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Resumo

Neste artigo, descrevemos um método para medir a glicólise e a respiração mitocondrial em células primárias do Assassino Natural (NK) humanas isoladas do sangue periférico, em repouso ou após a ativação induzida pelo IL15. O protocolo descrito poderia ser facilmente estendido para células NK humanas primárias ativadas por outras citocinas ou estímulos solúveis.

Resumo

As células do Natural Killer (NK) mediam principalmente respostas anti-tumor e imunes antivirais e respondem a uma variedade de citocinas e outros estímulos para promover a sobrevivência, a proliferação celular, a produção de citocinas como os programas de interferon gama (IFNγ) e/ou citotoxicidade. A ativação celular NK por estimulação de citocina requer uma remodelagem substancial das vias metabólicas para suportar seus requisitos bioenergésicos e biossintéticos. Há um grande conjunto de evidências que sugerem que o metabolismo celular NK prejudicado está associado a uma série de doenças crônicas, incluindo obesidade e câncer, o que destaca a importância clínica da disponibilidade de um método para determinar o metabolismo celular NK. Aqui descrevemos o uso de um analisador de fluxo extracelular, uma plataforma que permite medições em tempo real de glicolise e consumo mitocondrial de oxigênio, como uma ferramenta para monitorar mudanças no metabolismo energético das células NK humanas. O método aqui descrito também permite o monitoramento de alterações metabólicas após a estimulação de células NK com citocinas como o IL-15, um sistema que está sendo investigado atualmente em uma ampla gama de ensaios clínicos.

Introdução

As células do Natural Killer (NK) são linfócitos inatos que mediam respostas anti-tumor e antivirais. As células NK compreendem 5-15% de todos os linfócitos no sangue periférico humano, e também podem ser encontradas em baço, fígado, medula óssea e linfonodos. As células NK não expressam receptores clonotípicos polimórficos, como receptores de células T (TCR) ou receptores de células B (BCR). Em contraste, a ativação de suas funções citíticas é motivada pelo engajamento de receptores que reconhecem ligantes invariáveis na superfície de uma célula alvo1,2.

Células NK humanas descansando isoladas do sangue periférico podem sobreviver por vários dias em meio de cultura suplementada com soro humano. A ativação de células NK por citocinas como IL-15 ou IL-2 leva as células à proliferação e ao aumento de sua capacidade de matar, entre outros efeitos3,,4,,5. Vários estudos têm mostrado uma correlação direta entre a ativação celular NK e mudanças em sua atividade metabólica6. Essas alterações metabólicas são destinadas a atender aos requisitos particulares das células em termos de energia e biossíntese.

Células aeróbicas e organismos obtêm energia através de uma série de reações químicas que envolvem o catabolismo e oxidação de carboidratos, gorduras e proteínas. Através de uma combinação de glicólise, o ciclo do ácido tricarboxílico (TCA) e a fosforilação oxidativa, as células eucarióticas atendem a maioria de sua demanda ATP e obtêm intermediários necessários como blocos de construção para macromoléculas essenciais para o crescimento e proliferação celular. O processo de glicólise (Figura 1A) começa com a entrada de glicose na célula. No citosol, a glicose é fosforilada e transformada em piruvato (com uma produção líquida de 2 moléculas de ATP por molécula de glicose), que pode ser reduzida a lactato ou transportada para as mitocôndrias para ser transformada em Acetil-CoA e entrar no ciclo TCA. O ciclo TCA continua pedalando abastecido com mais moléculas de Acetil-CoA e produz CO2 (que eventualmente se difundirá fora da célula e, reagindo com H2O no meio, gerará ácido carbônico que levará à acidificação do meio) e NADH, a molécula encarregada de doar elétrons para a cadeia de transporte de elétrons (ETC). Os elétrons viajam através de diferentes complexos proteicos e são finalmente aceitos pelo oxigênio. Esses complexos (I, III e IV) também bombeiam H+ da matriz mitocondrial para o espaço intermembrano. Como consequência do gradiente eletroquímico gerado, o H+ entrará novamente na matriz através do complexo V (ATP-synthase), investindo a energia potencial acumulada na geração de ATP.

