JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bor nötron yakalama terapisinde (BNCT) kullanılan nötron karışık ışınıile aktive edilen radyasyona bağlı DNA hasar tepkisi tam olarak belirlenmemiştir. Bu protokol, nötron-karışık ışın ile ışınlama sonra insan kolon kanseri hücre hatlarında immünofloresan boyama tarafından onarım proteinlerinin radyasyonkaynaklı foci (RIF) tespit etmek için adım adım bir prosedür sağlar.

Özet

Makalenin amacı, bor nötron yakalama terapisinde (BNCT) kullanılan nötron-gama karışık ışınının neden olduğu radyasyona bağlı DNA hasar yanıtını incelemek için immünoresans mikroskobu için adım adım bir protokol sağlamaktır. Özellikle, önerilen metodoloji DNA çift iplikçik sonları (DNA-DSBs) özgü antikorlar kullanılarak fok olarak görüntülenebilir onarım proteinleri aktivasyonu tespiti için uygulanır. DNA onarım odakları, nötron-karışık ışınla ışınlama sonrası kolon kanseri hücrelerinde (HCT-116) immünororesans ile değerlendirildi. DNA-DSB'ler en genotoksik lezyonlardır ve memeli hücrelerinde iki ana yol ile onarılır: homolog olmayan son birleştirme yolu (NHEJ) ve homolog rekombinasyon onarımı (HRR). Γ-H2AX, 53BP1 gibi radyobiyolojide yaygın olarak kullanılan belirteçler için fokların frekansları, 53BP1 DNA-DSB numarası ile ilişkilidir ve DNA-DSB'lerin indüksiyon ve onarımını izlemek için etkili ve hassas belirteçler olarak kabul edilir. Γ-H2AX foci'nin onarım proteinlerini cezbettiği ve DSB'ye yakın onarım faktörlerinin daha yüksek bir konsantrasyona yol ettiği tespit edilmiştir. HÜCRESEL düzeyde DNA hasarını izlemek için, NHEJ yolundan DNA-PKcs temsilcisi onarım protein foci ve HRR yolundan Rad52 varlığı için immünofloresans analizi planlandı. NHEJ ve HRR yollarından gelen onarım faktörlerine özgü antikorlar ve radyasyona bağlı foci (RIF) ile radyasyona bağlı DNA hasar yanıtının tespiti için güvenilir bir immünorfloresans boyama protokolü geliştirdik ve uygulamaya koyduk. Önerilen metodoloji, nötron-karışık ışın radyasyonu durumunda yüksek oranda aktive olan ve onarım yolunun hakimiyetini gösteren onarım proteinini araştırmak için kullanılabilir.

Giriş

Bor nötron yakalama terapisinde (BNCT) kullanılan nötron karışık ışınıile aktive edilen radyasyona bağlı DNA hasar tepkisi tam olarak belirlenmemiştir. Bu protokol, nötron la karışık ışınla ışınlama dan sonra insan kolon kanseri hücre hattında immünororesans boyama gibi, radyasyonkaynaklı fok (RIF) onarım proteinlerinin tespitini gerçekleştirmek için adım adım bir prosedür sağlar.

İzole radyasyon (IR) DNA çift iplikçik sonları en genotoksik DNA lezyonları olan DNA hasarı (DNA-DSBs, DNA-SSBs, DNA baz hasarı) farklı türde çok sayıda neden olur1. Onarılmamış molalar hücre ölümüne neden olabilir, yanlış tamir edilmiş molalar kromozom yeniden düzenlenmesi, mutagenezi ve belirleyici genetik bilgi kaybı olasılığını yükseltir. DSB'lere yanıt veren hasar yanıt yolları arasında homolog olmayan son birleştirme (NHEJ), Ku 70/80, DNA-PKcs, Xrcc4 ve DNA ligaz IV gerektiren bir mekanizma gibi DNA onarım yolları yer almaktadır2,3,4,5,6. Memelilerde ikinci ana DNA onarım yolu, rad52 epistazis gen ailesi- Rad51, Rad52, Rad54, Rad55, Rad57 ve Rad587olmak üzere temel bileşenler gerektiren homolog rekombinasyon onarımı (HRR) yoludur. Rad51 ve Rad54 ökaryotlarda replikasyon stresi ve DNA kırılmaları ile ilgili onarım mekanizmalarında önemli insan rekombinasyon faktörleridir. İlginçtir, HRR yolunun downregulation genom stabilitesi için Hr yolu alaka işaret hata eğilimli NHEJ yolu geliştirir gözlenmiştir8.

DSBoluşumunun ilk adımı Pi3 kilaz ailesinden Ataxia telangieektazi mutasyona uğramış kilaz (ATM) tarafından Ser-139 γ-H2AX histonun fosforilasyon olduğunu7,8. İlginçtir, H2AX fosforilasyon fosforlu H2AX6için özel antikorlar kullanarak foci (γ-H2AX foci) olarak immünorfloresan tekniği ile kolayca görüntülenebilir. DSB'lerin sayısı ile γ-H2AX odakları arasında 1:1 ilişki vardır, bu nedenle, DSB marker, γ-H2AX, foci oluşumu, büyüklüğü ve miktarı6,7,,8,9,10,11karakterizasyonu ile kapsamlı olarak incelenir. Γ-H2AX foci oluşumu işe ve DNA hasar yanıtı (DDR) proteinleri ve kromatin değiştirici faktörlerin birikimine yol açar, gibi 53BP1 (p53 bağlayıcı protein 1), MDC1 (DNA hasar kontrol noktası arabulucusu), BRCA1, Mre11/Rad50/Nbs1, PARP-1, ve diğer birçok onarım faktörleri böylece radyasyon kaynaklı foci (RIF) oluşturan oluşturur. Tüm bu proteinler γ-H2AX ile doğrudan veya dolaylı bağlama yoluyla1,111,12ile birlikte lokalize dir.

Bu dna hasarı ve onarım uygun bir hassas test ile tespit etmek önemlidir, bu nedenle, daha fazla dikkat son derece hassas tekniklerin geliştirilmesi ne kadar ödenir13. DNA hasarı ve onarım çalışmaları bağlamında, metodoloji genom DNA hasarının hassas tespiti, hasar kategorisinin tanımlanması ve DNA hasar ve onarım mekanizmalarının sayısallaştırılması için çok önemlidir13. Hasarlı DNA'lı tek hücreleri tespit etmek için kuyruklu yıldız testi radyobiyolojik çalışmalarda yaygın olarak kullanılmaktadır14. Diğer mevcut sitogenetik yöntemler, diysentrikler, translokasyonlar, asentrik parçalar, halkalar ve kromatit tip sapmaları ve mikronükleus kromozom hasarı (Mn) dahil olmak üzere kromozom sapmalarını tanır. Radyobiyolojide, özellikle biyolojik dozimetride en sık kullanılan yöntem, radyasyona özgüllüğü nedeniyle disantrik kromozomdosay'ıdır 15. Örneğin, klasik bir moleküler yöntem olan PCR, tespit edilen DNA hasarının türünü tanıyamaz. Bu durumda, immünometrik yöntemler duyarlılık seviyesini geçer çünkü reaksiyonlar antijen ve antikor arasında spesifiktir. İmmünofloresan görüntüleme, iyonlaştırıcı radyasyon gibi DNA zararlı ajanlara yanıt olarak farklı fosilerde farklı proteinlerin ortaya çıkması için görsel kanıtlar sağlar16. Ancak, hasar ve onarım proteinlerin mRNA düzeylerinin aktivasyon düzeyleri kolayca DNA hasar yanıtı bağlamında daha fazla moleküler çalışmalar için uygun bir kantitatif yöntemdir gerçek zamanlı PCR tarafından tespit edilebilir17.

Γ-H2AX foci onarım faktörleri çekmek dikkate alarak18, HÜCRESEL düzeyde DNA hasarı ve onarım izlemek için, biz güvenilir bir immünoresans boyama prosedürü geliştirdik, NHEJ yolu temsili onarım protein foci analizine dayalı (DNA-PKcs) ve RAD52 HRR yolu.

Burada, bu proteinler için immünoalgılamanın DNA-DSB indüksiyon ve onarımının izlenmesi için etkili ve hassas bir prosedür olarak kullanılmasını öneriyoruz. Şimdiye kadar, bnct için nötron karışık ışınlama sonra hücresel düzeyde onarım proteinlerinin foci dayalı DNA-DSBs üzerinde mevcut veri olmuştur, γ-H2AX ve 53BP1 belirteçleri hariç19. BIZ HCT-116 kolon kanseri hücre hattının adaptasyon öneririz, DSBs odak zengin kendisi olarak, DNA hasar analizi için standart bir hücre hattı olarak, RiFs kolayca tespit edilebilir çünkü. Bu yapışık hücre hattı bakımı kolaydır ve ışınlama prosedürleri için uygun. Önerilen prosedür γ-H2AX boyama genel immünofloresan prosedürü ile ilgili önceki çalışmaların büyük miktarda dayanmaktadır. Ancak, her onarım yoluna ait her temsili protein için test edilmiş seyreltme ile uygun antikorların seçimi ile ilgili tüm ayrıntıları içerir. Ayrıca, BNCT tedavisinde kullanılan benzersiz bir nötron-karışık ışın kullanımını açıklar. Ancak, her iki yöntem ile çalışmaları uzatmak için tavsiye, immünoresans boyama ilk ve daha sonra, daha önce yapılan yüksek maliyetli moleküler analiz ile4,17.

Protokol

1. Hücre kültürünün hazırlanması ve deneysel kurulum

  1. İnsan kolon kanseri hücreleri korumak, HCT-116 tedarikçi tarafından tavsiye edildiği gibi, monolayers içinde 75 cm2 kültür şişeleri içeren 10 mL formüle McCoy's 5a Orta Modifiye, ile takviye 10% fetal sığır serum ve 1% antibiyotik antimikotik solüsyon.
  2. 37 °C'de nemlendirilmiş %5 CO2 ortamında hücreleri 2-3 günde bir orta yenileme ile %70 oranında biraraya gelene kadar büyütün.
  3. BNCT ışını (örn. nötron ışını artı 10BPA) ve bnct etkisi ile kanser hücrelerini ağır parçacıklar olarak öldürmek ve enerjilerinin çoğunu bor içeren kanser hücrelerinin içine yatırmak, ışınlama dan bir gün önce, hücre kültürü ortamına bor dağıtım maddesi ekleyin – örneğin, 10BPA, 4-Borono-L-fenilalanin (10 μg 10B/mL, 0.925 mM final) 12-16 h (bor maksimum alımı) ışınlama önce, daha önce kolon kanseri hücreleri ve tiroid kanseri hücreleri için çalışılan20,21.
    NOT: BNCT çalışmasında veri bulunmayan başka bir hücre hattı kullanıyorsanız, optimum bor konsantrasyonu elde etmek için her hücre hattı için bor alımını test edin. Dagrosa grup21tarafından gerçekleştirilen endüktif birleştirilmiş plazma optik emisyon spektroskopisi (ICP-OES) ile 10BPA hücresel alımını ölçün.
  4. Bor tesliminden sonra 12-16 saat sonra ortayı aspire edin ve 10 mL 1x PBS ile hücreleri yıkayın. Daha sonra hücrelere 2 mL Tripsin-EDTA çözeltisi ekleyerek hücreleri deneyin ve hücre ayrışmasını geliştirmek için 37 °C'de 5 dakika kuluçkaya yatırın. Hücreler kopmaya başladığında, 10 mL tam ortam ekleyerek tripsin eylemini durdurun.
  5. Hücre süspansiyonuna 15 mL tüpte aspire edin ve 10 μL'lik hücreye 10 μL'lik trypan mavisi ilave ederek otomatik hücre sayacı kullanarak hücreleri sayın, karıştırın ve 10 μL'lik bir saydı. Hücre süspansiyonuna 1 x 106 hücre/mL konsantrasyonuna seyreltin. Aliquot 1 mL kriyotube başına hücre süspansiyon.
  6. Nötron fluencies için gama ışını dozlarının ve altın folyoların ölçümü için termolüminesans dozimetreler (TLD' ler) hazırlayın ve ışınlamadan önce kriyotüplere veya hücre kültürü şişesine TLD takın.
  7. 1 x 106 hücreyi/mL'yi, tesis yeteneklerine bağlı olarak kültür şişelerinde veya kriyotüplerde önerilen minimum termal nötron akısı 5,9 x 1011 (n/cm-2 dk−1)4'te nötron karışımı Kiriş ile ışınlayın.
    NOT: Önerilen nötron akısı elde etmek için ışınlama zamanını ayarlamadan önce ayarlayın.
  8. Işınlamadan sonra, 35 mm Petri kaplarında 22 x 22 mm coverslips veya 6 kuyu plakası üzerinde 1 mL ışınlanmış hücre (1 x 106 hücre/mL) tohumu, gerekli ortam 2 mL ile tamamlanır. Hücreleri 37 °C'de maksimum 3 saat boyunca nemlendirilmiş %5 CO2 ortamında kuluçkaya yatırarak kapaklara takmalarını sağlar. 20x amacı ile ters bir mikroskop altında zaman zaman hücrelerin eki gözlemleyin.
    NOT: HCT-116 hücreleri için minimum yoğunluk 600.000 hücre nin tohuma atılmıştır. Hızlı daha fazla boyama işlemi için oda slaytları kullanın, buna göre hücre yoğunluğunu azaltmak.

