): 496/519, פליטת צבע ירוק; DAPI: עירור ⁄ פליטה (nm): 358 ⁄ 461, פליטת צבע כחול.
      הערה: ניתוח dsbs לאורך מסלולים חד-חלקיק עשוי לדרוש מיקרוסקופ מתקדם כמו מיקרוסקופ לייזר קונפוקלית עם רזולוציה גבוהה יותר.
  2. שמור תמונות ותהליכים שנרכשו עם תוכנת דימות מתאימה לדוגמה, imagej או תמונה Pro3,20.
    הערה: מומלץ להשתמש בפקודות מאקרו ובתוספים בודדים שפותחו לצורך ניתוח אוטומטי או פיתוח/רכישה של תוכנות ביוטיות בודדות.
  3. אם באמצעות התוכנה Image-Pro עבור ניתוח וקדי, לעבד תמונות בקובצי TIFF: בחר לחצן ספירה/גודל , לאחר מכן לחץ על סוגים [בחר את סוג המדידה (לדוגמה, קוטר או אזור)], לחץ על טווחים [קבע טווח של המדידה], לחץ על פצל אובייקטים במידת הצורך. כדי לכוונן את הבהירות, לחץ על בהיר [התאם את treshold]. לאחר מכן לחץ על ספירה [כפתור אדום].
  4. כדי לייצא נתונים, לחץ על טבלת נתונים | נתונים סטטיסטיים | ייצוא ל-Excel. בתוכנת הגיליון האלקטרוני, צייר גרפים באמצעות הניתוח הסטטיסטי הנדרש.

תוצאות

ראשית, אנו ביצעו ניתוח של סמן סטנדרטי של זיהוי של DNA-dsbs, γH2AX וקדי בתאי סרטן המעי הגס, לא מוקרן, ו הקרינה עם קרן נייטרון-מעורב. γ-H2AX וקדי מופיעים נקודות פלורסנט נפרדות ולהראות את היווצרות של ה-DNA-dsbs (כמו כל נקודה הניאון γ H2AX מייצג dsbs יחיד) (ראה איור 1).

Discussion

התדרים של foci, חיסוני מוכתם כימית עבור γ-H2AX ו-53BP1 משמשים בדרך כלל רדיוביולוגיה והם קשורים עם DNA-DSB מספר נחשבים כמו סמנים יעילים ורגישים עבור ניטור אינדוקציה ותיקון של DNA-Dsb19. הליך שיתוף הצביעת של γ-H2AX ו-53bp1 הוא הליך סטנדרטי לזיהוי של DNA-dsbs. היווצרות γ-H2AX וקדי משויך גיוס של 53bp1, מווסת ש?...

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgements

נייטרון-קרן מעורבת המורכבת מקרינת נייטרון/גמא הגישה מתוך הכור למחקר מריה במרכז הלאומי למחקר גרעיני בפולין. K.M.O. היה נתמך על ידי המרכז הלאומי למדע, פולין (Miniatura 2) מענק no. #2018/02/X/5/02849.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
12 mm CoverslipsVWR89015-725
35 mm Petri dishesSarstedt7.183.390.000
4-Borono-L-phenylalanineSIGMA-ALDRICH17755
Antibiotic-Antimycotic (100X)Gibco15240062
Anti-DNA PKcs (phospho S2056) antibody - ChIP GradAbcamAB18192
Anti-Mouse IgG (whole molecule)–FITC antibody produced in goatSIGMA-ALDRICHF0257
Anti-phospho-Histone H2A.X (Ser139) Antibody, clone JBW301MerckMillipore05-636
Anti-RAD52 antibodyAbcamAB117097
Bovine Serum Albumin Fraction V (BSA)RocheBSAV-RO
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)ThermoFisher SCIENTIFICD1306
Fetal Bovine Serum (Heat Inactivated)SIGMA-ALDRICHF9665
Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488)AbcamAB150077
HCT-116 cell lineATCCCCL-247™
ImageJNational Institute of Health (NIH)https://imagej.nih.gov/ij/
Image ProMedia cyberneticshttp://www.mediacy.com/imagepro
LUNA II Automated Cell CounterLogos BiosystemsL40002
McCoy’s 5A Medium (Modified, with L-glutamine and sodium bicarbonate)SIGMA-ALDRICHM9309
microscope slidesThermoFisher SCIENTIFICB-1198
Phosphate Buffered Saline (PBS)Hirszfeld Institute of Immunology and Experimental Therapy, PAS20.59.52.0
Triton X-100SIGMA-ALDRICHX100
Trypan Blue Stain, 0.4%Logos BiosystemsT13001
Trypsin-EDTA solution 0.25%SIGMA-ALDRICHT4049

References

  1. Carter, R. J., et al. Complex DNA Damage Induced by High Linear Energy Transfer Alpha-Particles and Protons Triggers a Specific Cellular DNA Damage Response. International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 100 (3), 776-784 (2018).
  2. Kondo, N., et al. DNA damage induced by boron neutron capture therapy is partially repaired by DNA ligase IV. Radiation Environmental Biophysics. 55 (1), 89-94 (2016).
  3. Sakai, W., Sugasawa, K. DNA Damage Recognition and Repair in Mammalian Global Genome Nucleotide Excision Repair. DNA Replication, Recombination, and Repair: Molecular Mechanisms and Pathology. , 155-174 (2016).
  4. Rodriguez, C., et al. In vitro studies of DNA damage and repair mechanisms induced by BNCT in a poorly differentiated thyroid carcinoma cell line. Radiation Environmental Biophysics. 57 (2), 143-152 (2018).
  5. Sollazzo, A., et al. Live Dynamics of 53BP1 Foci Following Simultaneous Induction of Clustered and Dispersed DNA Damage in U2OS Cells. International Journal of Molecular Sciences. 19 (2), (2018).
  6. Jeggo, P., Löbrich, M. Radiation-induced DNA damage responses. Radiation Protection Dosimetry. 122 (1-4), 124-127 (2006).
  7. Sigurdsson, S., Van Komen, S., Petukhova, G., Sung, P. Homologous DNA pairing by human recombination factors Rad51 and Rad54. The Journal of Biological Chemistry. 277 (45), 42790-42794 (2002).
  8. Choi, E. H., Yoon, S., Hahn, Y., Kim, K. P. Cellular Dynamics of Rad51 and Rad54 in Response to Postreplicative Stress and DNA Damage in HeLa Cells. Molecules and Cells. 40 (2), 143-150 (2017).
  9. Burma, S., Chen, B. P., Murphy, M., Kurimasa, A., Chen, D. J. ATM phosphorylates histone H2AX in response to DNA double-strand breaks. The Journal of Biological Chemistry. 276 (45), 42462-42467 (2001).
  10. Nakamura, T. M., Du, L. L., Redon, C., Russell, P. Histone H2A phosphorylation controls Crb2 recruitment at DNA breaks, maintains checkpoint arrest, and influences DNA repair in fission yeast. Molecular and Cellular Biology. 24 (14), 6215-6230 (2004).
  11. Kuo, L. J., Yang, L. X. Gamma-H2AX - a novel biomarker for DNA double-strand breaks. In Vivo. 22 (3), 305-309 (2008).
  12. Sage, E., Shikazono, N. Radiation-induced clustered DNA lesions: Repair and mutagenesis. Free Radical Biology and Medicine. 107, 125-135 (2017).
  13. Boguszewska, K., Szewczuk, M., Urbaniak, S., Karwowski, B. T. Review: immunoassays in DNA damage and instability detection. Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (23), 4689-4704 (2019).
  14. Møller, P., et al. Potassium bromate as positive assay control for the Fpg-modified comet assay. Mutagenesis. , (2020).
  15. Sommer, S., Buraczewska, I., Kruszewski, M. Micronucleus Assay: The State of Art, and Future Directions. International Journal of Molecular Sciences. 21 (4), 1534 (2020).
  16. Bennett, B. T., Bewersdorf, J., Knight, K. L. Immunofluorescence imaging of DNA damage response proteins: optimizing protocols for super-resolution microscopy. Methods. 48 (1), 63-71 (2009).
  17. Cheng, L., et al. Simultaneous induction of dispersed and clustered DNA lesions compromises DNA damage response in human peripheral blood lymphocytes. PLoS One. 13 (10), 0204068 (2018).
  18. Paull, T. T., et al. A critical role for histone H2AX in recruitment of repair factors to nuclear foci after DNA damage. Current Biology. 10 (15), 886-895 (2000).
  19. Okumura, K., et al. Relative biological effects of neutron mixed-beam irradiation for boron neutron capture therapy on cell survival and DNA double-strand breaks in cultured mammalian cells. Journal of Radiation Research. 54 (1), 70-75 (2013).
  20. Dagrosa, M. A., et al. First evaluation of the biologic effectiveness factors of boron neutron capture therapy (BNCT) in a human colon carcinoma cell line. International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 79 (1), 262-268 (2011).
  21. Dagrosa, A., et al. Studies for the application of boron neutron capture therapy to the treatment of differentiated thyroid cancer. Applied Radiation and Isotopes. 69 (12), 1752-1755 (2011).
  22. Reynolds, P., et al. The dynamics of Ku70/80 and DNA-PKcs at DSBs induced by ionizing radiation is dependent on the complexity of damage. Nucleic Acids Research. 40 (21), 10821-10831 (2012).
  23. Rasche, L., et al. Analysis of Lymphocytic DNA Damage in Early Multiple Sclerosis by Automated Gamma-H2AX and 53BP1 Foci Detection: A Case Control Study. PLoS One. 11 (1), 0147968 (2016).
  24. Banáth, J. P., Macphail, S. H., Olive, P. L. Radiation sensitivity, H2AX phosphorylation, and kinetics of repair of DNA strand breaks in irradiated cervical cancer cell lines. Cancer Research. 64 (19), 7144-7149 (2004).
  25. Barth, R. F., et al. Current status of boron neutron capture therapy of high grade gliomas and recurrent head and neck cancer. Radiatiation Oncology. 7, 146 (2012).
  26. Mirzaei, H. R., et al. Boron neutron capture therapy: Moving toward targeted cancer therapy. Journal of Cancer Research and Therapeutics. 12 (2), 520-525 (2016).
  27. Vitti, E. T., Parsons, J. L. The Radiobiological Effects of Proton Beam Therapy: Impact on DNA Damage and Repair. Cancers. 11 (7), 946 (2019).
  28. Mohamad, O., et al. Carbon Ion Radiotherapy: A Review of Clinical Experiences and Preclinical Research, with an Emphasis on DNA Damage/Repair. Cancers. 9 (6), 66 (2017).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

160BNCTDNA DSBsfociDNA

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved