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Resumen

En este artículo, describimos un método para medir la glucólisis y la respiración mitocondrial en células humanas primarias de Asesino Natural (NK) aisladas de sangre periférica, en reposo o después de la activación inducida por IL15. El protocolo descrito podría extenderse fácilmente a las células NK humanas primarias activadas por otras citoquinas o estímulos solubles.

Resumen

Las células de Natural Killer (NK) median principalmente las respuestas inmunitarias antitumorales y antivirales innatas y responden a una variedad de citoquinas y otros estímulos para promover la supervivencia, la proliferación celular, la producción de citoquinas como la gamma de interferón (IFN) y/o los programas de citotoxicidad. La activación de células NK por estimulación de la citoquina requiere una remodelación sustancial de las vías metabólicas para apoyar sus requisitos bioenergéticos y biosintéticos. Hay un gran cuerpo de evidencia que sugiere que el metabolismo de células NK deteriorado está asociado con una serie de enfermedades crónicas incluyendo la obesidad y el cáncer, que destaca la importancia clínica de la disponibilidad de un método para determinar el metabolismo de las células NK. Aquí describimos el uso de un analizador de flujo extracelular, una plataforma que permite mediciones en tiempo real de la glucólisis y el consumo de oxígeno mitocondrial, como una herramienta para monitorear los cambios en el metabolismo energético de las células NK humanas. El método descrito aquí también permite el seguimiento de los cambios metabólicos después de la estimulación de las células NK con citoquinas como IL-15, un sistema que actualmente se está investigando en una amplia gama de ensayos clínicos.

Introducción

Las células de Natural Killer (NK) son linfocitos innatos que median las respuestas antitumorales y antivirales. Las células NK comprenden entre el 5 y el 15% de todos los linfocitos en la sangre periférica humana, y también se pueden encontrar en el bazo, el hígado, la médula ósea y los ganglios linfáticos. Las células NK no expresan receptores clonotípicos polimórficos, como los receptores de células T (TCR) o los receptores de células B (BCR). Por el contrario, la activación de sus funciones citolíticas se debe a la realización de receptores que reconocen ligandos invariables en la superficie de una célula diana1,2.

Células NK humanas en reposo aisladas de la sangre periférica pueden sobrevivir durante varios días en medio de cultivo complementado con suero humano. La activación de las células NK por citoquinas como IL-15 o IL-2 impulsa las células a la proliferación y a un aumento de su capacidad de matar, entre otros efectos3,,4,,5. Varios estudios han demostrado una correlación directa entre la activación de la célula NK y los cambios en su actividad metabólica6. Estos cambios metabólicos están destinados a satisfacer los requisitos particulares de las células en términos de energía y biosíntesis.

Las células y organismos aeróbicos obtienen energía a través de una serie de reacciones químicas que implican el catabolismo y la oxidación de carbohidratos, grasas y proteínas. A través de una combinación de glucólisis, el ciclo de ácido tricarboxílico (TCA) y la fosforilación oxidativa, las células eucariotas satisfacen la mayoría de su demanda de ATP y obtienen los intermedios necesarios como bloques de construcción para macromoléculas esenciales para el crecimiento celular y la proliferación. El proceso de glucólisis (Figura 1A) comienza con la entrada de glucosa en la célula. En el citosol, la glucosa se fosforila y se transforma en piruvato (con una producción neta de 2 moléculas de ATP por molécula de glucosa), que se puede reducir a lactato o transportarse en las mitocondrias para transformarse en acetil-coa y entrar en el ciclo TCA. El ciclo TCA continúa en bicicleta alimentado con más moléculas de acetil-CoA y produce CO2 (que eventualmente se difunderá fuera de la célula y, al reaccionar con H2O en el medio, generará ácido carbónico que conducirá a la acidificación del medio) y NADH, la molécula encargada de donar electrones a la cadena de transporte de electrones (ETC). Los electrones viajan a través de diferentes complejos proteicos y finalmente son aceptados por el oxígeno. Estos complejos (I, III y IV) también bombean H+ desde la matriz mitocondrial en el espacio intermembrano. Como consecuencia del gradiente electroquímico generado, el H + entraráde nuevo en la matriz a través del complejo V (ATP-sintasa), invirtiendo la energía potencial acumulada en la generación de ATP.

Tanto la glucólisis como la respiración mitocondrial se pueden bloquear en diferentes puntos mediante el uso de inhibidores. El conocimiento y uso de estos inhibidores fue la base para el desarrollo del ensayo de flujo extracelular. Mediante la medición de dos parámetros simples en tiempo real como el pH y el oxígeno, el analizador de flujo extracelular infiere la tasa de glucólisis y respiración mitocondrial en una placa de 96 pozos. La prueba de esfuerzo de glucólisis se realiza en un medio basal sin glucosa (Figura 1B)7. Las primeras mediciones de la tasa de acidificación extracelular (ECAR) son indicativas de acidificación independiente de la glucólisis. Se conoce como acidificación no glucolítica y se correlaciona con elCO2 producido por el TCA que, como se explicó anteriormente, se combina con H2O en el medio para generar H+ (ECAR ligado a TCA). La primera inyección es glucosa para inducir la utilización de glucosa y aumentar la glucólisis. La segunda inyección combina tanto la rotenona, un inhibidor del Complejo I, y la antimicina A, un inhibidor del Complejo III juntos, para bloquear el ETC. Las células responden a esta disminución dramática en la producción de ATP mitocondrial mediante la activación de la glucólisis para mantener los niveles celulares de ATP, y esto representa la cantidad de glucólisis que no es utilizada por la célula en el estado basal, pero podría ser potencialmente reclutada en respuesta a aumentos en la demanda de ATP (glicólisis). La tercera inyección es la glucosa análoga 2-Deoxyglucosa (DG), que compite con la glucosa como sustrato de la enzima hexoquinasa. El producto de esta fosforilación, 2-desoxiglucosa-6-fosfato no se puede transformar en piruvato, y por lo tanto se bloquea la glucólisis, lo que reduce el ECAR al mínimo. El ECAR medido en este punto incluye otras fuentes de acidificación extracelular que no se atribuyen a la glucólisis o actividad respiratoria, así como cualquier glucólisis residual no inhibida completamente por 2-DG (post 2-DG-acidificación).

La prueba de esfuerzo mitocondrial se realiza en un medio con glucosa (Figura 1C)8. Las primeras mediciones de la tasa de consumo de oxígeno (OCR) corresponden a la línea base de la respiración mitocondrial (respiración basal). La primera inyección es la oligomicina, que inhibe el retorno de protones a través de la ATP sintasa (complejo V), bloqueando la síntesis de ATP y por lo tanto hiperpolarizar rápidamente la membrana mitocondrial, que evita el bombeo de protones a través de complejos respiratorios, y conduce a una disminución en el OCR. La comparación entre la respiración de línea de base y el valor dado por la adición de oligomicina representa la respiración vinculada a ATP. La tasa restante de consumo de oxígeno que no tiene en cuenta la oligomicina se denomina fuga de protones, que representa el flujo de protones a través de la bicapía lipídica o proteínas en la membrana mitocondrial interna, como el translocase nucleótido de adenina9. La segunda inyección es el desacoplador 2,4-dinitrofenol (DNP), un ionóforo que induce una entrada masiva de H+ en la matriz mitocondrial, que conduce a la despolarización de la membrana mitocondrial y la interrupción de la síntesis de ATP mitocondrial. Las células responden a la disipación de la fuerza de protones-motivo aumentando la tasa de transporte de electrones y el consumo de oxígeno a niveles máximos en un intento inútil de recuperar el potencial de la membrana (capacidad respiratoria máxima). La diferencia entre la capacidad respiratoria máxima y la respiración basal es la capacidad respiratoria de repuesto de la célula, que representa la cantidad de respiración que no es utilizada por la célula para generar ATP en estado basal, pero podría ser potencialmente reclutado en respuesta a aumentos en la demanda de ATP o en condiciones de estrés8. La tercera inyección es una combinación de rotenona y antimicina A. Esta inyección detiene completamente el ETC y el OCR disminuye a su nivel más bajo, siendo el consumo restante de oxígeno no mitocondrial (causado por NADPH-oxidases, etc.).

Los cambios en las vías metabólicas podrían predecir de alguna manera el funcionamiento de las células NK, ya que se ha sugerido que la activación continua de células NK con citoquinas in vitro podría conducir al agotamiento de las células NK mediante el estudio de diferentes vías metabólicas10,,11. La correlación entre el estado metabólico de las células NK y la función es muy importante desde el punto de vista de la inmunoterapia contra el cáncer. En este campo, se ha probado la activación de células NK con perfusión de IL-15, solas o en combinación con anticuerpos terapéuticos monoclonales con el fin de mejorar la matanza de células tumorales12,,13,,14. El conocimiento del estado metabólico de las células NK en respuesta a estas estrategias de tratamiento proporcionaría un valioso predictor del estado de activación de la célula NK y la función de matar.

El estudio de las vías metabólicas en otras células mieloides y linfoides como monocitos, células T y B se ha descrito15 y se han publicado métodos optimizados16. En este protocolo proporcionamos un método que combina un protocolo de aislamiento NK que produce un gran número de células NK puras y viables y un protocolo optimizado para medir la actividad metabólica utilizando un analizador de flujo extracelular. Aquí mostramos que este es un método válido para el estudio de los cambios metabólicos en el reposo y las células NK humanas activadas IL-15. Para el ensayo de flujo extracelular, se han probado y optimizado parámetros como el número de células y las concentraciones de fármacos. En comparación con otros métodos respirométricos, el analizador de flujo extracelular está totalmente automatizado y es capaz de probar en tiempo real, con cantidades muy bajas de células, hasta 92 muestras simultáneamente, y por lo tanto permite exámenes de alto rendimiento (con múltiples muestras y réplicas) de una manera relativamente rápida17.

Este método puede ser utilizado por investigadores interesados en evaluar la función celular NK mediante el estudio del metabolismo de las células NK. Se podría aplicar también a las células activadas por otras citoquinas, anticuerpos o estímulos solubles.

Protocolo

Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con los principios éticos de investigación médica de la Declaración de Helsinki. Las muestras de sangre periférica de donantes se obtuvieron del Departamento de Medicina de Transfusión de los NIH bajo el protocolo aprobado por el IRB 99-CC-0168, con el consentimiento informado por escrito del paciente.

1. Preparación de reactivos

  1. Reactivos para el aislamiento de células NK
    NOTA: Prepare estos reactivos en una capucha de cultivo celular.
    1. Preparar el tampón de separación NK: Suplemento PBS (pH 7.4) con EDTA de 1 mM y 2% De Suero de Becero Fetal (FCS) que previamente ha sido inactivado por calor (a 56oC durante 30 min).
    2. Preparar el medio de cultivo NK: Suplementar los medios modificados de Dulbecco (IMDM) de Iscove con 10% de suero humano (HS). Filtro estéril y conservar a 2-8oC. Calentar el medio a 37 oC antes de añadir a las células.
    3. Resuspender IL-15 humano en PBS a 200 g/ml.
  2. Reactivos para el ensayo de flujo extracelular
    1. Preparar los medios de ensayo: Para el medio de prueba de esfuerzo mitocondrial, añadir 1 mM de piruvato sódico, 2 mM de L-glutamina y 10 mM de glucosa al medio base; para el medio de prueba de esfuerzo de glucólisis, añadir 2 mM L-glutamina al medio base.
      NOTA: Las concentraciones de glucosa, piruvato y glutamina se proporcionan según lo recomendado por el fabricante del analizador de flujo extracelular. Sin embargo, la composición de los medios puede ser alterada por los investigadores para que coincida perfectamente con la del medio de cultivo, si se desea.
    2. Ajuste el pH de ambos medios a 7,4 con 0,1 N NaOH utilizando un medidor de pH de sobremesa, filtro estéril a través de un tamaño de poro de 0,2 oM y guárdelo a 2-8 oC. Caliente los medios a 37 oC, compruebe el pH y reajuste a 7.4 antes de usarlo si es necesario.
      NOTA: Sólo el CO2 ambiental está contenido en la atmósfera del analizador de flujo extracelular, el uso de medios sin bicarbonato es crítico.
    3. Preparar soluciones de stock para reactivos: Oligomicina (inhibidor de la sintasa ATP), solución de 10 mM en DMSO; 2,4-dinitrofenol (DNP, desacoplador), solución de 1 M en stock en DMSO; antimicina A (inhibidor DE LA III compleja), solución de 10 mM en DMSO; rotenona (inhibidor I complejo), solución de 10 mM en DMSO. Haga alícuotas de 30 ml de todos los reactivos y guárdelos a -20 oC.
      NOTA: Estas directrices están destinadas a reactivos comprados individualmente y preparados por el investigador. Si los reactivos se compran al fabricante del analizador en su lugar, siga sus directrices para la preparación de reactivos.

2. Aislamiento de células NK de la sangre periférica

  1. Preparación de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) a partir de sangre humana
    NOTA: Realice estos pasos en una capucha de cultivo celular. Descontamine todos los residuos y materiales en contacto con la sangre con lejía y deséchelos en el recipiente apropiado para ser incinerado.
    1. Pipeta 20 mL de Linfocito Medio de Separación (LSM) en un tubo cónico de 50 ml.
    2. Con cuidado, manteniendo el tubo en un ángulo de 30o, pipeta 20 ml de sangre sobre el LSM, muy suavemente y tocando la pared del tubo. Evitar la mezcla de sangre con el LSM y crear una interfase visible y bien definida entre los dos fluidos.
      NOTA: Se puede utilizar sangre periférica o productos de leucoféresis enriquecidos.
    3. Centrifugar los tubos durante 25 min, 1000 x g a temperatura ambiente. No utilice el freno, ya que podría hacer que ambas fases en el tubo (LSM y sangre) se mezclen.
    4. Saque cuidadosamente los tubos de la centrífuga y colóquelos en un bastidor. Compruebe la presencia de una capa visible de células (células mononucleares) que se formarán en la interfase entre LSM (claro) y plasma (amarillo), mientras que los glóbulos rojos pasan pellets en la parte inferior del tubo.
    5. Aspirar suavemente la capa de celda mononuclear con una pipeta de plástico de 10 ml (alrededor de 5-8 ml) y colocarla en un nuevo tubo cónico de 50 ml. La interfase de linfocitos de hasta 2 tubos diferentes se puede juntar.
    6. Lavar las células mononucleares 2x resuspendiendo en 45 ml de PBS y centrifugando a 800 x g durante 5 min, a temperatura ambiente.
      NOTA: Después de este paso, se obtiene un pellet de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y el investigador puede proceder a la etapa de aislamiento NK.
  2. Aislamiento NK de PBMC
    1. Cuente las células de 2.1.6 y resusppend en el búfer de separación NK (1x 108 PBMCs/mL).
    2. Tome 10 ml de la resuspensión celular (109 PBMC) y colóquelos en un tubo de 50 ml.
    3. Añadir 500 l (50 l/ml de tampón) de la mezcla de anticuerpos de aislamiento de células NK y 10 l (1 l/ml de tampón) de mezcla de anticuerpos de aislamiento positivo anti-CD3 a los PBMC e incubar a temperatura ambiente durante 10 min.
    4. Vórtice las perlas magnéticas y agregue 1 ml a la mezcla de PBMC con anticuerpos (100 cuentas de L/ml PBMC). Incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente con agitación ocasional.
    5. Añadir 35 ml de tampón de aislamiento NK (3,5 ml de PBMC tampón/ml), mezclar y colocar sobre el imán durante 15 min (2,2 x 107 PBMC/ml). Después de ese tiempo, las cuentas y las células seleccionadas positivamente (todas excepto las células NK) se habrán adherido a las paredes del tubo.
    6. Recoja cuidadosamente el sobrenadante (que contiene células NK) con una pipeta de plástico de 50 ml sin tocar los lados o la parte inferior del tubo.
    7. Cuente las células usando un contador de celdas y centrífuga a 800 x g durante 5 min.
    8. Resuspender células NK aisladas a 5 x 106 células/ml en IMDM que contengan 10% de HS y colocarlas en una incubadora a 37 oC con 5% de CO2 hasta que se realice el experimento.
      NOTA: Este protocolo de aislamiento NK indica números de células y volúmenes de reactivos adaptados para el uso de un tubo de 50 ml y un imán grande. Este protocolo se puede escalar verticalmente (en caso de que se obtengan más PBCC) repitiendo los pasos de aislamiento en diferentes tubos o reduciendo la escala reduciendo el volumen en el tubo. Para volúmenes finales de 14-45 ml se utiliza un tubo de poliestireno de 50 ml, para los volúmenes 4-14, se utiliza un tubo de poliestireno de 15 ml y para volúmenes de 1-4 ml, se utiliza un tubo de poliestireno de 5 ml. El imán es diferente y se ajusta al tubo adecuado en cada caso. La cantidad de mezcla de anticuerpos y perlas magnéticas también se puede escalar de acuerdo con el número de células y el volumen final.
  3. Tinción de la población de células NK para la citometría de flujo
    1. Tomar 0,25 x 106 células por muestra del paso 2.2.8, retirar el medio centrifugando a 800 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente y resuspender el pellet celular en 500 l de PBS.
    2. Añadir tinte de viabilidad de acuerdo con la recomendación del fabricante (1 l de tinte reconstituido por DMSO a 1 ml de resuspensión celular) e incubar a temperatura ambiente durante 30 min.
    3. Lavar 2x resuspendiendo en PBS de 5 ml y centrifugando a 800 x g durante 5 min, a temperatura ambiente.
    4. Mancha con los anticuerpos antihumanos correspondientes en 100 l de IMDM que contengan 10% de HS durante 30 minutos sobre hielo protegido de la luz (ver Tabla 1). Todos los anticuerpos se pueden combinar y utilizar en un solo paso de tinción.
    5. Analizar las muestras por citometría de flujo para evaluar la pureza de la población de células NK obtenida. Utilice el método de medición y análisis de celdas que se han descrito anteriormente18,19.
  4. Estimulación de células NK con IL-15 soluble
    1. Resuspender 0,75 x 106 celdas de los pasos 2.2.8 o 2.4.3 en 100 l de IMDM que contiene 10% de HS en un pozo de una placa de 96 bien (fondo redondo).
    2. Diluir el IL-15 humano a 1 g/ml en IMDM que contenga 10% de HS. Añadir 100 l de la IL-15 humana diluida a las células para alcanzar una concentración final de 0,5 g/ml.
      NOTA: 0,5 g/ml es una concentración saturadora de IL-15. Las concentraciones más bajas de IL-15 u otras citoquinas como IL-2, IL-12 o IL-18 pueden ser probadas por investigadores si se desea.
    3. Colocar las células en la incubadora a 37 oC y estimular durante 48 h antes de realizar el ensayo de flujo extracelular. Resuspenda las células no estimuladas (control) a la misma concentración y volumen en IMDM que contiene 10% de HS sin IL-15, y colóquelas en la misma incubadora durante 48 h.

3. Hidratación del cartucho del sensor

NOTA: Las 96 puntas de sonda del cartucho del sensor contienen fluoróforos individuales de estado sólido para O2 y H+ que necesitan ser hidratados para detectar cambios de O2 y pH.

  1. Encienda el analizador y deje que se caliente hasta 37 oC.
  2. Abra el paquete del cartucho del sensor y separe el cartucho del sensor de la placa de servicio. Añadir 200 l de la solución calibradora en cada pocóptico de la placa de utilidad y volver a colocar el cartucho del sensor en la placa, validando que los sensores están completamente sumergidos en la solución. Para obtener resultados óptimos, incubar el cartucho durante la noche a 37oC en una incubadora libre deCO2que esté debidamente humidificada para evitar la evaporación. Evitar la formación de burbujas bajo los sensores durante la hidratación.
    NOTA: El tiempo mínimo de hidratación del cartucho es de 4 h a 37 oC en una incubadora libre deCO2. Alternativamente, se puede utilizar la hidratación durante la noche del cartucho del sensor con 200 l de agua estéril a 37oC en una incubadora libre de CO2,seguida de una incubación del cartucho del sensor con 200 l de solución calibradora precalentada 45 – 60 min antes del inicio de la carrera.

4. Ensayo de flujo extracelular

  1. Preparación de placas recubiertas de adhesivo
    NOTA: Dado que la medición de los parámetros metabólicos tiene lugar en una microcámara formada en la parte inferior de la placa de ensayo de 96 pozos, las células de suspensión deben adherirse primero a la parte inferior del pozo. Se emplea un adhesivo celular extraído del mejillón Mytilus edulis. El fabricante del adhesivo celular recomienda una concentración de recubrimiento de 1 a 5 g/cm2. El pozo de la microplaca de cultivo celular analizador tiene una superficie de aproximadamente 0.110 cm2. Por lo tanto, para una concentración de 5 g/cm2, se requieren alrededor de 0,55 g de adhesivo. Dado que se utilizarán 25 l de la solución adhesiva para recubrir cada pocól, la concentración óptima de la solución adhesiva para las microplacas de cultivo celular del analizador es de alrededor de 22,4 g/ml (22,4 g/ml x 0,025 ml a 0,56 g).
    1. Preparar 2,5 ml de solución adhesiva celular (22,4 g/ml) en bicarbonato sódico de 0,1 M, pH 8,0. El bicarbonato proporciona el pH óptimo para el rendimiento de la célula adherente que, según el fabricante, está entre 6.5 y 8.0.
    2. Pipetear 25 l de la solución adhesiva celular a cada pocómao de la placa de ensayo e incubar a temperatura ambiente durante 20 min. Después de eso, retire la solución y lave 2x con 200 l de agua estéril/pozo. Deje que los pozos se sequen manteniendo la placa abierta durante 15 minutos dentro de una capucha de cultivo celular.
      NOTA: Las placas recubiertas pueden almacenarse hasta 1 semana a 4 oC.
  2. Siembra celular en placas recubiertas con adhesivo
    1. Células centrífugas del paso 2.4.3 a 200 x g durante 5 min a temperatura ambiente. Retire los sobrenadantes y las células de lavado en el medio de prueba de esfuerzo mitocondrial calentado (si se está realizando una prueba de esfuerzo mitocondrial) o en el medio de prueba de esfuerzo de glucólisis (si se está realizando una prueba de esfuerzo de glucólisis). Células de pellets de nuevo y resuspend a la concentración celular preferida en el mismo medio (volumen de resuspensión dependerá de la concentración celular elegida; ya que cada pocópido contendrá 180 l de la suspensión celular, preparar 0,26 x 106, 0,52 x10 6, 1,04 x 106, 2,08 x 106, 4,17 x 106 y 8,33 x 106 células/ml de las suspensiones de células para 40.047 x 106, 0.094 x 106, 0.187 x 106, 0.375 x 106, 0.75 x 106 y 1.5 x 106 celdas por pozo respectivamente).
    2. Placa de 180 l de suspensión celular por pozo a lo largo del lado de cada pocól. Se recomienda una pipeta multicanal. Utilice los pozos A1, A12, H1 y H12 de la placa de cultivo del analizador como pozos de control para la corrección de fondo. Añadir 180 l del medio de ensayo en estos potes (sin células). Se pueden utilizar pozos de control adicionales si se desea y si hay suficiente espacio en la placa.
      NOTA: La presencia de suero puede causar un apego celular deficiente.
    3. Incubar la placa durante 30 min a 37oC en una incubadora libre de CO2. Preparar 10x compuestos mientras tanto (ver paso 4.3 a continuación).
    4. Cambie la configuración de la centrífuga a cero frenado. Centrifugar la placa a 200 x g durante 5 min. Observe las células bajo el microscopio para comprobar que forman una monocapa en la parte inferior del pozo. Transfiera las placas de vuelta a la incubadora libre de CO2durante 25 min. Para obtener mejores resultados, el tiempo total después del chapado no debe ser mayor que alrededor de 1 h.
  3. Preparación de soluciones de trabajo 10x para cargar en el cartucho del sensor
    NOTA: Cada una de las 96 puntas de sonda del cartucho del sensor alberga 4 puertos (A, B, C y D) que se pueden utilizar para inyectar compuestos secuencialmente en pozos individuales.
    1. Para realizar la prueba de esfuerzo mitocondrial, prepare 2,5 ml cada una de 10 m de oligomicina, 1 mM DNP y una mezcla de rotenona de 10 m y antimicina A de 10 m, en un medio de ensayo de estrés mitocondrial (utilice las soluciones de stock del paso 1.2.3). Las concentraciones finales en el pozo después de la inyección serán de 1 m de oligomicina, 0,1 mM DNP y 1 M de antimicina A/rotenona.
    2. Para realizar la prueba de esfuerzo de glucólisis, prepare 2,5 ml de una mezcla de rotenona de 10 m y antimicina A de 10 m en el medio de ensayo de tensión de glucólisis (utilice las soluciones de stock del paso 1.2.3). Disolver la glucosa en el medio de prueba de esfuerzo de glucólisis para una solución de 100 mM y 2-desoxi-glucosa (2-DG) en medio de prueba de esfuerzo de glucólisis para una solución de 500 mM. Las concentraciones finales en el pozo después de la inyección serán de 10 mM de glucosa, 1 m de antimicina A/rotenona y 50 mM 2-DG.
    3. Soluciones cálidas a 37oC, compruebe el pH y reajuste a 7.4 si es necesario. Cargar compuestos preparados en el paso 4.3.1. (para una prueba de esfuerzo mitocondrial) o 4.3.2 (para una prueba de esfuerzo de glucólisis) en los puertos A, B y C del cartucho del sensor hidratado (desde el paso 3.2) utilizando un micropipettor multicanal y las guías de carga de puertos proporcionadas con el cartucho, como se muestra en la Tabla 2.
      NOTA: Para garantizar una inyección adecuada en todos los pozos durante el ensayo, cada serie de puertos que se utilizan (por ejemplo, todos los puertos A) deben contener el mismo volumen de inyección en todo el cartucho del sensor. Esto se aplica a los pozos de corrección de fondo e incluso a aquellos pozos no utilizados en el experimento.
    4. Incubar el cartucho del sensor cargado a 37oC en una incubadora libre de CO2mientras configura el programa.
  4. Configuración de protocolos de ensayo de flujo extracelular
    1. Abra el software del analizador de flujo extracelular y, utilizando las pestañas Definiciones de grupo y Mapa de placas, indique grupos de pozos que tienen condiciones similares (por ejemplo, pozos con el mismo número de celdas o pozos con celdas en reposo o celdas estimuladas por IL-15). Además, indique los pozos de corrección de fondo (por defecto se establecerán A1, A12, H1 y H12, pero se pueden utilizar pozos adicionales) y pozos vacíos.
    2. Configure el programa descrito en la Tabla 3 del software mediante la pestaña Protocolo.
    3. Comience el programa con la pestaña Ejecutar ensayo. Coloque el cartucho del sensor (hidratado y cargado con 10 compuestos) y la placa de utilidad en la bandeja. Después del paso de calibración (15 – 20 min), cuando se le solicite, reemplace la placa calibradora de la placa de ensayo (sin tapa) por las celdas conectadas. Después de esto, la carrera está totalmente automatizada (la máquina realizará todas las mediciones e inyecciones).
      NOTA: Es posible realizar una prueba de esfuerzo mitocondrial y una prueba de esfuerzo glucolítico en la misma placa, siempre y cuando los compuestos específicos se carguen en los puertos adecuados (oligomicina, DNP y antimicina/rotenona en los puertos A, B y C respectivamente de los pozos donde se realiza una prueba de esfuerzo mitocondrial; glucosa, antimicina/rotenona y 2-DG en los puertos A, B y C respectivamente de los pozos donde se realiza una prueba de esfuerzo de glucólisis), los mismos volúmenes de inyecciones se utilizan en cada serie de puertos y pozos para cada prueba se identifican adecuadamente utilizando las pestañas Definiciones de grupo y Mapa de placas del software.
    4. Después de completar la ejecución, recupere los datos y analícelos utilizando el software.

5. Determinación del número de celda

NOTA: Los resultados se pueden normalizar para tener en cuenta las posibles diferencias en el número de celda. Se pueden utilizar dos enfoques principales que se describen a continuación.

  1. Determinación del contenido de ADN
    1. Retire el medio de ensayo restante con una pipeta de cada pozo. Al aspirar medio, tenga cuidado de no molestar a las células. La placa se puede almacenar a -20 oC hasta el análisis.
      NOTA: El paso de congelación es importante para la determinación eficiente de la lelisis celular y el contenido del ADN.
    2. Preparar una solución 1x de tampón de lisis celular de ensayo de proliferación celular (20x) en agua destilada (200 l/pozo).
    3. Agregue la solución de material de tinte de ensayo de proliferación celular (400x) en el búfer de 1x lisis celular. Para la detección de 50 a 50.000 células por pozo, utilice un tinte de ensayo de proliferación celular 1x. Para números de células más altos, se recomienda utilizar el tinte de ensayo de proliferación celular a una concentración final superior a 1x. En este caso, utilice el tinte de ensayo de proliferación celular a una concentración final de 5x (diluir la solución de ensayo de proliferación celular 80 veces en 1x tampón de lisis celular).
    4. Añadir 200 l del reactivo de ensayo de proliferación celular a cada pocód siguiente. Incubar las muestras durante 2-5 minutos a temperatura ambiente. Proteger de la luz.
    5. Medir la fluorescencia de las muestras en excitación: 480 nm; emisión: 520 nm utilizando un lector de microplacas de fluorescencia de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.
  2. Determinación del contenido de proteínas
    1. Con cuidado, aspirar completamente el medio de ensayo de cada pozo sin ˚tocar las células y congelar las células a -20oC durante al menos 1 h. Alternativamente, las células se pueden mantener congeladas durante más tiempo (hasta 1 semana) hasta que se realiza el análisis.
    2. Añadir 50 l de medio de lisis de ensayo de radioinmunoprecipitación (RIPA) complementado con inhibidores de la proteasa 1x (de una solución de 100x en stock) a cada pocól. Coloque la placa sobre una coctelera durante 5 minutos a temperatura ambiente, y luego incubar la placa sobre hielo durante 30 minutos para una lelisis celular completa.
    3. Centrifugar la placa durante 5 min a 200 x g a temperatura ambiente. Este paso hará que los desechos celulares se desnúdase para evitar interferencias con la medición de proteínas.
    4. Mida la concentración de proteínas mediante un ensayo de ácido bicinchoninico (BCA) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.

Resultados

El aislamiento de las células NK de la sangre periférica proporciona una población pura y viable

El ensayo de flujo extracelular se basa en la medición de la concentración de H+ y O2 en el pozo y no distinguirá entre diferentes poblaciones de células o su viabilidad. Por esta razón, la obtención de una población altamente pura y viable de la célula de interés fue el paso clave para tener éxito en estos experimentos.

Discusión

En este artículo, hemos establecido un protocolo para aislar y cultivar eficientemente células NK humanas primarias y viables a partir de sangre periférica. También hemos optimizado las condiciones para la medición de la actividad metabólica de estas células NK evaluadas por la tasa de consumo de oxígeno y la tasa de acidificación extracelular mediante el uso de un analizador de flujo extracelular. En comparación con otros métodos respirométricos, el analizador de flujo extracelular es rápido, requiere un pe...

Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses financieros competidores.

Agradecimientos

Los autores agradecen al Dr. Michael N. Sack (Instituto Nacional del Corazón, los Pulmones y la Sangre) el apoyo y la discusión. Este estudio fue apoyado por los Programas de Investigación Intramuros de los Institutos Nacionales de Salud, el Instituto Nacional del Cáncer y el Instituto Nacional del Corazón, pulmón y sangre. JT cuenta con el apoyo del programa Ramón y Cajal (beca RYC2018-026050-I) de MICINN (España).

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
2-Deoxy-D-glucose (2-DG)MilliporeSigmaD8375-5GGlycolyisis stress test injector compound
2,4-Dinotrophenol (2,4-DNP)MilliporeSigmaD198501ETC uncoupler / mitochondrial stress test injector compound
96 Well Cell Culture Plate/ Round bottom with LidCostar3799NK cell culture
Antimycin AMilliporeSigmaA8674Complex III inhibitor / glycolysis and mitochondrial stress test injector compound
BD FACSDIVA SoftwareBD BiosciencesFlow data acquisition
BD LSR FortessaBD BiosciencesFlow data acquisition
Cell-TakCorning354240Cell adhesive
CyQUANT cell proliferation assayThermoFisher ScientificC7026Cell proliferation Assay for DNA quantification. Contains cell-lysis buffer and CyQUANT GR dye
EasySep Human CD3 Positive Selection Kit IIStemcell technologies17851NK cell isolation from PBMCs
EasySep Human NK cell Enrichment KitStemcell technologies19055NK cell isolation from PBMCs
EasySep MagnetStemcell technologies18001NK cell isolation from PBMCs
EDTA 0.5 M, pH 8Quality Biological10128-446NK sell separation buffer
FACS tubesFalcon-Fisher Scientific352235Flow cytometry experiment
Falcon 50 ml Conical tubesFalcon-Fisher Scientific14-432-22NK cell separation
Fetal Calf Serum (FCS)Gibco10437-028NK cell separation buffer
FlowJo SoftwareBD BiosciencesFlow data analysis
GlucoseMilliporeSigmaG8270Component of mitochondrial stress test medium. Glycolysis stress test injector compound
Halt Protease Inhibitor CocktailThermoFisher Scientific78429Protease inhibitor 100X. Use in RIPA lysis buffer
Human IL-15Peprotech200-15-50ugNK cell stimulation
Human serum (HS)Valley Biomedical9C0539NK cell culture medium supplement
IMDMGibco12440053NK cell culture medium
L-Glutamine (200 mM)ThermoFisher Scientific25030-081Component of stress test media
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain KitThermoFisher ScientificL34965Viability dye for flow cytometry staining
LSMmpbio50494XPBMCs separation from human blood
Mouse anti-human CD3 BV711BD Biosciences563725T cell flow cytometry staining
Mouse anti-human CD56 PEBD Pharmingen555516NK flow cytometry staining
Mouse anti-human NKp46 PEBD Pharmingen557991NK flow cytometry staining
OligomycinMilliporeSigma75351Complex V inhibitor / mitochondrial stress test injector compound
PBS pH 7.4Gibco10010-023NK cell separation buffer
Pierce BCA Protein Assay KitThermoFisher Scientific23225For determination of protein concentration
RIPA BufferBoston BioProductsBP-115Cell lysis
RotenoneMilliporeSigmaR8875Complex II inhibitor / glycolysis and mitochondrial stress test injector compound
Seahorse Wave Controller SoftwareAgilentController for the Seahorse XFe96 Analyzer
Seahorse Wave Desktop SoftwareAgilentFor data analysis
Seahorse XF Base MediumAgilent102353-100Extracellular Flux assay base medium
Seahorse XFe96 AnalyzerAgilentExtracellular Flux Analyzer
Seahorse XFe96 FluxPakAgilent102416-100Includes 20 XF96 cell culture plates, 18 XFe96 sensor cartridges, loading guides for transferring compounds to the assay cartridge, and 1 bottle of calibrant solution (500 ml).
Sodium bicarbonateMilliporeSigmaS5761To prepare the Cell-Tak solution
Sodium pyruvate (100 mM)ThermoFisher Scientific11360-070Component of mitochondrial stress test medium

Referencias

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