2. Hücrelerin fiksasyonu

  1. ışınlama ve hücrelerin kuluçka sonra, bağlı hücrelerden orta çıkarın ve pbs 2.5 mL ile bir kez hücreleri yıkayın.
  2. RT'de 10 dakika boyunca %70 etanol içeren hücreleri düzeltin.
    NOT: Alternatif olarak daha önce tavsiye edilen19fiksasyon için % 1-3.7 paraformaldehit (PFA) kullanın. Protokol burada duraklatıldı. Sabit hücreleri -20 °C'de bir dondurucuda, daha fazla analiz ve immünoforesans boyama için birkaç haftadan fazla bir süre için saklayın.

3. Hücrelerin permeabilizasyonu

  1. Fiksasyondan sonra Petri kabından etanol çıkarın ve 2,5 mL 1x PBS ile yıkayın.
    NOT: Durulama adımları arasında hücrelerin kurumasına izin vermeyin.
  2. Petri kaplarında ki hücrelerle kapakları kapsayacak şekilde Triton X-100/PBS'nin %0,2'sinin 1 mL'sini hafifçe ekleyin.
  3. RT 5 dakika kuluçka.
  4. Hücreleri 2,5 mL 1x PBS ile 3x yıkayın.
    NOT: Gerekirse PBS'deki Triton X-100 yüzdesini %0,5'e kadar artırın (daha fazla fosi saptanabilir, test edilmiş hücre hattına bağlı). Spesifik olmayan bağlamayı önlemek için PBST (PBS %0,5 Tween ile PBS) ile ek yıkıntılar yapın.
  5. PBS'de seyreltilmiş ve en az 30 dakika veya %1 BSA ile 1 mL bsa (Sığır Serum Fraksiyonu V albumin) ile blok permeabilizasyon adımı.
    NOT: Bu adım atlanabilir ve kullanılan antikor türüne bağlıdır. Alternatif olarak, ref4'tetavsiye edilen %5 FBS kullanın.

4. İmmünofluoresan boyama

  1. PBS'de BSA (%2 Sığır Serum Fraksiyonu V albumin) ile seyreltilmiş uygun miktarda birincil antikor (Anti-t-H2AX, Anti-DNA-PKcs ve Anti-Rad52) tavsiye edildiği gibi (bkz. önerilen seyreltmelerle Tablo 1' e bakınız) (numune başına 100 μL gereklidir).
Primer antikorIşlevÖnerilen seyreltmedepolama [°C]
Anti-i H2AXDNA-DSB'lerin saptanması1:1000 (PBS-BSA)4
Anti-DNA-PKcsNHEJ'ye ait DNA-PKcs proteininin RIFs'lerinin saptanması1:200 (PBS-BSA)-20
Anti-Rad52HRR'ye ait Rad52 proteininin RIF'lerinin tespiti1:200 (PBS-BSA)-20
Sekonder antikorHabersiz
fare karşıtı IgG FITCa-H2AX odak1:400 (PBS-BSA)4
Keçi Anti-Tavşan IgG H & L (Alexa Fluor 488)NHEJ ve HRR onarım proteinleri için foci1:500 (PBS-BSA)-20

Tablo 1: Bölüm 4'te kullanılan antikorların kullanımı için önerilen seyreltmeler ve notlar.

