Immunofluorescenza Immagini di danno al DNA e riparazione Foci nelle cellule tumorali del colon umano

Riepilogo

La risposta al danno del DNA indotta dalle radiazioni attivata dal fascio misto di neutroni utilizzato nella terapia di cattura di neutroni boronica (BNCT) non è stata completamente stabilita. Questo protocollo fornisce una procedura graduale per rilevare i foci indotti da radiazioni (RIF) delle proteine di riparazione mediante colorazione immunofluorescenza nelle linee cellulari del cancro del colon umano dopo l'irradiazione con il fascio di neutroni misto.

Abstract

Lo scopo del manoscritto è quello di fornire un protocollo graduale per l'esecuzione della microscopia immunofluorescenza per studiare la risposta al danno del DNA indotta dalle radiazioni indotta dal fascio misto neutro-gamma utilizzato nella terapia di cattura di neutroni boro (BNCT). In particolare, la metodologia proposta viene applicata per il rilevamento dell'attivazione delle proteine di riparazione che può essere visualizzata come foci utilizzando anticorpi specifici per le rotture del DNA a doppio filamento (DNA-DSB). I foci di riparazione del DNA sono stati valutati dall'immunofluorescenza nelle cellule tumorali del colon (HCT-116) dopo l'irradiazione con il fascio misto di neutroni. I DNA-DSB sono le lesioni più genotosine e vengono riparate nelle cellule dei mammiferi da due vie principali: la via di giunzione finale non omologa (NHEJ) e la riparazione omologa ricombinazione (HRR). Le frequenze dei foci, macchiati immunochimicamente, per i marcatori comunemente usati in radiobiologia come l'H2AX, 53BP1 sono associati al numero DNA-DSB e sono considerati marcatori efficienti e sensibili per monitorare l'induzione e la riparazione di DNA-DSB. È stato stabilito che i foci-H2AX attraggono le proteine di riparazione, portando ad una maggiore concentrazione di fattori di riparazione nei pressi di un DSB. Per monitorare i danni al DNA a livello cellulare, è stata pianificata un'analisi dell'immunofluorescenza per la presenza di focolai proteici di riparazione di riparazione DNA-PKcs rappresentativi dalla via NHEJ e Rad52 dal percorso HRR. Abbiamo sviluppato e introdotto un protocollo affidabile di colorazione dell'immunofluorescenza per il rilevamento della risposta al danno del DNA indotta da radiazioni con anticorpi specifici per i fattori di riparazione delle vie NHEJ e HRR e foci indotti da radiazioni (RIF) indotti da radiazioni. La metodologia proposta può essere utilizzata per studiare proteine di riparazione altamente attivate nel caso di radiazioni a fascio miscelato di neutroni, indicando così il predominio del percorso di riparazione.

Introduzione

La risposta al danno del DNA indotta dalle radiazioni attivata dal fascio misto di neutroni utilizzato nella terapia di cattura di neutroni boronica (BNCT) non è stata completamente determinata. Questo protocollo fornisce una procedura passo-passo per eseguire il rilevamento di foci indotti da radiazioni (RIF) di proteine di riparazione mediante colorazione immunofluorescenza, ad esempio, nella linea cellulare umana dopo l'irradiazione con il fascio di neutroni misto.

Le radiazioni ionizzanti (IR) inducono una moltitudine di diversi tipi di danno al DNA (DNA-DSB, DNA-SSB, danni alla base del DNA) da cui le rotture del DNA a doppio filamento sono le lesioni del DNA più genotossiche¹. Le rotture non riparate possono causare la morte delle cellule, mentre le rotture errate aumentano la probabilità di riarrangiamento cromosomico, mutagenesi e perdita di informazioni genetiche decisive. I percorsi di risposta ai danni che rispondono ai DSB includono vie di riparazione del DNA come l'unione finale non omologa (NHEJ), un meccanismo che richiede Ku 70/80, DNA-PKcs, Xrcc4, e DNA ligase IV come fattori chiave^2,3,4,5,6. Nei mammiferi, la seconda via principale di riparazione del DNA è la via omologa di riparazione della ricombinazione (HRR) che richiede componenti chiave - la famiglia genica Rad52 epistasis – Rad51, Rad52, Rad54, Rad55, Rad57 e Rad58⁷. Rad51 e Rad54 sono fattori chiave di ricombinazione umana coinvolti nei meccanismi di riparazione legati allo stress da replicazione e alle rotture del DNA negli eucarioti. È interessante notare che è stato osservato che la downregolazione del percorso HRR migliora la via NHEJ che è soggetta a errori indicando la pertinenza del percorso HR per la stabilità del genoma⁸.

Il primo passo della formazione dei DSB è la fosforolalazione dell'istone di z-H2AX a Ser-139 dell'Ataxia telangiectasia mutata chinasi (ATM) della famiglia pi3 chinasi^7,8. È interessante notare che il fosfororylazione H2AX può essere facilmente visualizzata con la tecnica dell'immunofluorescenza come foci (z-H2AX foci) utilizzando anticorpi specifici per il fosforoH⁶. C'è una relazione 1:1 tra il numero di DSB e i foci di z-H2AX, quindi, il marcatore DSB, z-H2AX, è studiato ampiamente attraverso la caratterizzazione della formazione di foci, delle dimensioni e della quantità^6,7,8,9,10^,11.¹¹ La formazione di foci di z-H2AX porta al reclutamento e all'accumulo di proteine d'emergenza (DDR) e fattori che modificano la cromatina, come 53BP1 (proteina legante p53 1), MDC1 (mediatore del checkpoint del danno al DNA), BRCA1, Mre11/Rad50/Nbs1, PARP-1 e molti altri fattori di riparazione che formano così i fattori di riparazione indotti da radiazioni (RIF). Tutte queste proteine co-localizzano con la z-H2AX attraverso il legame diretto o indiretto^1,11,12.

È importante rilevare i danni al DNA e riparare con un adeguato test sensibile, quindi, più attenzione è prestata allo sviluppo di tecniche altamente precise¹³. Nel contesto degli studi di riparazione e danni al DNA, la metodologia è fondamentale per il rilevamento sensibile del danno del DNA del genoma, la descrizione della categoria di danni e la quantificazione del danno del DNA e dei meccanismi di riparazione¹³. Per rilevare singole cellule con DNA danneggiato, il saggio della cometa viene utilizzato comunemente negli studi radiobiologici¹⁴. Altri metodi citogenetici disponibili riconoscono le aberrazioni cromosomiche, tra cui dicentrici, traslocazioni, frammenti acentrici, anelli e aberrazioni di tipo cromata, e danni cromosomici micronucleosi (Mn). Il metodo più frequentemente usato nella radiobiologia, specialmente nella dosimetria biologica, è il saggio cromosomico dicentrico dovuto alla sua elevata specificità per la radiazione¹⁵. Ad esempio, la PCR, un metodo molecolare classico, non è in grado di riconoscere il tipo di danno rilevato al DNA. In questo caso, i metodi immunometrici passano il livello di sensibilità perché le reazioni sono specifiche tra l'antigene e l'anticorpo. L'imaging dell'immunofluorescenza fornisce prove visive per la comparsa di diverse proteine in focolai distinti in risposta ad agenti dannosi del DNA come le radiazioni ionizzanti¹⁶. Tuttavia, i livelli di attivazione dei danni e dei livelli di mRNA delle proteine di riparazione sono facilmente rilevabili dalla PCR in tempo reale, il cui metodo quantitativo è un metodo quantitativo adeguato per ulteriori studi molecolari nel contesto della risposta al danno del DNA¹⁷.

Tenendo conto che i foci-H2AX attirano i fattori di riparazione¹⁸, per monitorare i danni al DNA e la riparazione a livello cellulare, abbiamo sviluppato una procedura affidabile di colorazione immunofluorescenza, basata sull'analisi dei focolai proteici di riparazione rappresentativi dal percorso NHEJ (DNA-PKcs) e Rad52 dal percorso HRR.

Qui, proponiamo l'uso dell'immunodiagnosi per queste proteine come procedura efficiente e sensibile per il monitoraggio dell'induzione e della riparazione del DNA-DSB. Fino ad ora, non ci sono stati dati disponibili sul DNA-DSB a base di foci di proteine di riparazione a livello cellulare dopo l'irradiazione a fascio misto di neutroni per BNCT, ad eccezione dei marcatori di -H2AX e 53BP1¹⁹. Suggeriamo l'adattamento della linea cellulare del cancro del colon HCT-116, in quanto è ricca di DSBs foci, come linea cellulare standard per l'analisi dei danni al DNA, perché i RIF sono facilmente rilevabili. Questa linea cellulare aderente è facile da mantenere e corretta per le procedure di irradiazione. La procedura proposta si basa su un'enorme quantità di studi precedenti relativi alla procedura generale di immunofluorescenza della colorazione z-H2AX. Tuttavia, include tutti i dettagli relativi alla selezione di anticorpi appropriati con diluizioni testate per ogni proteina rappresentativa appartenente a ciascun percorso di riparazione. Inoltre, descrive l'utilizzo di un fascio unico miscelato a neutroni utilizzato nella terapia BNCT. Tuttavia, si consiglia di estendere gli studi con entrambi i metodi, l'immunofluorescenza colorazione prima e poi, con l'analisi molecolare ad alto costo come eseguito in precedenza^4,17.

Protocollo

1. Preparazione della coltura cellulare e configurazione sperimentale

1. Mantenere le cellule tumorali del colon umano, HCT-116 come raccomandato dal fornitore, in monostrati in 75 cm² flaconi di coltura contenenti 10 mL di 5a Medium Modified di McCoy, integrati con 10% siero bovino fetale e 1% soluzione antimicotica antibiotica.
2. Coltiva le cellule in un ambiente umidizzato del 5% di CO₂ fino al 70% della confluenza con un rinnovo medio ogni 2 o 3 giorni.
3. Per ottenere il fascio DI BNCT (ad esempio, il fascio di neutroni più ¹⁰BPA) e l'effetto BNCT dell'uccisione delle cellule tumorali come particelle pesanti e depositare la maggior parte della loro energia all'interno delle cellule tumorali contenenti boro, il giorno prima dell'irradiazione, aggiungere l'agente di consegna del boro al mezzo di coltura cellulare – ad esempio, ¹⁰BPA, 4-Borono-L-fenilalana (10 g ¹⁰B/mL, 0.925 mM finale) 12–16 h (assorbimento massimo di boro) prima dell'irradiazione, come precedentemente studiato per le cellule tumorali del colon e le cellule tumorali della tiroide^20,21.
   NOTA: Se si utilizza un'altra linea cellulare, per la quale non esistono dati nello studio BNCT, testare l'assorbimento del boro per ogni linea cellulare per ottenere una concentrazione ottimale del boro. Misurare l'assorbimento cellulare di ¹⁰BPA mediante spettroscopia di emissione ottica al plasma aaccoppiamento induttivo (ICP-OES) eseguita dal gruppo Dagrosa²¹.
4. Dopo 12-16 h di consegna boro, aspirare il mezzo e lavare le cellule con 10 mL di 1x PBS. Quindi supsinizzare le cellule aggiungendo 2 mL di soluzione Trypsin-EDTA alle cellule e incubare per 5 min a 37 gradi centigradi per migliorare il distacco cellulare. Quando le celle iniziano a staccarsi, interrompere l'azione trypsin aggiungendo 10 mL di mezzo completo.
5. Aspirate la sospensione cellulare nel tubo da 15 mL e considerate le celle utilizzando un contatore cellulare automatizzato aggiungendo 10 -L di 0,4% di trypan blu a 10 l di cellule, mescolando aliquote e 10 L su una diapositiva di conteggio. Diluire la sospensione cellulare ad una concentrazione di 1 x 10⁶ cellule/mL del mezzo. Aliquota 1 mL della sospensione cellulare per criotubo.
6. Preparare i dosimetri termoluminescenti (TLD) per la misurazione delle dosi di raggi gamma e dei fogli d'oro per le fluttuazioni di neutroni e collegare i TLD ai criotubi o al pallone di coltura cellulare prima dell'irradiazione.
7. Irradiare 1 x 10⁶ cellule/mL con il fascio miscelato a neutroni al flusso di neutroni termico minimo raccomandato di 5,9 x 10¹¹ (n/cm^-2 min^{- 1})⁴ in flaconi di coltura o criotubi a seconda delle capacità della struttura.
   NOTA: Impostare il tempo di irradiazione prima di ottenere il flusso di neutroni raccomandato.
8. Dopo l'irradiazione, semi 1 mL di cellule irradiate (1 x 10⁶ cellule/mL) su 22 x 22 mm coprinti in piatti Petri 35 mm o 6 piastre di pozzo, integrare con 2 mL di mezzo richiesto. Incubane le cellule per un massimo di 3 h a 37 gradi centigradi in un ambiente umidizzato 5% CO₂ per lasciarli attaccare ai copriscarpe. Osservare l'attaccamento delle cellule di tanto in tanto al microscopio invertito con obiettivo 20x.
   NOTA: Per le cellule HCT-116 la densità minima è di 600.000 celle da seedare. Per una rapida procedura di colorazione utilizzata diapositive camera, ridurre la densità cellulare di conseguenza.

2. Fissazione delle cellule

1. Dopo l'irradiazione e l'incubazione delle cellule, rimuovere il mezzo dalle cellule collegate e lavare le cellule una volta con 2,5 mL di PBS.
2. Fissare le celle con 1 mL di 70% etanolo per 10 min a RT.
   NOTA: in alternativa, utilizzare 1%-3,7% paraformaldeide (PFA) per la fissazione come raccomandato in precedenza¹⁹. Il protocollo è in pausa qui. Conservare le cellule fisse nell'etanolo in un congelatore a -20 gradi centigradi per non più di poche settimane per ulteriori analisi e colorazione dell'immunofluorescenza.

3. Permeabilizzazione delle cellule

1. Dopo la fissazione rimuovere l'etanolo dalla piastra Petri e lavare con 2,5 mL di 1x PBS.
   NOTA: Non lasciare asciugare le cellule tra i gradini di risciacquo.
2. Aggiungere delicatamente 1 mL dello 0,2% di Triton X-100/PBS per coprire i coperchi con le cellule nei piatti Petri.
3. Incubare per 5 min a RT.
4. Lavare le celle 3x con 2,5 mL di 1x PBS.
   NOTA: aumentare la percentuale di Triton X-100 in PBS fino allo 0,5% se necessario (più rilevato dal foci, a seconda della linea cellulare testata). Eseguire lavamenti aggiuntivi con PBST (PBS con 0,5% Tween) per evitare attacchi non specifici.
5. Blocco permeabilizzazione con 1 mL di 2% BSA (Bovine Serum Fraction V albumin) diluito in PBS e incubato per un minimo di 30 min o 1 h con 1% BSA.
   NOTA: Questo passaggio può essere omesso e dipende dal tipo di anticorpo utilizzato. In alternativa, utilizzare 5% FBS come raccomandato nel riferimento⁴.

4. Colorazione immunofluorescenza

1. Aggiungere la quantità corretta di anticorpi primari (Anti-ɣ-H2AX, Anti-DNA-PKcs e Anti-Rad52) diluiti in PBS con BSA (2% Bovine Serum Fraction V albumin) come raccomandato (vedere la tabella 1 con le diluizioni raccomandate) (sono necessarie 100 Ll per campione).

Anticorpi primari	Funzione	Diluizione raccomandata	memoria [-C]
Anti-ɣ-H2AX	rilevamento di DNA-DSB	1:1000 (PBS-BSA)	4
Anti-DNA-PKc	rilevamento di RIF di proteina DNA-PKcs appartenenti a NHEJ	1:200 (PBS-BSA)	-20
Anti-Rad52	rilevamento di RIF di proteina Rad52 appartenenti a HRR	1:200 (PBS-BSA)	-20
Anticorpi secondari		Al buio
anti-mouse IgG FITC	foci ɣ-H2AX	01:400 (PBS-BSA)	4
Capra Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488)	per le proteine di riparazione NHEJ e HRR foci	1:500 (PBS-BSA)	-20

Tabella 1: Diluizioni raccomandate e note per l'uso di anticorpi utilizzati nella sezione 4.

2. Coprire il piatto Petri per mantenere l'umidità in una scatola di plastica con lignina idratata con acqua distillata e incubare per 30 min a 37 gradi centigradi nell'incubatrice.
   NOTA: il protocollo può essere messo in pausa qui. L'incubazione può essere eseguita a 4 gradi centigradi per una notte.
3. Dopo l'incubazione eseguire 3 lavamenti con 2,5 mL di PBS.
   NOTA: non lasciare asciugare il vetrino durante le fasi di risciacquo.
4. Aggiungere la quantità corretta di anticorpi secondari (anti-mouse IgG FITC, Goat Anti-Rabbit IgG (Alexa Fluor 488) diluito in PBS con BSA (vedi tabella 1)(è necessario 100 L per campione). Per questo e i seguenti passaggi funzionano al buio.
5. Coprire nuovamente il piatto Petri per mantenere l'umidità in una scatola di plastica con lignina idratata e incubare per 30 min minimo a 37 gradi centigradi nell'incubatrice.
6. Dopo l'incubazione eseguire 3 lavamenti con 2,5 mL di PBS.
7. Aggiungete 100 l di DAPI diluiti in PBS ad una concentrazione finale di 1 g/mL per contrastare i nuclei.
8. Incubare a breve, per un massimo di 2 min a RT.
9. Dopo l'incubazione eseguire 3 lavamenti con 2,5 mL di PBS.
10. Rimuovere il PBS e mettere delicatamente un coperchio sulla parte superiore del supporto di montaggio, evitando la formazione di bolle d'aria e bordi di guarnizione del coperchio con smalto. Attendere che la vernice si asciughi e dipinga il coperchio intorno.
11. Attendere l'indurimento del supporto di montaggio (fino a 3 h) prima dell'analisi dell'immagine sotto microscopia a fluorescenza.
    NOTA: il protocollo può essere messo in pausa qui. Conservare i vetrini di vetro in una scatola di plastica a 4 gradi centigradi al buio.

5. Acquisizione e analisi delle immagini

1. Acquisire immagini con un microscopio a fluorescenza sotto obiettivo 100x con olio di immersione.
   1. Analizzare i foci nei nuclei con un microscopio a fluorescenza dotato dei seguenti filtri per: Alexa Fluor 488: eccitazione/emissione (nm): 496/519, colore di emissione verde; DAPI: eccitazione-emissione (nm): 358/461, colore emissione blu.
      NOTA: l'analisi dei DSB lungo tracce a particelle singole può richiedere microscopia avanzata come la microscopia a scansione laser confocale con risoluzione più alta.
2. Salva le immagini acquisite ed elaborale con un software di imaging appropriato, ad esempio ImageJ o Image Pro^3,20.
   NOTA: Si consiglia l'uso di singole macro e plugin sviluppati per l'analisi automatica o lo sviluppo/acquisto di singoli software bioinformatici.
3. Se si utilizza il software Image-Pro per l'analisi dei foci, elaborare le immagini nei file TIFF: selezionare Count/Size Button, quindi fare clic su Types [scegliere il tipo di misurazione (ad esempio, diametro o area)], fare clic su Intervalli [impostare l'intervallo della misurazione], fare clic su Dividi oggetti se necessario. Per regolare la luminosità, fare clic su Luminoso [regolare treshold]. Quindi fare clic su Conteggio [pulsante rosso].
4. Per esportare i dati, fare clic su Tabella dati . Proprietà Statistics (Statistiche) Esportare in Excel. Nel software per fogli di calcolo, disegna grafici con l'analisi statistica richiesta.

Risultati

In primo luogo, abbiamo eseguito un'analisi di un marcatore standard di rilevamento del DNA-DSB, foci di z - cellule tumorali del colon, non irradiati e irradiati con il fascio miscelato di neutroni. I foci z-H2AX appaiono come distinti punti fluorescenti e mostrano la formazione di DNA-DSB (come ogni punto fluorescente z-H2AX rappresenta un singolo DSB) (vedi Figura 1).

Discussione

Le frequenze dei foci, immunochimicamente macchiati per la z-H2AX e 53BP1 sono comunemente utilizzate nella radiobiologia e sono associate al numero DNA-DSB e sono considerate come marcatori efficienti e sensibili per monitorare l'induzione e la riparazione di DNA-DSB¹⁹. La procedura di co-colorazione di -H2AX e 53BP1 è una procedura standard per la rilevazione di DNA-DSBs. La formazione dei focolai di H2AX è associata al reclutamento di 53BP1, regolatore della risposta al danno del DNA

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
12 mm Coverslips	VWR	89015-725
35 mm Petri dishes	Sarstedt	7.183.390.000
4-Borono-L-phenylalanine	SIGMA-ALDRICH	17755
Antibiotic-Antimycotic (100X)	Gibco	15240062
Anti-DNA PKcs (phospho S2056) antibody - ChIP Grad	Abcam	AB18192
Anti-Mouse IgG (whole molecule)–FITC antibody produced in goat	SIGMA-ALDRICH	F0257
Anti-phospho-Histone H2A.X (Ser139) Antibody, clone JBW301	MerckMillipore	05-636
Anti-RAD52 antibody	Abcam	AB117097
Bovine Serum Albumin Fraction V (BSA)	Roche	BSAV-RO
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)	ThermoFisher SCIENTIFIC	D1306
Fetal Bovine Serum (Heat Inactivated)	SIGMA-ALDRICH	F9665
Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488)	Abcam	AB150077
HCT-116 cell line	ATCC	CCL-247™
ImageJ	National Institute of Health (NIH)	https://imagej.nih.gov/ij/
Image Pro	Media cybernetics	http://www.mediacy.com/imagepro
LUNA II Automated Cell Counter	Logos Biosystems	L40002
McCoy’s 5A Medium (Modified, with L-glutamine and sodium bicarbonate)	SIGMA-ALDRICH	M9309
microscope slides	ThermoFisher SCIENTIFIC	B-1198
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Hirszfeld Institute of Immunology and Experimental Therapy, PAS	20.59.52.0
Triton X-100	SIGMA-ALDRICH	X100
Trypan Blue Stain, 0.4%	Logos Biosystems	T13001
Trypsin-EDTA solution 0.25%	SIGMA-ALDRICH	T4049