Tanto a glicolise quanto a respiração mitocondrial podem ser bloqueadas em diferentes pontos usando inibidores. O conhecimento e o uso desses inibidores foram a base para o desenvolvimento do ensaio de fluxo extracelular. Medindo dois parâmetros simples em tempo real, como pH e oxigênio, o analisador de fluxo extracelular infere a taxa de glicolise e respiração mitocondrial em uma placa de 96 poços. O teste de estresse da glicólise é realizado em um meio basal sem glicose (Figura 1B)7. As primeiras medidas da taxa de acidificação extracelular (ECAR) são indicativas de acidificação independente da glicólise. É referido como acidificação não glicolítico e se correlaciona com o CO2 produzido pelo TCA que, como explicado anteriormente, combina com H2O no meio para gerar H+ (ECAR ligado ao TCA). A primeira injeção é a glicose para induzir a utilização da glicose e aumentar a glicólise. A segunda injeção combina ambos rotenone, um inibidor complexo I, e antimicina A, um inibidor complexo III em conjunto, para bloquear o ETC. As células respondem a essa dramática diminuição na produção de ATP mitocondrial ativando a glicolise para manter os níveis de ATP celular, e isso representa a quantidade de glicólise que não é usada pela célula no estado basal, mas poderia ser potencialmente recrutada em resposta ao aumento da demanda da ATP (glicolycolysis compensatória). A terceira injeção é a glicose analógica 2-Desoxicose (DG), que compete com a glicose como substrato para a enzima hexokinase. O produto desta fosforilação, 2-desoxicosglucose-6-fosfato não pode ser transformado em piruvato, e, portanto, a glicólise é bloqueada, o que reduz o ECAR ao seu mínimo. O ECAR medido neste ponto inclui outras fontes de acidificação extracelular que não são atribuídas à glicólise ou atividade respiratória, bem como qualquer glicolise residual não totalmente inibida pelo 2-DG (pós 2-DG-acidificação).

O teste de estresse mitocondrial é realizado em um meio com glicose (Figura 1C)8. As primeiras medições da taxa de consumo de oxigênio (OCR) correspondem à linha base da respiração mitocondrial (respiração basal). A primeira injeção é a oligomicina, que inibe o retorno de prótons através da sintetizadora ATP (complexa V), bloqueando a síntese de ATP e, assim, hiperpolarizar rapidamente a membrana mitocondrial, que impede o bombeamento de prótons através de complexos respiratórios, e leva a uma diminuição do OCR. A comparação entre a respiração da linha de base e o valor dado pela adição de oligomicina representa a respiração ligada à ATP. A taxa de consumo insensível de oligomicina remanescente é chamada de vazamento de prótons, que representa o fluxo de prótons através do bicamadorão lipídico ou proteínas na membrana mitocondrial interna, como o nucleotídeo de adenina translocase9. A segunda injeção é o uncoupler 2,4-dinitrophenol (DNP), um ionóforo que induz uma entrada maciça de H+ na matriz mitocondrial, o que leva à despolarização da membrana mitocondrial e à interrupção da síntese mitocondrial do ATP. As células respondem à dissipação da força-motivo do próton aumentando a taxa de transporte de elétrons e consumo de oxigênio para níveis máximos em uma tentativa fútil de recuperar o potencial da membrana (capacidade respiratória máxima). A diferença entre a capacidade respiratória máxima e a respiração basal é a capacidade respiratória sobressal da célula, que representa a quantidade de respiração que não é usada pela célula para gerar ATP no estado basal, mas pode ser potencialmente recrutada em resposta ao aumento da demanda de ATP ou sob condições de estresse8. A terceira injeção é uma combinação de rotenona e antimicina A. Esta injeção interrompe completamente o ETC e o OCR diminui para seu nível mais baixo, com o consumo restante de oxigênio sendo não mitocondrial (causado por NADPH-oxidases, etc.).

Mudanças nas vias metabólicas poderiam de alguma forma prever o funcionamento das células NK, como tem sido sugerido que a ativação contínua de células NK com citocinas in vitro poderia levar à exaustão celular NK pelo estudo de diferentes vias metabólicas10,,11. A correlação entre o estado metabólico das células NK e a função é muito importante do ponto de vista da imunoterapia do câncer. Neste campo, a ativação de células NK com infusão de IL-15, isoladamente ou em combinação com anticorpos terapêuticos monoclonais foram testadas a fim de melhorar a morte de células tumorais12,,13,14. O conhecimento do estado metabólico das células NK em resposta a essas estratégias de tratamento forneceria um valioso preditor do status de ativação celular NK e função de morte.

O estudo de vias metabólicas em outras células mieloides e linfoides, como monócitos, células T e B, foi descrito15 e métodos otimizados foram publicados16. Neste protocolo, fornecemos um método que combina tanto um protocolo de isolamento NK que produz altos números de células NK puras e viáveis e um protocolo otimizado para medir a atividade metabólica usando um analisador de fluxo extracelular. Aqui mostramos que este é um método válido para o estudo de alterações metabólicas em repouso e células NK humanas ativadas il-15. Para o ensaio de fluxo extracelular, parâmetros como número de células e concentrações de drogas foram testados e otimizados. Comparado com outros métodos respirométricos, o analisador de fluxo extracelular é totalmente automatizado e capaz de testar em tempo real, com quantidades muito baixas de células, até 92 amostras simultaneamente, e assim permite triagens de alto rendimento (com múltiplas amostras e réplicas) de forma relativamente rápida17.

Este método pode ser usado por pesquisadores interessados em avaliar a função celular NK estudando o metabolismo celular NK. Pode ser aplicado também às células ativadas por outras citocinas, anticorpos ou estímulos solúveis.

Protocolo

Todos os experimentos foram realizados de acordo com a Declaração dos princípios éticos da pesquisa médica de Helsinque. Amostras de sangue periféricas de doadores foram obtidas do Departamento de Medicina transfusional do NIH sob o protocolo aprovado pelo IRB 99-CC-0168, com consentimento informado por escrito do paciente.

1. Preparação do reagente

  1. Reagentes para o isolamento de células NK
    NOTAs: Prepare esses reagentes em um capuz de cultura celular.
    1. Prepare o tampão de separação NK: Suplemento PBS (pH 7.4) com 1 mM EDTA e 2% de soro de bezerro fetal (FCS) que já foi inativado pelo calor (a 56 °C por 30 min).
    2. Prepare o meio de cultura NK: Suplemento Iscove's Modified Dulbecco's Media (IMDM) com soro humano 10% (HS). Filtro estéril e armazenar a 2-8 °C. Aqueça o médio a 37 °C antes de adicionar às células.
    3. Resuspend Humano IL-15 em PBS a 200 μg/mL.
  2. Reagentes para ensaio de fluxo extracelular
    1. Prepare a mídia de ensaio: Para o meio de teste de estresse mitocondrial, adicione 1 mM de piruvato de sódio, 2 mM L-glutamina e 10 mM de glicose ao meio base; para o meio de teste de estresse da glicolise, adicione 2 mM L-glutamina ao meio base.
      NOTA: As concentrações de glicose, piruvato e glutamina são fornecidas conforme recomendado pelo fabricante do analisador de fluxo extracelular. No entanto, a composição da mídia pode ser alterada pelos pesquisadores para corresponder perfeitamente à do meio cultural, se desejar.
    2. Ajuste o pH de ambas as mídias para 7,4 com 0,1 N NaOH usando um medidor de pH no topo do banco, filtro estéril através de um tamanho de poro de 0,2 μM e armazene a 2-8 °C. Mídia quente a 37 °C, verifique o pH e reajuste para 7,4 antes de usar, se necessário.
      NOTA: Apenas o CO2 ambiente está contido na atmosfera do analisador de fluxo extracelular, o uso de mídia sem bicarbonato é fundamental.
    3. Preparar soluções de estoque para reagentes: Oligomicina (inibidor de atp synthase), solução de estoque de 10 mM em DMSO; 2,4-dinitrophenol (DNP, desacoplador), solução de estoque de 1 M em DMSO; antimicina A (inibidor complexo III), solução de estoque de 10 mM em DMSO; rotenone (inibidor complexo I), solução de estoque de 10 mM em DMSO. Faça 30 alíquotas de μL de todos os reagentes e armazene a -20 °C.
      NOTA: Essas orientações destinam-se aos reagentes comprados individualmente e preparados pelo pesquisador. Se os reagentes forem comprados do fabricante do analisador, siga suas diretrizes para a preparação do reagente.

2. Isolamento de células NK do sangue periférico

  1. Células mononucleares de sangue periféricas (PBMCs) preparação do sangue humano
    NOTA: Realize essas etapas em um capô de cultura celular. Descontaminar todos os resíduos e materiais em contato com sangue com alvejante e descartá-los no recipiente apropriado para ser incinerado.
    1. Pipeta 20 mL de Lymphocyte Separation Medium (LSM) em um tubo cônico de 50 mL.
    2. Com cuidado, mantendo o tubo em um ângulo de 30°, pipeta 20 mL de sangue sobre o LSM, muito suavemente e tocando a parede do tubo. Evite a mistura de sangue com o LSM e crie uma interfase visível e bem definida entre os dois fluidos.
      NOTA: Pode-se utilizar sangue periférico ou produtos de leucemia enriquecidos.
    3. Centrifugar os tubos por 25 min, 1000 x g em temperatura ambiente. Não utilize freio, pois pode fazer as duas fases do tubo (LSM e sangue) se misturarem.
    4. Retire cuidadosamente os tubos da centrífuga e coloque-os em um rack. Verifique a presença de uma camada visível de células (células mononucleares) que se formarão na interfase entre LSM (claro) e plasma (amarelo), enquanto as células vermelhas do sangue pelotam na parte inferior do tubo.
    5. Aspire suavemente a camada de célula mononuclear com uma pipeta de plástico de 10 mL (em torno de 5-8 mL) e coloque-a em um novo tubo cônico de 50 mL. A linfócito interfálica de até 2 tubos diferentes pode ser agrupada.
    6. Lave as células mononucleares 2x por reutilização em PBS de 45 mL e centrifugação a 800 x g por 5 min, à temperatura ambiente.
      NOTA: Após esta etapa, uma pelota de células mononucleares periféricas de sangue (PBMCs) é obtida e o pesquisador pode prosseguir para a etapa de isolamento nk.
  2. Isolamento NK dos PBMCs
    1. Conte as células a partir de 2.1.6 e resuspenque-as no Tampão de Separação NK (1x 108 PBMCs/mL).
    2. Pegue 10 mL da ressuspensão celular (109 PBMCs ) e coloque-os em um tubo de 50 mL.
    3. Adicione 500 μL (50 μL/mL de tampão) de mistura de anticorpos de isolamento celular NK e 10 μL (1 μL/ mL de tampão) de mistura de anticorpos de isolamento positivo anti-CD3 aos PBMCs e incubar à temperatura ambiente por 10 minutos.
    4. Vórtice as contas magnéticas e adicione 1 mL à mistura de PBMCs com anticorpos (100 contas μL/ml PBMCs). Incubar por 10 minutos em temperatura ambiente com ocasionalmente agitação.
    5. Adicione 35 mL de tampão de isolamento NK (3,5 ml buffer/ml PBMCs), misture e coloque no ímã por 15 min (2,2 x 107 PBMCs/mL). Após esse período, as contas e células positivamente selecionadas (todas menos células NK) terão aderido às paredes do tubo.
    6. Colete cuidadosamente o supernasce (contendo células NK) com uma pipeta de plástico de 50 mL sem tocar nas laterais ou na parte inferior do tubo.
    7. Conte as células usando um contador de células e centrífuga a 800 x g por 5 min.
    8. Resuspend células NK isoladas a 5 x 106 células/mL em IMDM contendo 10% de HS e colocá-las em uma incubadora a 37 °C com 5% de CO2 até que o experimento seja realizado.
      NOTA: Este protocolo de isolamento NK afirma números de células e volumes de reagentes adaptados para o uso de um tubo de 50 mL e um grande ímã. Este protocolo pode ser ampliado (no caso de mais PBMCs serem obtidos) repetindo as etapas de isolamento em diferentes tubos ou reduzidos reduzindo o volume no tubo. Para volumes finais de 14-45 mL é utilizado um tubo de poliestireno de 50 mL, para volumes 4-14, é utilizado um tubo de poliestireno de 15 mL e para volumes de 1-4 mL, é utilizado um tubo de poliestireno de 5 mL. O ímã é diferente e se encaixa no tubo apropriado em cada caso. A quantidade de mistura de anticorpos e contas magnéticas também pode ser dimensionada de acordo com o número de células e o volume final.
  3. Coloração da população celular NK para citometria de fluxo
    1. Pegue 0,25 x 106 células por amostra a partir da etapa 2.2.8, remova o meio por centrifugação a 800 x g por 5 min à temperatura ambiente e resuspense a pelota da célula em 500 μL de PBS.
    2. Adicione corante de viabilidade de acordo com a recomendação do fabricante (1 μL de corante reconstituído de DMSO a 1 mL de resuspensão celular) e incubar em temperatura ambiente por 30 minutos.
    3. Lave 2x por resususpending em 5 mL PBS e centrifugação a 800 x g por 5 min, em temperatura ambiente.
    4. Mancha com os anticorpos anti-humanos correspondentes em 100 μL de IMDM contendo 10% de HS por 30 minutos no gelo protegidos da luz (ver Tabela 1). Todos os anticorpos podem ser combinados e usados em uma única etapa de coloração.
    5. Analisar as amostras por citometria de fluxo para avaliar a pureza da população celular NK obtida. Use o método de gating e análise celular descrito anteriormente18,19.
  4. Estimulação de células NK com IL-15 solúvel
    1. Resuspenque 0,75 x 106 células das etapas 2.2.8 ou 2,4,3 em 100 μL de IMDM contendo 10% de HS em um poço de 96 bem-placas (fundo redondo).
    2. Diluir il-15 a 1 μg/mL em IMDM contendo 10% de HS. Adicione 100 μL do IL-15 humano diluído às células para atingir uma concentração final de 0,5 μg/mL.
      NOTA: 0,5 μg/mL é uma concentração saturada de IL-15. Concentrações mais baixas de IL-15 ou outras citocinas como IL-2, IL-12 ou IL-18 podem ser testadas por pesquisadores, se desejarem.
    3. Coloque as células na incubadora a 37 °C e estimule por 48 horas antes de realizar o ensaio de fluxo extracelular. Resuspend células não estimuladas (controle) na mesma concentração e volume no IMDM contendo 10% de HS sem IL-15, e colocá-las na mesma incubadora por 48 h.

3. Hidratação do cartucho do sensor

NOTA: As 96 pontas da sonda do cartucho do sensor contêm fluoroforos de estado sólido individuais para O2 e H+ que precisam ser hidratados para detectar as alterações de O2 e pH.

  1. Ligue o analisador e deixe aquecer até 37 °C.
  2. Abra a embalagem do cartucho do sensor e separe o cartucho do sensor da placa do utilitário. Adicione 200 μL da solução calibrante em cada poço da placa de utilidade e coloque de volta o cartucho do sensor na placa, validando que os sensores estão completamente submersos na solução. Para obter resultados ideais, incubar o cartucho durante a noite a 37 °C em uma incubadora livre de CO2que é adequadamente umidificada para evitar a evaporação. Evite a formação de bolhas sob os sensores durante a hidratação.
    NOTA: O tempo mínimo de hidratação do cartucho é de 4h a 37 °C em uma incubadora livre de CO2. Alternativamente, a hidratação durante a noite do cartucho do sensor com 200 μL de água estéril a 37 °C em uma incubadora livre de CO2,seguida de uma incubação do cartucho do sensor com 200 μL de solução calibrante pré-aquecida 45 – 60 min antes do início da corrida, pode ser usada.

4. Ensaio de fluxo extracelular

  1. Preparação de placas revestidas de adesivo
    NOTA: Uma vez que a medição dos parâmetros metabólicos ocorre em uma microcâmara formada na parte inferior da placa de ensaio de 96 poços, as células de suspensão devem primeiro ser aderidas ao fundo do poço. Um adesivo celular extraído do mexilhões Mytilus edulis é empregado. O fabricante do adesivo de célula recomenda uma concentração de revestimento de 1 a 5 μg/cm2. O poço da microplacão de cultura celular analisador tem uma superfície de aproximadamente 0,110 cm2. Assim, para uma concentração de 5 μg/cm2, são necessários cerca de 0,55 μg de adesivo. Como 25 μL da solução adesiva será usada para revestir cada poço, a concentração ideal de solução adesiva para as microplações de cultura celular analisador é de cerca de 22,4 μg/mL (22,4 μg/mL x 0,025 mL = 0,56 μg).
    1. Prepare 2,5 mL de solução adesiva celular (22,4 μg/mL) em 0,1 M de bicarbonato de sódio, pH 8.0. O bicarbonato fornece o pH ideal para o desempenho aderente de células que, segundo o fabricante, está entre 6,5 e 8,0.
    2. Pipeta 25 μL da solução adesiva celular para cada poço da placa de ensaio e incubar à temperatura ambiente por 20 minutos. Depois disso, remova a solução e lave 2x com 200 μL de água/poço estéril. Deixe os poços secarem mantendo a placa aberta por 15 minutos dentro de um capô de cultura celular.
      NOTA: As placas revestidas podem ser armazenadas por até 1 semana a 4 °C.
  2. Semeadura celular em placas revestidas com adesivo
    1. Centrífugas células da etapa 2.4.3 a 200 x g por 5 min a temperatura ambiente. Remova supernacantes e lave células em meio de teste de estresse mitocondrial aquecido (se um teste de estresse mitocondrial estiver sendo realizado) ou meio de teste de estresse de glicolise (se um teste de estresse de glicolise estiver sendo realizado). As células de pelotas novamente e resuspensam à concentração celular preferencial no mesmo meio (o volume de ressuspensão dependerá da concentração celular escolhida; uma vez que cada poço conterá 180 μL de suspensão celular, preparar 0,26 x 106, 0,52 x 106, 1,04 x 106, 2.08 x 106, 4,17 x 106 e 8,33 x 106 células/mL suspensões celulares para 6 0,047 x 106, 0,094 x 106, 0,187 x 106, 0,375 x 106, 0,75 x 106 e 1. 5 x 106 células por poço, respectivamente).
    2. Placa 180 μL de suspensão celular por poço ao longo do lado de cada poço. Recomenda-se uma pipeta multicanal. Use os poços A1, A12, H1 e H12 da placa de cultura analisador como poços de controle para correção de fundo. Adicione 180 μL do meio de ensaio nestes poços (sem células). Poços de controle adicionais podem ser usados se desejarem e se houver espaço suficiente na placa.
      NOTA: A presença de soro pode causar má fixação celular.
    3. Incubar a placa por 30 min a 37 °C em uma incubadora livre de CO2. Prepare compostos de 10x nesse meio tempo (veja o passo 4.3 abaixo).
    4. Altere as configurações da centrífuga para zero de frenagem. Centrifugar a placa a 200 x g por 5 min. Observe as células sob o microscópio para verificar se elas formam uma monocamada na parte inferior do poço. Transfira as placas de volta para a incubadora sem CO2por 25 minutos. Para melhores resultados, o tempo total após o revestimento não deve ser maior do que em torno de 1 h.
  3. Preparação de soluções de trabalho 10x para carregar em cartucho de sensor
    NOTA: Cada uma das 96 pontas da sonda do cartucho do sensor abriga 4 portas (A, B, C e D) que podem ser usadas para injetar compostos sequencialmente em poços individuais.
    1. Para realizar o teste de estresse mitocondrial, prepare 2,5 mL cada um de 10 μM de oligomicina, 1 mM DNP e uma mistura de rotenona de 10 μM e 10 μM de antimicina A, no meio de ensaio de estresse mitocondrial (use as soluções de estoque da etapa 1.2.3). As concentrações finais no poço após a injeção serão 1 μM de oligomicina, 0,1 mM DNP e 1 μM de antimicina A/rotenona.
    2. Para realizar o teste de estresse da glicólise, prepare 2,5 mL de uma mistura de rotenona de 10 μM e 10 μM de antimicina A no meio de ensaio de estresse da glicolise (use as soluções de estoque a partir da etapa 1.2.3). Dissolver a glicose no meio de teste de estresse da glicolise para uma solução de 100 mM e 2-desoxi-glicose (2-DG) em meio de teste de estresse de glicolise para uma solução de 500 mM. As concentrações finais no poço após a injeção serão de 10 mM de glicose, 1 μM de antimicina A/rotenona e 50 mM 2-DG.
    3. Soluções quentes a 37 °C, verifique o pH e reajuste para 7,4, se necessário. Compostos de carga preparados na etapa 4.3.1. (para um teste de estresse mitocondrial) ou 4.3.2 (para um teste de estresse de glicolise) nas portas A, B e C do cartucho de sensor hidratado (a partir da etapa 3.2) utilizando um micropipetador multicanal e as guias de carregamento de porta fornecidas com o cartucho, conforme mostrado na Tabela 2.
      NOTA: Para garantir a injeção adequada em todos os poços durante o ensaio, cada série de portas que são usadas (por exemplo, todas as portas A) devem conter o mesmo volume de injeção em todo o cartucho do sensor. Isso se aplica a poços de correção de fundo e até mesmo àqueles poços não utilizados no experimento.
    4. Incubar o cartucho de sensor carregado a 37 °C em uma incubadora livre de CO2durante a configuração do programa.
  4. Configuração de protocolos de ensaio de fluxo extracelular
    1. Abra o software de analisador de fluxo extracelular e, usando as guias De Definições de Grupo e Mapa de Placas, indique grupos de poços que têm condições semelhantes (por exemplo, poços com o mesmo número de células ou poços com células de repouso ou células estimuladas pelo IL-15). Além disso, indicar poços de correção de fundo (por padrão A1, A12, H1 e H12 serão definidos, mas poços adicionais podem ser usados) e poços vazios.
    2. Configure o programa descrito na Tabela 3 no software usando a guia Protocolo.
    3. Inicie o programa usando a guia Executar ensaios. Coloque o cartucho do sensor (hidratado e carregado com compostos de 10x) e a placa de utilidade na bandeja. Após a etapa de calibração (15 – 20 min), quando solicitado, substitua a placa calibrante pela placa de ensaio (sem tampa) por células presas. Depois disso, a execução é totalmente automatizada (a máquina executará todas as medições e injeções).
      NOTA: É possível realizar um teste de estresse mitocondrial e um teste de estresse glicolítico na mesma placa, desde que os compostos específicos sejam carregados nas portas adequadas (oligomicina, DNP e antimicina/rotenona nas portas A, B e C, respectivamente, dos poços onde é realizado um teste de estresse mitocondrial; glicose, antimicina/rotenona e 2-DG nas portas A, B e C, respectivamente, dos poços onde é realizado um teste de estresse glicólise), os mesmos volumes para injeções são usados em cada série de portas e poços para cada teste são devidamente identificados utilizando as guias de Definição de Grupo e Mapas de Placas do software.
    4. Após a conclusão da execução, recupere os dados e analise-os usando o software.

5. Determinação do número de células

NOTA: Os resultados podem ser normalizados para explicar possíveis diferenças no número de células. Duas abordagens principais descritas abaixo podem ser usadas.

  1. Determinação do conteúdo de DNA
    1. Remova o meio de ensaio restante com uma pipeta de cada poço. Ao aspirar o meio, tome cuidado para não perturbar as células. A placa pode ser armazenada a -20 °C até a análise.
      NOTA: O passo de congelamento é importante para a eficiente lise celular e determinação do conteúdo de DNA.
    2. Prepare uma solução 1x de tampão de prótese celular (20x) em água destilada (200 μL/well).
    3. Adicione a solução de estoque de corante de ensaio de proliferação celular (400x) no tampão de 1x de lise celular. Para a detecção de 50 a 50.000 células por poço, use corante de ensaio de proliferação de células 1x. Para maiores números celulares, recomenda-se o uso do ensaio de proliferação celular em uma concentração final superior a 1x. Neste caso, use o corante de ensaio de proliferação celular em uma concentração final de 5x (diluir a solução de estoque de ensaio de proliferação celular 80 vezes em 1x tampão de lise celular).
    4. Adicione 200 μL do reagente de ensaio de proliferação celular a cada poço. Incubar as amostras por 2-5 min em temperatura ambiente. Proteja-se contra a luz.
    5. Medir a fluorescência das amostras em excitação: 480 nm; emissão: 520 nm usando um leitor de microplaca de fluorescência de acordo com as recomendações do fabricante.
  2. Determinação do teor de proteína
    1. Com cuidado, aspire completamente o meio de ensaio de cada poço sem tocar nas células e congele as células a -20 °C por pelo menos 1 h. Alternativamente, as células podem ser mantidas congeladas por mais tempo (até 1 semana) até que a análise seja realizada.
    2. Adicione 50 μL de ensaio radioimunoprecipitação (RIPA) médio suplementado com inibidores de protease 1x (de uma solução de estoque de 100x) para cada poço. Coloque a placa em um shaker por 5 minutos à temperatura ambiente e, em seguida, incubar a placa no gelo por 30 minutos para uma lise celular completa.
    3. Centrifugar a placa por 5 min a 200 x g em temperatura ambiente. Esta etapa irá pelotar detritos celulares para evitar interferências na medição da proteína.
    4. Medir a concentração de proteínas por ácido bicinchonínico (BCA) de acordo com as recomendações do fabricante.

Resultados

O isolamento das células NK do sangue periférico proporciona uma população pura e viável

O ensaio de fluxo extracelular baseia-se na medição da concentração de H+ e O2 no poço e não distinguirá entre diferentes populações de células ou sua viabilidade. Por essa razão, a obtenção de uma população altamente pura e viável da célula de interesse foi o passo fundamental para ter sucesso nesses experimentos.

O i...

Discussão

Neste artigo, estabelecemos um protocolo para isolar e culminar eficientemente células NK humanas primárias puras e viáveis a partir de sangue periférico. Também otimizamos as condições para a medição da atividade metabólica dessas células NK avaliadas pela taxa de consumo de oxigênio e taxa de acidificação extracelular usando um analisador de fluxo extracelular. Comparado com outros métodos respirométricos, o analisador de fluxo extracelular é rápido, requer um pequeno número de células e permite tri...

Divulgações

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

Os autores agradecem ao Dr. Michael N. Sack (National Heart, Lung, and Blood Institute) pelo apoio e discussão. Este estudo foi apoiado pelos Programas de Pesquisa Intramuros dos Institutos Nacionais de Saúde, Instituto Nacional de Câncer e Instituto Nacional do Coração, Pulmão e Sangue. JT é apoiado pelo programa Ramon y Cajal (grant RYC2018-026050-I) da MICINN (Espanha).

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
2-Deoxy-D-glucose (2-DG)MilliporeSigmaD8375-5GGlycolyisis stress test injector compound
2,4-Dinotrophenol (2,4-DNP)MilliporeSigmaD198501ETC uncoupler / mitochondrial stress test injector compound
96 Well Cell Culture Plate/ Round bottom with LidCostar3799NK cell culture
Antimycin AMilliporeSigmaA8674Complex III inhibitor / glycolysis and mitochondrial stress test injector compound
BD FACSDIVA SoftwareBD BiosciencesFlow data acquisition
BD LSR FortessaBD BiosciencesFlow data acquisition
Cell-TakCorning354240Cell adhesive
CyQUANT cell proliferation assayThermoFisher ScientificC7026Cell proliferation Assay for DNA quantification. Contains cell-lysis buffer and CyQUANT GR dye
EasySep Human CD3 Positive Selection Kit IIStemcell technologies17851NK cell isolation from PBMCs
EasySep Human NK cell Enrichment KitStemcell technologies19055NK cell isolation from PBMCs
EasySep MagnetStemcell technologies18001NK cell isolation from PBMCs
EDTA 0.5 M, pH 8Quality Biological10128-446NK sell separation buffer
FACS tubesFalcon-Fisher Scientific352235Flow cytometry experiment
Falcon 50 ml Conical tubesFalcon-Fisher Scientific14-432-22NK cell separation
Fetal Calf Serum (FCS)Gibco10437-028NK cell separation buffer
FlowJo SoftwareBD BiosciencesFlow data analysis
GlucoseMilliporeSigmaG8270Component of mitochondrial stress test medium. Glycolysis stress test injector compound
Halt Protease Inhibitor CocktailThermoFisher Scientific78429Protease inhibitor 100X. Use in RIPA lysis buffer
Human IL-15Peprotech200-15-50ugNK cell stimulation
Human serum (HS)Valley Biomedical9C0539NK cell culture medium supplement
IMDMGibco12440053NK cell culture medium
L-Glutamine (200 mM)ThermoFisher Scientific25030-081Component of stress test media
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain KitThermoFisher ScientificL34965Viability dye for flow cytometry staining
LSMmpbio50494XPBMCs separation from human blood
Mouse anti-human CD3 BV711BD Biosciences563725T cell flow cytometry staining
Mouse anti-human CD56 PEBD Pharmingen555516NK flow cytometry staining
Mouse anti-human NKp46 PEBD Pharmingen557991NK flow cytometry staining
OligomycinMilliporeSigma75351Complex V inhibitor / mitochondrial stress test injector compound
PBS pH 7.4Gibco10010-023NK cell separation buffer
Pierce BCA Protein Assay KitThermoFisher Scientific23225For determination of protein concentration
RIPA BufferBoston BioProductsBP-115Cell lysis
RotenoneMilliporeSigmaR8875Complex II inhibitor / glycolysis and mitochondrial stress test injector compound
Seahorse Wave Controller SoftwareAgilentController for the Seahorse XFe96 Analyzer
Seahorse Wave Desktop SoftwareAgilentFor data analysis
Seahorse XF Base MediumAgilent102353-100Extracellular Flux assay base medium
Seahorse XFe96 AnalyzerAgilentExtracellular Flux Analyzer
Seahorse XFe96 FluxPakAgilent102416-100Includes 20 XF96 cell culture plates, 18 XFe96 sensor cartridges, loading guides for transferring compounds to the assay cartridge, and 1 bottle of calibrant solution (500 ml).
Sodium bicarbonateMilliporeSigmaS5761To prepare the Cell-Tak solution
Sodium pyruvate (100 mM)ThermoFisher Scientific11360-070Component of mitochondrial stress test medium

Referências

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