  1. Distile su kullanarak nemlendirilmiş lignin ile plastik bir kutuiçinde nem korumak için Petri çanak kapağı ve kuluçka 37 °C 30 dakika kuluçka.
    NOT: Protokol burada duraklatılabilir. Kuluçka gece için 4 °C'de yapılabilir.
  2. Kuluçka dan sonra 2.5 mL PBS ile 3 yıkıntı yapın.
    NOT: Durulama adımları sırasında kaydıraktan sonra kurumasını unutmayın.
  3. Uygun miktarda ikincil antikor ekleyin (anti-fare IgG FITC, Keçi Anti-Rabbit IgG (Alexa Fluor 488) BSA ile PBS seyreltilmiş (Tablo 1)(örnek başına 100 μL gereklidir). Bunun ve aşağıdaki adımların karanlıkta çalışması için.
  4. Kuvözde 37 °C'de en az 30 dakika boyunca nemlendirilmiş lignin ve inkübatile plastik bir kutuda nemi korumak için Petri kabını tekrar kapatın.
  5. Kuluçka dan sonra 2.5 mL PBS ile 3 yıkıntı yapın.
  6. Çekirdekleri boyamak için PBS'de seyreltilmiş 100 μL DAPI'yi 1 μg/mL'lik son konsantrasyona ekleyin.
  7. Kısa bir süre içinde, RT'de en fazla 2 dakika kuluçkaya yatırın.
  8. Kuluçka dan sonra 2.5 mL PBS ile 3 yıkıntı yapın.
  9. PBS çıkarın ve yavaşça montaj ortamının üstüne bir coverslip koymak, hava kabarcıkları ve oje ile coverslip mühür kenarları oluşumunu kaçınarak. Vernik kuruyana kadar bekleyin ve örtüyü etrafa boyayın.
  10. Floresan mikroskopi altında görüntü analizinden önce montaj ortamının sertlemesini (3 saate kadar) bekleyin.
    NOT: Protokol burada duraklatılabilir. Cam slaytları karanlıkta 4 °C'de plastik bir kutuda saklayın.

5. Görüntü edinimi ve analizi

  1. Daldırma yağı ile 100x hedefi altında floresan mikroskop ile görüntü elde edin.
    1. Aşağıdaki filtrelerle donatılmış bir floresan mikroskobu ile çekirdekteki foları analiz edin: Alexa Fluor 488: uyarma emisyon (nm): 496/519, emisyon rengi yeşil; DAPI: uyarma emisyon (nm): 358.461, emisyon rengi mavi.
      NOT: Tek partikül parçaları boyunca DSB'lerin analizi, konfokal lazer tarama mikroskobu gibi ileri düzeyde mikroskopisi gerektirebilir.
  2. Edinilmiş görüntüleri ve işlemi, ImageJ veya Image Pro3,20 gibi uygun görüntüleme yazılımıylakaydedin.
    NOT: Otomatik analiz veya bireysel biyoinformatik yazılım geliştirme/satın alma için geliştirilen tek tek makro ve eklentilerin kullanılması önerilir.
  3. Foci analizi için Image-Pro yazılımını kullanıyorsanız, TIFF dosyalarındaki görüntüleri işle: Count/Size Button'ı seçin, ardından Türleri tıklatın [ölçüm türünü seçin (örn. çap veya alan)], Aralıklar'ı [ölçüm aralığını ayarla], gerekirse nesneleri böl'ütıklatın. Parlaklığı ayarlamak için Parlak [treshold'u ayarla]'yı tıklatın. Ardından Say [kırmızı düğme] tuşuna basın.
  4. Veri aktarmak için Veri Tablosu | İstatistikler | Excel'e dışa aktar. Elektronik tablo yazılımında, gerekli istatistiksel analizlerle grafikler çizin.

Sonuçlar

İlk olarak, DNA-DSBs tespiti standart bir belirteç bir analiz yapıldı, kolon kanseri hücrelerinde γH2AX foci, yayılamaz, ve nötron karışık ışın ile ışınlanmış. γ-H2AX foci farklı floresan nokta olarak görünür ve DNA-DSB'lerin oluşumunu gösterir (her γ-H2AX floresan nokta tek bir DSB'yi temsil eder) (Bkz. Şekil 1).

figure-results-432

Tartışmalar

Γ-H2AX ve 53BP1 için immünokimyasal olarak boyanmış foksin frekansları radyobiyolojide yaygın olarak kullanılır ve DNA-DSB numarası ile ilişkilidir ve DNA-DSB'lerin indüksiyon ve onarımını izlemek için etkili ve hassas belirteçler olarak kabul edilir19. Γ-H2AX ve 53BP1'in ortak boyama prosedürü DNA-DSB'lerin tespiti için standart bir prosedürdür. γ-H2AX foci oluşumu 53BP1, DNA hasar yanıtı23bir regülatör işe ile ilişkilidir. Ancak, γ-H2AX /53...

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

Nötron/gama radyasyonundan oluşan nötron karışımı ışınlara Polonya'daki Ulusal Nükleer Araştırma Merkezi'ndeki Maria araştırma reaktöründen erişildi. K.M.O. Polonya Ulusal Bilim Merkezi (Miniatura 2) tarafından #2018 desteklenmiştir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
12 mm CoverslipsVWR89015-725
35 mm Petri dishesSarstedt7.183.390.000
4-Borono-L-phenylalanineSIGMA-ALDRICH17755
Antibiotic-Antimycotic (100X)Gibco15240062
Anti-DNA PKcs (phospho S2056) antibody - ChIP GradAbcamAB18192
Anti-Mouse IgG (whole molecule)–FITC antibody produced in goatSIGMA-ALDRICHF0257
Anti-phospho-Histone H2A.X (Ser139) Antibody, clone JBW301MerckMillipore05-636
Anti-RAD52 antibodyAbcamAB117097
Bovine Serum Albumin Fraction V (BSA)RocheBSAV-RO
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)ThermoFisher SCIENTIFICD1306
Fetal Bovine Serum (Heat Inactivated)SIGMA-ALDRICHF9665
Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488)AbcamAB150077
HCT-116 cell lineATCCCCL-247™
ImageJNational Institute of Health (NIH)https://imagej.nih.gov/ij/
Image ProMedia cyberneticshttp://www.mediacy.com/imagepro
LUNA II Automated Cell CounterLogos BiosystemsL40002
McCoy’s 5A Medium (Modified, with L-glutamine and sodium bicarbonate)SIGMA-ALDRICHM9309
microscope slidesThermoFisher SCIENTIFICB-1198
Phosphate Buffered Saline (PBS)Hirszfeld Institute of Immunology and Experimental Therapy, PAS20.59.52.0
Triton X-100SIGMA-ALDRICHX100
Trypan Blue Stain, 0.4%Logos BiosystemsT13001
Trypsin-EDTA solution 0.25%SIGMA-ALDRICHT4049

Referanslar

  1. Carter, R. J., et al. Complex DNA Damage Induced by High Linear Energy Transfer Alpha-Particles and Protons Triggers a Specific Cellular DNA Damage Response. International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 100 (3), 776-784 (2018).
  2. Kondo, N., et al. DNA damage induced by boron neutron capture therapy is partially repaired by DNA ligase IV. Radiation Environmental Biophysics. 55 (1), 89-94 (2016).
  3. Sakai, W., Sugasawa, K. DNA Damage Recognition and Repair in Mammalian Global Genome Nucleotide Excision Repair. DNA Replication, Recombination, and Repair: Molecular Mechanisms and Pathology. , 155-174 (2016).
  4. Rodriguez, C., et al. In vitro studies of DNA damage and repair mechanisms induced by BNCT in a poorly differentiated thyroid carcinoma cell line. Radiation Environmental Biophysics. 57 (2), 143-152 (2018).
  5. Sollazzo, A., et al. Live Dynamics of 53BP1 Foci Following Simultaneous Induction of Clustered and Dispersed DNA Damage in U2OS Cells. International Journal of Molecular Sciences. 19 (2), (2018).
  6. Jeggo, P., Löbrich, M. Radiation-induced DNA damage responses. Radiation Protection Dosimetry. 122 (1-4), 124-127 (2006).
  7. Sigurdsson, S., Van Komen, S., Petukhova, G., Sung, P. Homologous DNA pairing by human recombination factors Rad51 and Rad54. The Journal of Biological Chemistry. 277 (45), 42790-42794 (2002).
  8. Choi, E. H., Yoon, S., Hahn, Y., Kim, K. P. Cellular Dynamics of Rad51 and Rad54 in Response to Postreplicative Stress and DNA Damage in HeLa Cells. Molecules and Cells. 40 (2), 143-150 (2017).
  9. Burma, S., Chen, B. P., Murphy, M., Kurimasa, A., Chen, D. J. ATM phosphorylates histone H2AX in response to DNA double-strand breaks. The Journal of Biological Chemistry. 276 (45), 42462-42467 (2001).
  10. Nakamura, T. M., Du, L. L., Redon, C., Russell, P. Histone H2A phosphorylation controls Crb2 recruitment at DNA breaks, maintains checkpoint arrest, and influences DNA repair in fission yeast. Molecular and Cellular Biology. 24 (14), 6215-6230 (2004).
  11. Kuo, L. J., Yang, L. X. Gamma-H2AX - a novel biomarker for DNA double-strand breaks. In Vivo. 22 (3), 305-309 (2008).
  12. Sage, E., Shikazono, N. Radiation-induced clustered DNA lesions: Repair and mutagenesis. Free Radical Biology and Medicine. 107, 125-135 (2017).
  13. Boguszewska, K., Szewczuk, M., Urbaniak, S., Karwowski, B. T. Review: immunoassays in DNA damage and instability detection. Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (23), 4689-4704 (2019).
  14. Møller, P., et al. Potassium bromate as positive assay control for the Fpg-modified comet assay. Mutagenesis. , (2020).
  15. Sommer, S., Buraczewska, I., Kruszewski, M. Micronucleus Assay: The State of Art, and Future Directions. International Journal of Molecular Sciences. 21 (4), 1534 (2020).
  16. Bennett, B. T., Bewersdorf, J., Knight, K. L. Immunofluorescence imaging of DNA damage response proteins: optimizing protocols for super-resolution microscopy. Methods. 48 (1), 63-71 (2009).
  17. Cheng, L., et al. Simultaneous induction of dispersed and clustered DNA lesions compromises DNA damage response in human peripheral blood lymphocytes. PLoS One. 13 (10), 0204068 (2018).
  18. Paull, T. T., et al. A critical role for histone H2AX in recruitment of repair factors to nuclear foci after DNA damage. Current Biology. 10 (15), 886-895 (2000).
  19. Okumura, K., et al. Relative biological effects of neutron mixed-beam irradiation for boron neutron capture therapy on cell survival and DNA double-strand breaks in cultured mammalian cells. Journal of Radiation Research. 54 (1), 70-75 (2013).
  20. Dagrosa, M. A., et al. First evaluation of the biologic effectiveness factors of boron neutron capture therapy (BNCT) in a human colon carcinoma cell line. International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 79 (1), 262-268 (2011).
  21. Dagrosa, A., et al. Studies for the application of boron neutron capture therapy to the treatment of differentiated thyroid cancer. Applied Radiation and Isotopes. 69 (12), 1752-1755 (2011).
  22. Reynolds, P., et al. The dynamics of Ku70/80 and DNA-PKcs at DSBs induced by ionizing radiation is dependent on the complexity of damage. Nucleic Acids Research. 40 (21), 10821-10831 (2012).
  23. Rasche, L., et al. Analysis of Lymphocytic DNA Damage in Early Multiple Sclerosis by Automated Gamma-H2AX and 53BP1 Foci Detection: A Case Control Study. PLoS One. 11 (1), 0147968 (2016).
  24. Banáth, J. P., Macphail, S. H., Olive, P. L. Radiation sensitivity, H2AX phosphorylation, and kinetics of repair of DNA strand breaks in irradiated cervical cancer cell lines. Cancer Research. 64 (19), 7144-7149 (2004).
  25. Barth, R. F., et al. Current status of boron neutron capture therapy of high grade gliomas and recurrent head and neck cancer. Radiatiation Oncology. 7, 146 (2012).
  26. Mirzaei, H. R., et al. Boron neutron capture therapy: Moving toward targeted cancer therapy. Journal of Cancer Research and Therapeutics. 12 (2), 520-525 (2016).
  27. Vitti, E. T., Parsons, J. L. The Radiobiological Effects of Proton Beam Therapy: Impact on DNA Damage and Repair. Cancers. 11 (7), 946 (2019).
  28. Mohamad, O., et al. Carbon Ion Radiotherapy: A Review of Clinical Experiences and Preclinical Research, with an Emphasis on DNA Damage/Repair. Cancers. 9 (6), 66 (2017).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Kanser Ara t rmalarSay 160BNCTDNA DSB lerradyasyona ba l fosiDNA hasaronar m yollarkar k n

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır