JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Радиационно-индуцированная реакция повреждения ДНК активируется нейтронной смешанной балки, используемой в бор нейтронной терапии захвата (BNCT) не была полностью установлена. Этот протокол обеспечивает пошаговую процедуру для обнаружения радиационно-индуцированных очагов (РИФ) ремонтных белков путем окрашивания иммунофлуоресценции в линиях раковых клеток толстой кишки человека после облучения нейтронно-смешанным лучом.

Аннотация

Целью рукописи является предоставление пошагового протокола для выполнения иммунофлуоресценции микроскопии для изучения радиационно-индуцированного реакции повреждения ДНК, вызванного нейтронно-гамма-смешанным лучом, используемым в терапии захвата боров нейтронов (BNCT). В частности, предлагаемая методология применяется для обнаружения активации ремонтных белков, которые могут быть визуализированы как очаги с использованием антител, характерных для ДНК двойных разрывов (ДНК-DSBs). Очаги репарации ДНК были оценены иммунофлуоресценцией в раковых клетках толстой кишки (HCT-116) после облучения нейтронно-смешанным лучом. ДНК-DSBs являются наиболее генотоксических поражений и восстанавливаются в клетках млекопитающих двумя основными путями: нехомологичные пути конечного присоединения (NHEJ) и гомологичные ремонт рекомбинации (HRR). Частоты очагов, иммунохимически окрашенных, для широко используемых маркеров в радиобиологии, как q-H2AX, 53BP1 связаны с ДНК-DSB число и считаются эффективными и чувствительными маркерами для мониторинга индукции и ремонта ДНК-DSBs. Было установлено, что фочи q-H2AX привлекают ремонтные белки, что приводит к более высокой концентрации факторов ремонта вблизи DSB. Для мониторинга повреждения ДНК на клеточном уровне был запланирован иммунофлуоресценциотический анализ на наличие репрезентативного протеинового очага ДНК-ПКК от пути NHEJ и Rad52 от пути HRR. Мы разработали и внедрили надежный протокол окрашивания иммунофлуоресценции для обнаружения радиационно-индуцированного реакции повреждения ДНК с антителами, специфическими для ремонтных факторов от NHEJ и HRR путей и наблюдаемых радиационно-индуцированных очагов (RIF). Предлагаемая методология может быть использована для исследования ремонта белка, который высоко активирован в случае нейтронно-смешанного луча излучения, тем самым указывая на доминирование пути ремонта.

Введение

Радиационно-индуцированная реакция повреждения ДНК активируется нейтронным смешанным лучом, используемым в терапии захвата бора нейтронов (BNCT), не была полностью определена. Этот протокол обеспечивает пошаговую процедуру для выполнения обнаружения радиационно-индуцированных очагов (РИФ) ремонтных белков путем окрашивания иммунофлуоресценции, например, в линии рака толстой кишки человека после облучения нейтронно-смешанным лучом.

Ионизирующее излучение (ИО) вызывает множество различных типов повреждений ДНК (ДНК-ДСБ, ДНК-SSBs, повреждение основания ДНК), из которых ДНК двойных разрывов являются наиболее генотоксических поражений ДНК1. Неремонтированные разрывы могут привести к гибели клеток, в то время как неправильное расстройство повышает вероятность перестановки в хромосоме, мутагенеза и потери решающей генетической информации. Пути реагирования на повреждения, реагирующие на DSBs, включают пути репарации ДНК, такие как нехомологичное присоединение к концу (NHEJ), механизм, который требует Ku 70/80, ДНК-PKcs, Xrcc4 и ДНК-лигаза IV в качестве ключевых факторов2,3,4,5,6. У млекопитающих, второй основной путь репарации ДНК гомологии рекомбинации ремонта (HRR) путь, который требует ключевых компонентов - Rad52 эпистаз гена семьи Rad51, Rad52, Rad54, Rad55, Rad57 и Rad587. Rad51 и Rad54 являются ключевыми факторами рекомбинации человека, участвующими в механизмах восстановления, связанных со стрессом репликации и разрывами ДНК в эукариотах. Интересно, было отмечено, что downregulation пути HRR повышает ПУТЬ NHEJ, который является подверженным ошибкам указывая на HR пути актуальность для стабильности генома8.

Первым шагом формирования DSBs является фосфорилирование гистона q-H2AX в Сер-139 от Ataxia telangiectasia мутировавших киназы (ATM) из семейства PI3киназы 7,8. Интересно, что фосфорилирование H2AX можно легко визуализировать с помощью иммунофлуоресценции, как foci (К-H2AX foci) с использованием антител, специфических для фосфорилированного H2AX6. Существует 1:1 связь между числом DSBs и Q-H2AX foci, поэтому, DSB маркер, q-H2AX, изучается широко через характеристику формирования очагов, размер, и количество6,7,8,9,10,11.7 Формирование очагов q-H2AX приводит к набору и накоплению белков реакции на повреждение ДНК (DDR) и хроматин-модифицирующих факторов, таких как 53BP1 (p53 связывающий белок 1), MDC1 (посредник контрольно-пропускного пункта повреждения ДНК), BRCA1, Mre11/Rad50/Nbs1, PARP-1 и многие другие ремонтные факторы, таким образом, образуя радиацию. Все эти белки совместно локализуются с помощью q-H2AX через прямую или косвенную привязку1,,11,12.

Важно обнаружить повреждение ДНК и восстановить с помощью правильного чувствительного теста, поэтому больше внимания уделяется разработке высокоточных методов13. В контексте повреждения ДНК и ремонтных исследований, методология имеет решающее значение для чувствительного обнаружения повреждения ДНК генома, описание категории повреждений, а также количественное повреждение ДНК и механизмы ремонта13. Для обнаружения одиночных клеток с поврежденной ДНК, комета анализ обычно используется в радиобиологических исследованиях14. Другие доступные цитогенетические методы распознают хромосомные аберрации, включая дицентрические, транслокации, ацентрические фрагменты, кольца и аберрации хроматированного типа и хромосомные повреждения микронуклеуса (Mn). Наиболее часто используемым методом в радиобиологии, особенно в биологической дозиметрии, является дицентрический анализ хромосомы из-за его высокой специфичности для излучения15. Например, ПЦР, классический молекулярный метод, не может распознать тип обнаруженного повреждения ДНК. В этом случае иммунометрические методы проходят уровень чувствительности, потому что реакции специфичны между антигеном и антителом. Иммунофлуоресценция изображений обеспечивает визуальные доказательства появления различных белков в различных очагов в ответ на ДНК повреждения агентов, как ионизирующее излучение16. Тем не менее, уровни активации повреждения и восстановления белков мРНК уровни легко обнаруживаются в режиме реального времени ПЦР, который является надлежащим количественным методом для дальнейших молекулярных исследований в контексте реакции повреждения ДНК17.

Принимая во внимание, что foci q-H2AX привлекает факторы ремонта18, для мониторинга повреждения ДНК и ремонта на клеточном уровне, мы разработали надежную процедуру окрашивания иммунофлуоресценции, основанную на анализе репрезентативного ремонта белковых очагов из NHL pathway (DNA-PKcs) и Rad52 от пути HRR.

Здесь мы предлагаем использовать иммунодефицит для этих белков в качестве эффективной и чувствительной процедуры для мониторинга индукции дНК-DSB и ремонта. До сих пор не было доступных данных о ДНК-DSBs на основе очагов ремонтных белков на клеточном уровне после нейтронного смешанного луча облучения для БНКТ, за исключением маркеров З-H2AX и 53BP119. Мы предлагаем адаптацию линии раковых клеток толстой кишки HCT-116, так как она богата в DSBs foci, как стандартная линия клеток для анализа повреждений ДНК, потому что РИФ легко обнаруживаются. Эта линия адепта клетки проста в обслуживании и надлежащим для процедур облучения. Предлагаемая процедура основана на огромном количестве предыдущих исследований, связанных с общей процедурой иммунофлуоресценции окрашивания в З-H2AX. Тем не менее, он включает в себя все детали, касающиеся выбора соответствующих антител с проверенными разбавлениями для каждого репрезентативного белка, принадлежащего к каждому пути ремонта. Кроме того, он описывает использование уникального нейтронно-смешанного луча, используемого в терапии БНКТ. Тем не менее, мы рекомендуем расширить исследования с обоих методов, иммунофлуоресценции окрашивания во-первых, а затем, с высокой стоимости молекулярного анализа, как это было выполнено ранее4,17.

протокол

1. Подготовка клеточной культуры и экспериментальная настройка

  1. Поддержание человеческих клеток рака толстой кишки, HCT-116, как рекомендовано поставщиком, в монослой в 75 см2 культуры фляги, содержащие 10 мЛ сформулированы Маккой 5a Medium модифицированных, дополнены 10% плода бычьей сыворотки и 1% антибиотика антимикотического раствора.
  2. Выращивайте клетки в увлажненной среде 5% CO2 при 37 градусах Цельсия до 70% слияния со средним обновлением каждые 2-3 дня.
  3. Чтобы получить луч BNCT (например, нейтронный луч плюс 10BPA) и эффект БНКТ, убивающий раковые клетки как тяжелые частицы, и отнести большую часть своей энергии в боро-содержащихся раковых клетках, за день до облучения, добавить агента доставки бора в среду клеточной культуры - например, 10BPA, 4-Borono-L-фенилаланин (10 мкг 10B/mL, 0,925 мМ финал) 12-16 ч (максимальное поглощение бора) до облучения, как ранее изучали для клеток рака толстой кишки и раковых клеток щитовидной железы20,21.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании другой клеточной линии, для которой нет данных в случае исследования BNCT, проверьте поглощение бора для каждой клеточной линии для получения оптимальной концентрации бора. Измерьте 10BPA клеточного поглощения путем индуктивно связаны плазмы оптической спектроскопии выбросов (ICP-OES) в исполнении Dagrosa группы21.
  4. После 12-16 ч доставки бора, аспирировать средний и мыть клетки с 10 мл 1x PBS. Затем пробуйте клетки, добавляя 2 мЛ раствора Трипсина-ЭДТА в клетки и инкубировать в течение 5 минут при 37 градусов по Цельсию для усиления отсоединение клеток. Когда клетки начинают отсоединяться, прекратите действие трипсина, добавив 10 мЛ полной среды.
  5. Аспирируйте суспензию ячейки в трубке 15 мл и подсчитывайте клетки с помощью автоматизированного счетчика клеток, добавляя 10 мл 0,4% трипан синего до 10 мл клеток, смешивания и аликвотинга 10 мл на счетном слайде. Разбавить суспензию клетки до концентрации 1 х 106 клеток/мЛ среды. Aliquot 1 mL клеточной суспензии на криотвку.
  6. Подготовка термолюминесцентных дозиметров (TLDs) для измерения доз гамма-лучей и золотых фольг для нейтронных fluencies и прикрепите TLDs к криотрубам или фляме клеточной культуры перед облучением.
  7. Облучать 1 х 106 клеток/мл с нейтронно-смешанным лучом при рекомендуемом минимальном потоке теплового нейтрона 5,9 х10 11 (н/см-2 минNo1)4 в культурных колбах или криотрубках в зависимости от возможностей объекта.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Наставьте время облучения, прежде чем получить рекомендуемый поток нейтрона.
  8. После облучения, семена 1 мл облученных клеток (1 х 106 клеток / мл) на 22 х 22 мм coverslips в 35 мм Петри блюда или 6 хорошо пластин, дополнение с 2 мл требуемого среднего. Инкубировать клетки максимум 3 ч при 37 градусах в увлажненной среде 5% CO2, чтобы позволить им прикрепиться к крышки. Наблюдайте за привязанностью клеток время от времени под перевернутым микроскопом с 20-кратной целью.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для Клеток HCT-116 минимальная плотность составляет 600 000 клеток для семян. Для быстрого дальнейшего окрашивания процедуры используйте камерные слайды, соответственно снижайте плотность клеток.

2. Фиксация клеток

  1. После облучения и инкубации клеток, удалить среду из прикрепленных клеток и мыть клетки один раз с 2,5 мл PBS.
  2. Исправить клетки с 1 мл 70% этанола в течение 10 минут на RT.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Альтернативно используйте 1%-3,7% параформальдегида (ПФА) для фиксации, как рекомендовалось ранее19. Протокол приостанавливается здесь. Храните фиксированные клетки в этаноле в морозильной камере при температуре -20 градусов в течение не более нескольких недель для дальнейшего анализа и окрашивания иммунофлуоресценции.

3. Пермяковаябилизация клеток

  1. После фиксации удалить этанол из чашки Петри и промыть 2,5 мл 1x PBS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не позволяйте клеткам высохнуть между шагами полоскания.
  2. Аккуратно добавьте 1 мл 0,2% от Triton X-100/PBS, чтобы покрыть крышки с клетками в чашках Петри.
  3. Инкубация в течение 5 минут в RT.
  4. Вымойте клетки 3x с 2,5 мл 1x PBS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Увеличьте процент Triton X-100 в PBS до 0,5% при необходимости (более очаги обнаруживаются, зависят от тестируемой линии клеток). Выполните дополнительные моет с PBST (PBS с 0,5% Tween), чтобы избежать неспецифической привязки.
  5. Блок пермяки шаг с 1 mL 2% BSA (Bovine Serum Fraction V альбумин) разбавленной в PBS и инкубировать в течение как минимум 30 мин или 1 ч с 1% BSA.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг может быть опущен и зависит от типа используемого антитела. Кроме того, использовать 5% FBS, как это рекомендовано в рефери4.

4. Окрашивание иммунофлуоресценции

  1. Добавьте правильное количество первичных антител (Anti-ɣ-H2AX, Anti-DNA-PKcs и Anti-Rad52), разбавленных в PBS с BSA (2% Bovine Serum Fraction V альбумин) в соответствии с рекомендациями (см. Таблицу 1 с рекомендуемыми разбавлениями) (100 мл необходимо на образец).
Первичное антителоФункцииРекомендуемая разбавленияхранение (C)
Анти-ɣ-H2AXобнаружение ДНК-ДСБ1:1000 (PBS-BSA)4
Анти-ДНК-ПКобнаружение РИФов белка ДНК-ПК, принадлежащего NHEJ1:200 (PBS-BSA)-20
Анти-Рад52обнаружение RIFs белка Rad52, принадлежащего HRR1:200 (PBS-BSA)-20
Вторичное антителоВ неведении
анти-мышь IgG FITCɣ-H2AX очаги1:400 (PBS-BSA)4
Коза Анти-Кролик IgG H и L (Alexa Fluor 488)для NHEJ и HRR ремонт белков очагов1:500 (PBS-BSA)-20

Таблица 1: Рекомендуемые разбавления и примечания для использования антител, используемых в разделе 4.

  1. Обложка чашки Петри для поддержания влажности в пластиковой коробке с увлажненным лигнином с использованием дистиллированной воды и инкубировать в течение 30 минут при температуре 37 градусов по Цельсию в инкубаторе.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол можно приостановить здесь. Инкубация может быть выполнена при 4 градусах цельсия в течение ночи.
  2. После инкубации выполните 3 стирки с 2,5 мл PBS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не позволяйте слайду высохнуть во время полоскания.
  3. Добавьте правильное количество вторичных антител (анти-мым мыши IgG FITC, Коза Anti-Rabbit IgG (Alexa Fluor 488) разбавленный в PBS с BSA (см. таблицу 1) (100 МЛ необходимо на образец). Для этого и следующие шаги работают в темноте.
  4. Накройте чашку Петри снова для поддержания влажности в пластиковой коробке с увлажненным лигнином и инкубировать в течение 30 минут минимум при температуре 37 градусов по Цельсию в инкубаторе.
  5. После инкубации выполните 3 стирки с 2,5 мл PBS.
  6. Добавьте 100 МЛ DAPI, разбавленного в PBS, к окончательной концентрации 1 мкг/мл, чтобы противостоять ядрам.
  7. Инкубировать в ближайшее время, в течение максимум 2 мин на RT.
  8. После инкубации выполните 3 стирки с 2,5 мл PBS.
  9. Снимите PBS и аккуратно положить крышку на верхней части монтажа среды, избегая образования пузырьков воздуха и уплотнения края крышки с лаком для ногтей. Подождите, пока лак высохнет и краска coverslip вокруг.
  10. Дождитесь затвердевания монтажной среды (до 3 ч) перед анализом изображения под флуоресценцией микроскопии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол можно приостановить здесь. Храните стеклянные горки в пластиковой коробке при 4 градусов по Цельсию в темноте.

5. Приобретение и анализ изображений

  1. Приобретайте изображения с помощью флуоресценции под 100x цели с погружением нефти.
    1. Анализ очагов в ядрах с помощью флуоресценционного микроскопа, оснащенного следующими фильтрами для: Alexa Fluor 488: возбуждение выбросов (нм): 496/519, зеленый цвет выбросов; DAPI: возбуждение выбросов (нм): 358'461, цвет излучения синий.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ DSBs вдоль одночастичных треков может потребовать передовой микроскопии, как конфокальное лазерное сканирование микроскопии с более высоким разрешением.
  2. Сохранить приобретенные изображения и процесс с соответствующим программным обеспечением изображений, например, ImageJ или Image Pro3,20.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется использование отдельных макросов и плагинов, разработанных для автоматического анализа или разработки/покупки индивидуального биоинформатического программного обеспечения.
  3. При использовании программного обеспечения Image-Pro для анализа очагов, обработка изображений в файлах TIFF: выберите кнопку Count/Size, затем нажмите Типы «выберите тип измерения (например, диаметр или область)», нажмите Диапазоны «набор диапазона измерения», нажмите Сплит объектов, если это необходимо. Чтобы отрегулировать яркость, щелкните «Яркий» «отрегулируйте тресолд». Затем нажмите графа «красная кнопка».
  4. Для экспорта данных нажмите таблицу данных Статистика Экспорт в Excel. В программном обеспечении электронной таблицы нарисуйте графики с требуемым статистическим анализом.

Результаты

Во-первых, мы провели анализ стандартного маркера обнаружения ДНК-DSBs, foci в раковых клетках толстой кишки, неизлученных и облученных нейтронно-смешанным лучом. Foci q-H2AX появляются как отдельные флуоресцентные точки и показывают образование ДНК-DSB (так как каждая флуоресцентная точка q-H2AX п...

Обсуждение

Частоты очагов, иммунохимически окрашенных для q-H2AX и 53BP1 широко используются в радиобиологии и связаны с ДНК-DSB число и считаются эффективными и чувствительными маркерами для мониторинга индукции и ремонта ДНК-DSBs19. Процедура совместного окрашивания q-H2AX и 53BP1 является стан?...

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Нейтронно-смешанный луч, состоящий из нейтронного/гамма-излучения, был получен из исследовательского реактора Марии в Национальном центре ядерных исследований в Польше. K.M.O. была поддержана Национальным научным центром, Польша (Miniatura 2) грант No #2018/02/X/N'5/02849.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
12 mm CoverslipsVWR89015-725
35 mm Petri dishesSarstedt7.183.390.000
4-Borono-L-phenylalanineSIGMA-ALDRICH17755
Antibiotic-Antimycotic (100X)Gibco15240062
Anti-DNA PKcs (phospho S2056) antibody - ChIP GradAbcamAB18192
Anti-Mouse IgG (whole molecule)–FITC antibody produced in goatSIGMA-ALDRICHF0257
Anti-phospho-Histone H2A.X (Ser139) Antibody, clone JBW301MerckMillipore05-636
Anti-RAD52 antibodyAbcamAB117097
Bovine Serum Albumin Fraction V (BSA)RocheBSAV-RO
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)ThermoFisher SCIENTIFICD1306
Fetal Bovine Serum (Heat Inactivated)SIGMA-ALDRICHF9665
Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488)AbcamAB150077
HCT-116 cell lineATCCCCL-247™
ImageJNational Institute of Health (NIH)https://imagej.nih.gov/ij/
Image ProMedia cyberneticshttp://www.mediacy.com/imagepro
LUNA II Automated Cell CounterLogos BiosystemsL40002
McCoy’s 5A Medium (Modified, with L-glutamine and sodium bicarbonate)SIGMA-ALDRICHM9309
microscope slidesThermoFisher SCIENTIFICB-1198
Phosphate Buffered Saline (PBS)Hirszfeld Institute of Immunology and Experimental Therapy, PAS20.59.52.0
Triton X-100SIGMA-ALDRICHX100
Trypan Blue Stain, 0.4%Logos BiosystemsT13001
Trypsin-EDTA solution 0.25%SIGMA-ALDRICHT4049

Ссылки

  1. Carter, R. J., et al. Complex DNA Damage Induced by High Linear Energy Transfer Alpha-Particles and Protons Triggers a Specific Cellular DNA Damage Response. International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 100 (3), 776-784 (2018).
  2. Kondo, N., et al. DNA damage induced by boron neutron capture therapy is partially repaired by DNA ligase IV. Radiation Environmental Biophysics. 55 (1), 89-94 (2016).
  3. Sakai, W., Sugasawa, K. DNA Damage Recognition and Repair in Mammalian Global Genome Nucleotide Excision Repair. DNA Replication, Recombination, and Repair: Molecular Mechanisms and Pathology. , 155-174 (2016).
  4. Rodriguez, C., et al. In vitro studies of DNA damage and repair mechanisms induced by BNCT in a poorly differentiated thyroid carcinoma cell line. Radiation Environmental Biophysics. 57 (2), 143-152 (2018).
  5. Sollazzo, A., et al. Live Dynamics of 53BP1 Foci Following Simultaneous Induction of Clustered and Dispersed DNA Damage in U2OS Cells. International Journal of Molecular Sciences. 19 (2), (2018).
  6. Jeggo, P., Löbrich, M. Radiation-induced DNA damage responses. Radiation Protection Dosimetry. 122 (1-4), 124-127 (2006).
  7. Sigurdsson, S., Van Komen, S., Petukhova, G., Sung, P. Homologous DNA pairing by human recombination factors Rad51 and Rad54. The Journal of Biological Chemistry. 277 (45), 42790-42794 (2002).
  8. Choi, E. H., Yoon, S., Hahn, Y., Kim, K. P. Cellular Dynamics of Rad51 and Rad54 in Response to Postreplicative Stress and DNA Damage in HeLa Cells. Molecules and Cells. 40 (2), 143-150 (2017).
  9. Burma, S., Chen, B. P., Murphy, M., Kurimasa, A., Chen, D. J. ATM phosphorylates histone H2AX in response to DNA double-strand breaks. The Journal of Biological Chemistry. 276 (45), 42462-42467 (2001).
  10. Nakamura, T. M., Du, L. L., Redon, C., Russell, P. Histone H2A phosphorylation controls Crb2 recruitment at DNA breaks, maintains checkpoint arrest, and influences DNA repair in fission yeast. Molecular and Cellular Biology. 24 (14), 6215-6230 (2004).
  11. Kuo, L. J., Yang, L. X. Gamma-H2AX - a novel biomarker for DNA double-strand breaks. In Vivo. 22 (3), 305-309 (2008).
  12. Sage, E., Shikazono, N. Radiation-induced clustered DNA lesions: Repair and mutagenesis. Free Radical Biology and Medicine. 107, 125-135 (2017).
  13. Boguszewska, K., Szewczuk, M., Urbaniak, S., Karwowski, B. T. Review: immunoassays in DNA damage and instability detection. Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (23), 4689-4704 (2019).
  14. Møller, P., et al. Potassium bromate as positive assay control for the Fpg-modified comet assay. Mutagenesis. , (2020).
  15. Sommer, S., Buraczewska, I., Kruszewski, M. Micronucleus Assay: The State of Art, and Future Directions. International Journal of Molecular Sciences. 21 (4), 1534 (2020).
  16. Bennett, B. T., Bewersdorf, J., Knight, K. L. Immunofluorescence imaging of DNA damage response proteins: optimizing protocols for super-resolution microscopy. Methods. 48 (1), 63-71 (2009).
  17. Cheng, L., et al. Simultaneous induction of dispersed and clustered DNA lesions compromises DNA damage response in human peripheral blood lymphocytes. PLoS One. 13 (10), 0204068 (2018).
  18. Paull, T. T., et al. A critical role for histone H2AX in recruitment of repair factors to nuclear foci after DNA damage. Current Biology. 10 (15), 886-895 (2000).
  19. Okumura, K., et al. Relative biological effects of neutron mixed-beam irradiation for boron neutron capture therapy on cell survival and DNA double-strand breaks in cultured mammalian cells. Journal of Radiation Research. 54 (1), 70-75 (2013).
  20. Dagrosa, M. A., et al. First evaluation of the biologic effectiveness factors of boron neutron capture therapy (BNCT) in a human colon carcinoma cell line. International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 79 (1), 262-268 (2011).
  21. Dagrosa, A., et al. Studies for the application of boron neutron capture therapy to the treatment of differentiated thyroid cancer. Applied Radiation and Isotopes. 69 (12), 1752-1755 (2011).
  22. Reynolds, P., et al. The dynamics of Ku70/80 and DNA-PKcs at DSBs induced by ionizing radiation is dependent on the complexity of damage. Nucleic Acids Research. 40 (21), 10821-10831 (2012).
  23. Rasche, L., et al. Analysis of Lymphocytic DNA Damage in Early Multiple Sclerosis by Automated Gamma-H2AX and 53BP1 Foci Detection: A Case Control Study. PLoS One. 11 (1), 0147968 (2016).
  24. Banáth, J. P., Macphail, S. H., Olive, P. L. Radiation sensitivity, H2AX phosphorylation, and kinetics of repair of DNA strand breaks in irradiated cervical cancer cell lines. Cancer Research. 64 (19), 7144-7149 (2004).
  25. Barth, R. F., et al. Current status of boron neutron capture therapy of high grade gliomas and recurrent head and neck cancer. Radiatiation Oncology. 7, 146 (2012).
  26. Mirzaei, H. R., et al. Boron neutron capture therapy: Moving toward targeted cancer therapy. Journal of Cancer Research and Therapeutics. 12 (2), 520-525 (2016).
  27. Vitti, E. T., Parsons, J. L. The Radiobiological Effects of Proton Beam Therapy: Impact on DNA Damage and Repair. Cancers. 11 (7), 946 (2019).
  28. Mohamad, O., et al. Carbon Ion Radiotherapy: A Review of Clinical Experiences and Preclinical Research, with an Emphasis on DNA Damage/Repair. Cancers. 9 (6), 66 (2017).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

160BNCTDSBs

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены