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Zusammenfassung

In diesem Artikel beschreiben wir eine Methode zur Messung der Glykolyse und mitochondrialen Atmung in primären menschlichen natürlichen Killerzellen (NK), die aus peripherem Blut isoliert sind, im Ruhezustand oder nach IL15-induzierter Aktivierung. Das beschriebene Protokoll könnte leicht auf primäre menschliche NK-Zellen ausgedehnt werden, die durch andere Zytokine oder lösliche Reize aktiviert werden.

Zusammenfassung

Natural Killer (NK) Zellen vermitteln hauptsächlich angeborene Anti-Tumor- und antivirale Immunreaktionen und reagieren auf eine Vielzahl von Zytokinen und anderen Reizen, um das Überleben, die Zellproliferation, die Produktion von Zytokinen wie Interferongamma (IFN) und/oder Zytotoxizitätsprogramme zu fördern. Die Aktivierung von NK-Zellen durch Zytokinstimulation erfordert eine erhebliche Umgestaltung der Stoffwechselwege, um ihre bioenergetischen und biosynthetischen Anforderungen zu unterstützen. Es gibt eine große Menge von Beweisen, die darauf hindeuten, dass beeinträchtigter NK-Zellstoffwechsel mit einer Reihe von chronischen Krankheiten wie Fettleibigkeit und Krebs verbunden ist, was die klinische Bedeutung der Verfügbarkeit einer Methode zur Bestimmung des NK-Zellstoffwechsels unterstreicht. Hier beschreiben wir den Einsatz eines extrazellulären Flussanalysators, einer Plattform, die Echtzeitmessungen der Glykolyse und des mitochondrialen Sauerstoffverbrauchs ermöglicht, als Werkzeug zur Überwachung von Veränderungen im Energiestoffwechsel menschlicher NK-Zellen. Die hier beschriebene Methode ermöglicht auch die Überwachung von Stoffwechselveränderungen nach der Stimulation von NK-Zellen mit Zytokinen wie IL-15, einem System, das derzeit in einer Vielzahl von klinischen Studien untersucht wird.

Einleitung

Natürliche Killerzellen (NK) sind angeborene Lymphozyten, die Antitumor- und antivirale Reaktionen vermitteln. NK-Zellen machen 5-15% aller Lymphozyten im menschlichen peripheren Blut aus und können auch in Milz-, Leber-, Knochenmark- und Lymphknoten gefunden werden. NK-Zellen exprimieren keine polymorphen Clonoppic-Rezeptoren wie T-Zell-Rezeptoren (TCR) oder B-Zell-Rezeptoren (BCR). Im Gegensatz dazu wird die Aktivierung ihrer zytolytischen Funktionen durch das Eingreifen von Rezeptoren ausgelöst, die unveränderliche Liganden auf der Oberfläche einer Zielzelle1,2erkennen.

Ruhende menschliche NK-Zellen, die aus peripherem Blut isoliert sind, können mehrere Tage im Kulturmedium überleben, das mit menschlichem Serum ergänzt wird. Die Aktivierung von NK-Zellen durch Zytokine wie IL-15 oder IL-2 treibt die Zellen zur Proliferation und zu einer Erhöhung ihrer Tötungsfähigkeit, unter anderem3,4,5. Mehrere Studien haben eine direkte Korrelation zwischen NK-Zellaktivierung und Veränderungen ihrer metabolischen Aktivität gezeigt6. Diese metabolischen Veränderungen sind dazu bestimmt, die besonderen Anforderungen der Zellen in Bezug auf Energie und Biosynthese zu erfüllen.

Aerobe Zellen und Organismen erhalten Energie durch eine Reihe von chemischen Reaktionen, die den Katabolismus und die Oxidation von Kohlenhydraten, Fett und Proteinen beinhalten. Durch eine Kombination aus Glykolyse, dem Tricarbonsäurezyklus (TCA) und oxidativer Phosphorylierung erfüllen eukaryotische Zellen den Großteil ihres ATP-Bedarfs und erhalten Zwischenprodukte, die als Bausteine für Makromoleküle benötigt werden, die für das Zellwachstum und die Zellproliferation unerlässlich sind. Der Prozess der Glykolyse (Abbildung 1A) beginnt mit dem Eintrag von Glukose in der Zelle. Im Zytosol wird Glukose phosphoryliert und in Pyruvat umgewandelt (mit einer Nettoproduktion von 2 Molekülen VON ATP pro Glukosemolekül), die zu Laktat reduziert oder in die Mitochondrien transportiert werden können, um in Acetyl-CoA umgewandelt zu werden und in den TCA-Zyklus einzutreten. Der TCA-Zyklus setzt den Zyklus mit mehr Molekülen von Acetyl-CoA weiter und produziert CO2 (das schließlich außerhalb der Zelle diffundieren wird und durch Reaktion mitH2O im Medium Kohlensäure erzeugt, die zur Versauerung des Mediums führt) und NADH, dem Molekül, das für die Elektronenabgabe an die Elektronentransportkette (ETC) zuständig ist. Die Elektronen wandern durch verschiedene Proteinkomplexe und werden schließlich durch Sauerstoff akzeptiert. Diese Komplexe (I, III und IV) pumpen auch H+ aus der mitochondrialen Matrix in den Intermembranraum. Als Folge des erzeugten elektrochemischen Gradienten wird das H+ durch die komplexe V (ATP-Synthase) wieder in die Matrix eindringen und die in die ATP-Erzeugung angesammelte potentielle Energie investieren.

Sowohl die Glykolyse als auch die mitochondriale Atmung können an verschiedenen Stellen durch die Verwendung von Inhibitoren blockiert werden. Das Wissen und die Verwendung dieser Inhibitoren war die Grundlage für die Entwicklung des extrazellulären Fluss-Assays. Durch die Messung von zwei einfachen Parametern in Echtzeit wie pH und Sauerstoff leitet der extrazelluläre Flussanalysator die Rate der Glykolyse und der mitochondrialen Atmung in einer 96-Well-Platte ab. Der Glykolyse-Stresstest wird in einem Basalmedium ohne Glukose durchgeführt (Abbildung 1B)7. Die ersten Messungen der extrazellulären Versauerungsrate (ECAR) deuten auf eine glykolyseunabhängige Versauerung hin. Es wird als nicht-glykolytische Versauerung bezeichnet und korreliert mitCO2, das von der TCA produziert wird, die, wie bereits erläutert, mitH2O im Medium kombiniert wird, um H+ (TCA-verknüpftes ECAR) zu erzeugen. Die erste Injektion ist Glukose, um Glukose-Nutzung zu induzieren und DieGlykolyse zu steigern. Die zweite Injektion kombiniert sowohl Roton- als auch ein Complex-I-Hemmer und Antimycin A, ein Komplexer III-Hemmer zusammen, um den ETC zu blockieren. Zellen reagieren auf diese dramatische Abnahme der mitochondrialen ATP-Produktion durch Aktivierung der Glykolyse zur Aufrechterhaltung der zellulären ATP-Spiegel, und dies stellt die Menge an Glykolyse dar, die von der Zelle im Basalzustand nicht verwendet wird, sondern möglicherweise als Reaktion auf die Erhöhung der ATP-Nachfrage rekrutiert werden könnte. Die dritte Injektion ist die Glukose analog e2-Deoxyglucose (DG), die mit Glukose als Substrat für das Enzym Hexokinase konkurriert. Das Produkt dieser Phosphorylierung, 2-Deoxyglucose-6-Phosphat kann nicht in Pyruvat umgewandelt werden, und daher wird die Glykolyse blockiert, was das ECAR auf das Minimum senkt. Das an dieser Stelle gemessene ECAR umfasst andere Quellen der extrazellulären Versauerung, die nicht der Glykolyse oder Atemaktivität zugeschrieben werden, sowie jede verbleibende Glykolyse, die durch 2-DG (nach der 2-DG-Versauerung) nicht vollständig gehemmt wird.

Der mitochondriale Stresstest wird in einem Medium mit Glukose durchgeführt (Abbildung 1C)8. Die ersten Messungen der Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) entsprechen der Grundlinie der mitochondrialen Atmung (Basalatmung). Die erste Injektion ist Oligomycin, das die Rückkehr von Protonen durch die ATP-Synthase (Komplex V) hemmt, die ATP-Synthese blockiert und damit die mitochondriale Membran schnell hyperpolarisiert, was ein weiteres Protonenpumpen durch Atemkomplexe verhindert und zu einer Abnahme der OCR führt. Der Vergleich zwischen der Basisatmung und dem durch Addition von Oligomycin angegebenen Wert stellt die ATP-verknüpfte Atmung dar. Die verbleibende Oligomycin-unempfindliche Rate des Sauerstoffverbrauchs wird Protonenleck genannt, das den Fluss von Protonen durch die Lipid-Doppelschicht oder Proteine in der inneren mitochondrialen Membran wie das Adenin-Nukleotid-Translocase9darstellt. Die zweite Injektion ist der Unkoppler 2,4-Dinitrophenol (DNP), ein Ionophor, das einen massiven Eintrag von H+ in die mitochondriale Matrix induziert, was zu einer Depolarisation der mitochondrialen Membran und einer Störung der mitochondrialen ATP-Synthese führt. Zellen reagieren auf die Ableitung der Protonen-Antriebskraft, indem sie die Rate des Elektronentransports und des Sauerstoffverbrauchs auf ein Höchstmaß erhöhen, um das Membranpotenzial (maximale Atemkapazität) wiederzuerlangen. Der Unterschied zwischen der maximalen Atemfrequenz und der Basalatmung ist die freie Atemkapazität der Zelle, die die Menge der Atmung darstellt, die nicht von der Zelle verwendet wird, um ATP im Basalzustand zu erzeugen, sondern möglicherweise als Reaktion auf die Erhöhung der ATP-Nachfrage oder unter Stressbedingungen eingestellt werden könnte8. Die dritte Injektion ist eine Kombination aus Roton und Antimycin A. Diese Injektion stoppt die ETC vollständig und OCR sinkt auf den niedrigsten Stand, wobei der verbleibende Sauerstoffverbrauch nicht mitochondrial ist (verursacht durch NADPH-Oxidasen usw.).

Veränderungen der Stoffwechselwege könnten irgendwie die Funktionsweise von NK-Zellen vorhersagen, da es vorgeschlagen wurde, dass die kontinuierliche Aktivierung von NK-Zellen mit Zytokinen in vitro zu einer Erschöpfung der NK-Zellen durch die Untersuchung verschiedener Stoffwechselwege führen könnte10,11. Die Korrelation zwischen dem metabolischen Status und der Funktion der NK-Zelle ist aus der Sicht der Krebsimmuntherapie sehr wichtig. In diesem Bereich wurde die Aktivierung von NK-Zellen mit Infusion von IL-15, allein oder in Kombination mit monoklonalen therapeutischen Antikörpern getestet, um die Tumorzelltötung12,13,14zu verbessern. Das Wissen um den metabolischen Status der NK-Zellen als Reaktion auf diese Behandlungsstrategien würde einen wertvollen Prädiktor für den Aktivierungsstatus und die Tötungsfunktion der NK-Zellen liefern.

Die Untersuchung von Stoffwechselwegen in anderen myeloischen und lymphoiden Zellen wie Monozyten, T- und B-Zellen wurde beschrieben15 und optimierte Methoden wurden veröffentlicht16. In diesem Protokoll bieten wir eine Methode, die sowohl ein NK-Isolationsprotokoll kombiniert, das eine hohe Anzahl reiner und lebensfähiger NK-Zellen liefert, als auch ein optimiertes Protokoll zur Messung der metabolischen Aktivität mit einem extrazellulären Flussanalysator. Hier zeigen wir, dass dies eine gültige Methode für die Untersuchung von metabolischen Veränderungen in ruhenden und IL-15 aktivierten menschlichen NK-Zellen ist. Für den extrazellulären Flusstest wurden Parameter wie Zellzahl und Wirkstoffkonzentrationen getestet und optimiert. Im Vergleich zu anderen respirometrischen Methoden ist der extrazelluläre Flussanalysator vollautomatisch und in der Lage, in Echtzeit zu testen, mit sehr geringen Zellmengen, bis zu 92 Proben gleichzeitig, und ermöglicht somit Hochdurchsatz-Screenings (mit mehreren Proben und Replikationen) relativ schnell17.

Diese Methode kann von Forschern verwendet werden, die an der Beurteilung der NK-Zellfunktion interessiert sind, indem sie den NK-Zellstoffwechsel untersuchen. Es könnte auch auf Zellen angewendet werden, die durch andere Zytokine, Antikörper oder lösliche Reize aktiviert werden.

Protokoll

Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit der Erklärung von Helsinkis ethischen Grundsätzen der medizinischen Forschung durchgeführt. Periphere Blutproben von Spendern wurden von der NIH-Abteilung für Transfusionsmedizin gemäß dem von der IRB zugelassenen Protokoll 99-CC-0168 mit schriftlicher Zustimmung des Patienten erhalten.

1. Reagenzzubereitung

  1. Reagenzien zur Isolierung von NK-Zellen
    HINWEISE: Bereiten Sie diese Reagenzien in einer Zellkulturhaube vor.
    1. Nk-Trennpuffer vorbereiten: Zusatz-PBS (pH 7,4) mit 1 mM EDTA und 2% Fetal Calf Serum (FCS), das zuvor wärmeinaktiviert wurde (bei 56 °C für 30 min).
    2. Vorbereiten des NK-Kulturmediums: Ergänzen Sie Iscoves modifizierte Dulbecco-Medien (IMDM) mit 10% Human Serum (HS). Sterilfilter und bei 2-8 °C lagern. Erwärmen Sie das Medium auf 37 °C, bevor Sie es den Zellen hinzufügen.
    3. Setzen Sie Human IL-15 in PBS bei 200 g/ml aus.
  2. Reagenzien für extrazellulären Flusstest
    1. Assay-Medien vorbereiten: Für das mitochondriale Stresstestmedium 1 mM Natriumpyruvat, 2 mM L-Glutamin und 10 mM Glukose in das Basismedium geben; für Glykolyse-Stresstestmedium 2 mM L-Glutamin in das Basismedium geben.
      HINWEIS: Die Konzentrationen von Glukose, Pyruvat und Glutamin werden wie vom Hersteller des extrazellulären Flussanalysators empfohlen. Die Medienzusammensetzung kann jedoch von den Forschern verändert werden, um auf Wunsch perfekt mit der des Kulturmediums übereinzupassen.
    2. Stellen Sie den pH-Wert beider Medien auf 7,4 mit 0,1 N NaOH mit einem pH-Meter an der Bank ein, steriler Filter durch eine Porengröße von 0,2 m und lagern Sie ihn bei 2-8 °C. Warmmedien auf 37 °C, pH-Wert prüfen und vor Dem Einsatz vor Gebrauch auf 7,4 umstellen.
      HINWEIS: In2 der Atmosphäre des extrazellulären Flussanalysators ist nur Umgebungs-CO2 enthalten, die Verwendung von Medien ohne Bicarbonat ist entscheidend.
    3. Bereiten Sie Lagerlösungen für Reagenzien vor: Oligomycin (ATP-Synthase-Inhibitor), 10 mM Stofflösung in DMSO; 2,4-Dinitrophenol (DNP, Entkoppler), 1 M Stammlösung in DMSO; Antimycin A (komplexer III-Hemmer), 10 mM Stofflösung in DMSO; Rotone (Komplex I-Hemmer), 10 mM Stammlösung in DMSO. Machen Sie 30 L Aliquots aller Reagenzien und lagern Sie bei -20 °C.
      HINWEIS: Diese Richtlinien sind für Reagenzien bestimmt, die einzeln gekauft und vom Forscher hergestellt werden. Wenn stattdessen Reagenzien beim Analysatorhersteller gekauft werden, befolgen Sie die Richtlinien für die Reagenzienzubereitung.

2. Isolierung von NK-Zellen aus peripherem Blut

  1. Periphere mononukleäre Blutzellen (PBMCs) aus menschlichem Blut
    HINWEIS: Führen Sie diese Schritte in einer Zellkulturhaube aus. Alle Rückstände und Materialien, die mit Blut in Berührung mit Bleichmittel gelangen, zu dekontaminieren und in den entsprechenden Behälter zu entsorgen, um verbrannt zu werden.
    1. Pipette 20 ml Lymphozytentrennmedium (LSM) in ein 50 ml konisches Rohr.
    2. Vorsichtig, während das Rohr in einem 30° Winkel zu halten, Pipette 20 ml Blut über dem LSM, sehr sanft und berühren die Wand des Rohres. Vermeiden Sie das Mischen von Blut mit dem LSM und schaffen Sie eine sichtbare und klar definierte Interphase zwischen den beiden Flüssigkeiten.
      HINWEIS: Peripheres Blut oder angereicherte Leukapherese-Produkte können verwendet werden.
    3. Zentrifugieren Sie die Rohre für 25 min, 1000 x g bei Raumtemperatur. Verwenden Sie keine Bremse, da sie beide Phasen in der Röhre (LSM und Blut) mischen könnte.
    4. Nehmen Sie die Rohre vorsichtig aus der Zentrifuge heraus und legen Sie sie in ein Rack. Prüfen Sie, ob eine auffällige Zellschicht (mononukleäre Zellen) vorkommt, die sich in der Interphase zwischen LSM (klar) und Plasma (gelb) bildet, während rote Blutkörperchen an der Unterseite der Röhre pellet.
    5. Die mononukleäre Zellschicht vorsichtig mit einer 10 ml Kunststoffpipette (ca. 5-8 ml) ansaugen und in ein neues 50 ml kegelförmiges Rohr legen. Die Lymphozyten-Interphase von bis zu 2 verschiedenen Röhren kann zusammengepoolt werden.
    6. Waschen Sie die mononukleären Zellen 2x, indem Sie in 45 ml PBS wieder aufsetzen und bei 800 x g für 5 min bei Raumtemperatur zentrieren.
      HINWEIS: Nach diesem Schritt wird ein Pellet peripherer mononukleischer Blutzellen (PBMCs) erhalten, und der Forscher kann zum NK-Isolationsschritt übergehen.
  2. NK-Isolierung von PBMCs
    1. Zählen Sie die Zellen ab 2.1.6 und setzen Sie sie im NK Separation Buffer (1x 108 PBMCs/ml) wieder aus.
    2. Nehmen Sie 10 ml der Zellresuspension (109 PBMCs ) und legen Sie sie in ein 50 ml Rohr.
    3. Fügen Sie den PBMCs 50 l/ml Puffer und 10 l (1 L/ml Puffer) Anti-CD3-positive Isolationsantikörpermischung zu den PBMCs hinzu und bei Raumtemperatur 10 min zu inkubieren.
    4. Wirbeln Sie die magnetischen Perlen und fügen Sie 1 ml in die Mischung von PBMCs mit Antikörpern (100 L Perlen/ml PBMCs). 10 min bei Raumtemperatur unter gelegentlichem Rühren inkubieren.
    5. 35 ml NK-Isolationspuffer (3,5 ml Puffer/ml PBMCs) hinzufügen, mischen und 15 min (2,2 x 107 PBMCs/ml) auf den Magneten legen. Danach werden die Perlen und Zellen positiv ausgewählt (alle außer NK-Zellen) an den Wänden der Röhre haften.
    6. Sammeln Sie den Überstand (mit NK-Zellen) sorgfältig mit einer 50 ml Kunststoffpipette, ohne die Seiten oder den Boden des Rohres zu berühren.
    7. Zählen Sie die Zellen mit einem Zellzähler und Zentrifuge bei 800 x g für 5 min.
    8. Isolieren Sie isolierte NK-Zellen bei 5 x 106 Zellen/ml in IMDM, die 10% HS enthalten, und legen Sie sie in einen Inkubator bei 37 °C mit 5%CO2, bis das Experiment durchgeführt wird.
      HINWEIS: Dieses NK-Isolationsprotokoll gibt Zellnummern und Reagenzvolumina an, die für die Verwendung eines 50 ml-Rohrs und eines großen Magneten angepasst sind. Dieses Protokoll kann skaliert werden (falls mehr PBMCs erhalten werden), indem die Isolationsschritte in verschiedenen Rohren wiederholt oder durch Reduzierung des Volumens im Rohr verkleinert werden. Für Endvolumina von 14-45 ml wird ein 50 ml Polystyrolrohr verwendet, für die Volumina 4-14 wird ein 15 ml Polystyrolrohr verwendet und für Volumen 1-4 ml wird ein 5 ml Polystyrolrohr verwendet. Der Magnet ist anders und passt jeweils auf das entsprechende Rohr. Die Menge an Antikörper-Mix und Magnetperlen kann auch entsprechend der Anzahl der Zellen und dem endgültigen Volumen skaliert werden.
  3. NK-Zellpopulationsfärbung für Durchflusszytometrie
    1. Nehmen Sie 0,25 x 106 Zellen pro Probe aus Schritt 2.2.8, entfernen Sie das Medium durch Zentrifugieren bei 800 x g für 5 min bei Raumtemperatur und setzen Sie das Zellpellet in 500 l PBS wieder auf.
    2. Fügen Sie lebensfähigkeitsfähigkeitfarbstoff nach der Empfehlung des Herstellers hinzu (1 L DMSO-rekonstituierter Farbstoff auf 1 ml Zellresuspension) und brüten bei Raumtemperatur für 30 min.
    3. 2x waschen, indem man in 5 ml PBS wieder aufsetzt und bei 800 x g für 5 min bei Raumtemperatur zentrifugiert wird.
    4. Stain mit den entsprechenden antihumanen Antikörpern in 100 l IMDM, die 10% HS für 30 min auf lichtgeschütztem Eis enthalten (siehe Tabelle 1). Alle Antikörper können kombiniert und in einem einzigen Färbeschritt verwendet werden.
    5. Analysieren Sie die Proben durch Durchflusszytometrie, um die Reinheit der erhaltenen NK-Zellpopulation zu bewerten. Verwenden Sie die zuvor beschriebene Zellgating- und Analysemethode18,19.
  4. NK-Zellenstimulation mit löslichem IL-15
    1. 0,75 x 106 Zellen aus den Schritten 2.2.8 oder 2.4.3 in 100 l IMDM mit 10% HS in einem Brunnen einer 96-Well-Platte (rund unten) wieder aufsetzen.
    2. Verdünnen Sie die menschliche IL-15 bis 1 g/ml in IMDM mit 10% HS. Fügen Sie 100 l des verdünnten menschlichen IL-15 in die Zellen ein, um eine Endkonzentration von 0,5 g/ml zu erreichen.
      HINWEIS: 0,5 g/ml ist eine Sättigungskonzentration von IL-15. Niedrigere Konzentrationen von IL-15 oder anderen Zytokinen wie IL-2, IL-12 oder IL-18 können von Forschern auf Wunsch getestet werden.
    3. Legen Sie die Zellen bei 37 °C in den Inkubator und stimulieren Sie 48 h, bevor Sie den extrazellulären Flusstest durchführen. Heben Sie unstimulierte (Kontroll-)Zellen bei gleicher Konzentration und Volumen in IMDM mit 10% HS ohne IL-15 aus und legen Sie sie 48 h im selben Inkubator ab.

3. Hydration der Sensorpatrone

HINWEIS: Die 96 Sondenspitzen der Sensorpatrone enthalten einzelne Festkörperfluorophore fürO2 und H+, die hydratisiert werden müssen, um O2- und pH-Veränderungen zu erkennen.

  1. Schalten Sie den Analysator ein und lassen Sie ihn auf 37 °C erwärmen.
  2. Öffnen Sie das Sensorkassettenpaket, und trennen Sie die Sensorpatrone von der Versorgungsplatte. Fügen Sie in jedem Brunnen der Nutzplatte 200 l der Kalibrierlösung hinzu und legen Sie die Sensorpatrone wieder auf die Platte, um zu überprüfen, ob die Sensoren vollständig in die Lösung eingetaucht sind. Für optimale Ergebnisse inkubieren Sie die Patrone über Nacht bei 37 °C in einemCO2-freienInkubator, der richtig befeuchtet wird, um Verdunstung zu verhindern. Verhindern Sie Blasenbildung unter den Sensoren während der Hydratation.
    HINWEIS: Die minimale Kartuschen-Hydratationszeit beträgt 4 h bei 37 °C in einemCO2-freienInkubator. Alternativ kann eine Nachthydratation der Sensorpatrone mit 200 l sterilem Wasser bei 37 °C in einemCO2-freienInkubator, gefolgt von einer Inkubation der Sensorpatrone mit 200 l vorgewärmter Kalibrierlösung 45 – 60 min vor Laufbeginn verwendet werden.

4. Extrazellulärer Flusstest

  1. Herstellung von klebstoffbeschichteten Platten
    HINWEIS: Da die Messung der metabolischen Parameter in einer Mikrokammer stattfindet, die am unteren Rand der 96-Well-Assay-Platte gebildet wird, müssen Suspensionszellen zuerst an der Unterseite des Brunnens haften. Ein aus der Muschel Mytilus edulis gewonnener Zellklebstoff kommt zum Einsatz. Der Hersteller des Zellktons empfiehlt eine Beschichtungskonzentration von 1 bis 5 g/cm2. Der Brunnen der Analysatorzellkultur-Mikroplatte hat eine Oberfläche von ca. 0,110cm2. So sind für eine Konzentration von 5 g/cm2 ca. 0,55 g Klebstoff erforderlich. Da bei der Beschichtung jedes Brunnens 25 l der Klebstofflösung verwendet werden, liegt die optimale Klebstofflösungskonzentration für die Analysatorzellkultur-Mikroplatten bei etwa 22,4 g/ml (22,4 g/ml x 0,025 ml = 0,56 g).
    1. 2,5 ml Zellklebstofflösung (22,4 g/ml) in 0,1 m Natriumbicarbonat, pH 8,0 vorbereiten. Bicarbonat bietet den optimalen pH-Wert für die zellhafte Leistung, die laut Hersteller zwischen 6,5 und 8,0 liegt.
    2. Pipette 25 l der Zellklebelösung an jedem Brunnen der Assayplatte und bei Raumtemperatur für 20 min inkubieren. Danach entfernen Sie die Lösung und waschen 2x mit 200 l sterilem Wasser/Brunnen. Lassen Sie die Brunnen trocknen, indem Sie die Platte für 15 Minuten in einer Zellkulturhaube offen halten.
      HINWEIS: Beschichtete Platten können bis zu 1 Woche bei 4 °C gelagert werden.
  2. Zellsaatierung in platten beschichtet mit Klebstoff
    1. Zentrifugenzellen ab Schritt 2.4.3 bei 200 x g für 5 min bei Raumtemperatur. Entfernen Sie Überstand und Waschzellen in gewärmten mitochondrialen Stresstestmedium (wenn ein mitochondrialer Stresstest durchgeführt wird) oder Glycolyse-Stresstestmedium (wenn ein Glykolyse-Stresstest durchgeführt wird). Pelletzellen wieder und wieder auf die bevorzugte Zellkonzentration im gleichen Medium (Resuspension Volumen hängt von der gewählten Zellkonzentration ab; da jeder Brunnen 180 l der Zellsuspension enthalten wird, 0,26 x 106, 0,52 x 106, 1,04 x 106, 2,08 x 106, 4,17 x 106 und 8,33 x 106 Zellen/ml Zellsuspensionen für 0,047 x 106, 0,094 x 106, 0,187 x 106, 0,375 x 106, 0,75 x 106 bzw. 1, 5 x 106 Zellen pro Brunnen).
    2. Platte 180 l Zellsuspension pro Brunnen an der Seite jedes Brunnens. Eine Mehrkanalpipette wird empfohlen. Verwenden Sie die Bohrungen A1, A12, H1 und H12 der Analyzer-Kulturplatte als Steuerbrunnen für die Hintergrundkorrektur. Fügen Sie 180 L des Assaymediums in diese Brunnen (keine Zellen) ein. Zusätzliche Steuerbrunnen können auf Wunsch und bei ausreichender Platzin der Platte verwendet werden.
      HINWEIS: Das Vorhandensein von Serum kann zu einer schlechten Zellanhaftung führen.
    3. Inkubieren Sie die Platte 30 min bei 37 °C in einemCO2-freienInkubator. Bereiten Sie in der Zwischenzeit 10x Verbindungen vor (siehe Schritt 4.3 unten).
    4. Ändern Sie die Zentrifugeneinstellungen auf Nullbremse. Zentrifugieren Sie die Platte bei 200 x g für 5 min. Beobachten Sie die Zellen unter dem Mikroskop, um zu überprüfen, ob sie eine Monoschicht an der Unterseite des Brunnens bilden. Übertragen Sie die Platten für 25 min zurück in denCO2-freienInkubator. Für beste Ergebnisse sollte die Gesamtzeit nach der Beschichtung nicht größer als etwa 1 h sein.
  3. Vorbereitung von 10-fachen Arbeitslösungen zum Einladen in die Sensorpatrone
    HINWEIS: Jede der 96 Sondenspitzen der Sensorpatrone verfügt über 4 Anschlüsse (A, B, C und D), die verwendet werden können, um Verbindungen sequenziell in einzelne Brunnen zu injizieren.
    1. Für die Durchführung eines mitochondrialen Stresstests 2,5 ml mit je 10 M Oligomycin, 1 mM DNP und einer Mischung aus 10 M Roton und 10 M Antimycin A, in mitochondrialem Stress-Assay-Medium (verwenden Sie die Stammlösungen ab Schritt 1.2.3). Die Endkonzentrationen im Brunnen nach der Injektion betragen 1 M Oligomycin, 0,1 mM DNP und 1 M M Antimycin A/Roton.
    2. Zur Durchführung eines Glykolyse-Stresstests 2,5 ml einer Mischung aus 10 M Roton und 10 M Antimycin A im Glycolyse-Stress-Assay-Medium vorbereiten (verwenden Sie die Lagerlösungen ab Schritt 1.2.3). Glukose in Glykolyse-Stresstestmedium für eine 100 mM-Lösung und 2-Deoxy-Glucose (2-DG) im Glykolyse-Stresstestmedium für eine 500 mM-Lösung auflösen. Die Endkonzentrationen im Brunnen nach der Injektion betragen 10 mM Glukose, 1 m Antimycin A/Roton und 50 mMM 2-DG.
    3. Warmlösungen auf 37 °C, pH-Wert prüfen und bei Bedarf auf 7,4 umstellen. In Schritt 4.3.1 hergestellte Lastverbindungen. (für einen mitochondrialen Belastungstest) oder 4.3.2 (für einen Glykolyse-Stresstest) in die Anschlüsse A, B und C der hydratisierten Sensorpatrone (ab Schritt 3.2) mit einem Mehrkanal-Mikropipettor und den mit der Patrone gelieferten Port-Ladeführungen, wie in Tabelle 2dargestellt.
      HINWEIS: Um eine ordnungsgemäße Injektion in alle Brunnen während des Assays zu gewährleisten, muss jede Reihe von Ports, die verwendet werden (z. B. alle Anschlüsse A), das gleiche Injektionsvolumen für die gesamte Sensorpatrone enthalten. Dies gilt für Hintergrundkorrekturbrunnen und sogar für die Brunnen, die im Experiment nicht verwendet werden.
    4. Inkubieren Sie die geladene Sensorpatrone bei 37 °C in einemCO2-freienInkubator, während Sie das Programm einrichten.
  4. Einrichten von extrazellulären Fluss-Assay-Protokollen
    1. Öffnen Sie die software für den extrazellulären Flussanalysator, und zeigen Sie mithilfe der Registerkarten Gruppendefinitionen und Plattenkarten Gruppen von Brunnen an, die ähnliche Bedingungen aufweisen (z. B. Brunnen mit der gleichen Anzahl von Zellen oder Brunnen mit ruhenden Zellen oder IL-15-stimulierten Zellen). Geben Sie auch Hintergrundkorrekturbrunnen (standardmäßig werden A1, A12, H1 und H12 gesetzt, aber zusätzliche Brunnen können verwendet werden) und leere Brunnen an.
    2. Richten Sie das in Tabelle 3 in der Software beschriebene Programm über die Registerkarte Protokoll ein.
    3. Beginnen Sie das Programm mit der Registerkarte Ausführen von Assay. Legen Sie die Sensorpatrone (hydratisiert und mit 10x Verbindungen beladen) und die Nutzplatte auf das Tablett. Nach dem Kalibrierschritt (15 – 20 min) ersetzen Sie bei Aufforderung die Kalibrierplatte für die Assayplatte (ohne Deckel) durch angeschlossene Zellen. Danach erfolgt der Lauf vollautomatisch (die Maschine führt alle Messungen und Injektionen durch).
      ANMERKUNG: Es ist möglich, einen mitochondrialen Stresstest und einen glykolytischen Stresstest in derselben Platte durchzuführen, solange die spezifischen Verbindungen in die richtigen Ports (Oligomycin, DNP und Antimycin/Roton in den Ports A, B bzw. C der Brunnen, in denen ein mitochondrialer Stresstest durchgeführt wird; Glukose, Antimycin/Roton und 2-DG in den Ports A, B und C der Brunnen, in denen ein Glykolyse-Stresstest durchgeführt wird), werden in jeder Reihe von Ports und Brunnen für jeden Test korrekt anhand der Gruppendefinitionen und Plattenkarten-Registerkarten der Software identifiziert.
    4. Rufen Sie nach Abschluss der Ausführung die Daten ab und analysieren Sie sie mit der Software.

5. Zellzahlenbestimmung

HINWEIS: Die Ergebnisse können normalisiert werden, um mögliche Unterschiede in der Zellennummer zu berücksichtigen. Es können zwei wichtige Ansätze verwendet werden, die unten beschrieben werden.

  1. DNA-Gehaltsbestimmung
    1. Entfernen Sie das verbleibende Assaymedium mit einer Pipette aus jedem Brunnen. Achten Sie beim Anspirieren des Mediums darauf, die Zellen nicht zu stören. Die Platte kann bis zur Analyse bei -20 °C gelagert werden.
      HINWEIS: Der Gefrierschritt ist wichtig für die effiziente Zelllyse und die Bestimmung des DNA-Gehalts.
    2. Bereiten Sie eine 1x Lösung des Zellproliferations-Assay-Zelllysepuffers (20x) in destilliertem Wasser (200 l/well) vor.
    3. Fügen Sie die Zellproliferations-Assay-Farbstoff-Lösung (400x) in den 1x Zelllysepuffer ein. Für den Nachweis von 50 bis 50.000 Zellen pro Bohrkörper verwenden Sie 1x Zellproliferation Assay Farbstoff. Für höhere Zellzahlen wird die Verwendung des Zellproliferations-Assayfarbstoffs in einer Endkonzentration von mehr als 1x empfohlen. Verwenden Sie in diesem Fall den Zellproliferations-Assayfarbstoff in einer 5-fachen Endkonzentration (verdünnen Sie die Zellproliferations-Assay-Stammlösung 80-fach in 1x Zelllysepuffer).
    4. Fügen Sie jedem Brunnen 200 L des Zellproliferations-Astest-Reagenzes hinzu. Inkubieren Sie die Proben für 2-5 min bei Raumtemperatur. Vor Licht schützen.
    5. Messung der Fluoreszenz der Proben bei Anregung: 480 nm; Emission: 520 nm mit einem Fluoreszenz-Mikroplattenleser nach Herstellerempfehlungen.
  2. Proteingehaltbestimmung
    1. Vorsichtig das Assaymedium aus jedem Brunnen vollständig aspirieren, ohne die Zellen zu berühren und die Zellen bei -20 °Cfür mindestens 1 h einzufrieren. Alternativ können die Zellen länger (bis zu 1 Woche) eingefroren gehalten werden, bis die Analyse durchgeführt wird.
    2. Fügen Sie jedem Brunnen 50 L Radioimmunpräzipitations-Assay (RIPA)-Lysemedium hinzu, das mit 1x Protease-Inhibitoren (aus einer 100-fachen Stammlösung) ergänzt wird. Legen Sie die Platte auf einen Shaker für 5 min bei Raumtemperatur, und dann inkubieren Sie die Platte auf Eis für 30 min für eine vollständige Zelllyse.
    3. Zentrifugieren Sie die Platte für 5 min bei 200 x g bei Raumtemperatur. Dieser Schritt wird zellulären Ablagerungen pellet, um Störungen mit der Proteinmessung zu verhindern.
    4. Messen Sie die Proteinkonzentration durch Bicinchoninsäure (BCA) assay gemäß den Empfehlungen des Herstellers.

Ergebnisse

Die Isolierung von NK-Zellen aus peripherem Blut sorgt für eine reine und lebensfähige Population

Der extrazelluläre Flusstest basiert auf der Messung der H+ undO2-Konzentration im Brunnen und unterscheidet nicht zwischen verschiedenen PopulationsvonZellen oder ihrer Lebensfähigkeit. Aus diesem Grund war die Erlangung einer sehr reinen und lebensfähigen Population der Zelle von Interesse der schlüsselfertige Schritt, um in diesen Experimenten erfolg...

Diskussion

In diesem Beitrag haben wir ein Protokoll zur effizienten Isolierung und Kultivierung reiner und lebensfähiger primärer menschlicher NK-Zellen aus peripherem Blut erstellt. Wir haben auch die Bedingungen für die Messung der Metabolischen Aktivität dieser NK-Zellen optimiert, die durch Sauerstoffverbrauch und extrazelluläre Versauerungsrate mit Hilfe eines extrazellulären Flussanalysators beurteilt werden. Im Vergleich zu anderen respirometrischen Methoden ist der extrazelluläre Flussanalysator schnell, erfordert e...

Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Danksagungen

Die Autoren danken Dr. Michael N. Sack (National Heart, Lung, and Blood Institute) für die Unterstützung und Diskussion. Diese Studie wurde von den Intramural Research Programs der National Institutes of Health, national Cancer Institute und National Heart, Lung, and Blood Institute unterstützt. JT wird durch das Ramon y Cajal-Programm (Grant RYC2018-026050-I) von MICINN (Spanien) unterstützt.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
2-Deoxy-D-glucose (2-DG)MilliporeSigmaD8375-5GGlycolyisis stress test injector compound
2,4-Dinotrophenol (2,4-DNP)MilliporeSigmaD198501ETC uncoupler / mitochondrial stress test injector compound
96 Well Cell Culture Plate/ Round bottom with LidCostar3799NK cell culture
Antimycin AMilliporeSigmaA8674Complex III inhibitor / glycolysis and mitochondrial stress test injector compound
BD FACSDIVA SoftwareBD BiosciencesFlow data acquisition
BD LSR FortessaBD BiosciencesFlow data acquisition
Cell-TakCorning354240Cell adhesive
CyQUANT cell proliferation assayThermoFisher ScientificC7026Cell proliferation Assay for DNA quantification. Contains cell-lysis buffer and CyQUANT GR dye
EasySep Human CD3 Positive Selection Kit IIStemcell technologies17851NK cell isolation from PBMCs
EasySep Human NK cell Enrichment KitStemcell technologies19055NK cell isolation from PBMCs
EasySep MagnetStemcell technologies18001NK cell isolation from PBMCs
EDTA 0.5 M, pH 8Quality Biological10128-446NK sell separation buffer
FACS tubesFalcon-Fisher Scientific352235Flow cytometry experiment
Falcon 50 ml Conical tubesFalcon-Fisher Scientific14-432-22NK cell separation
Fetal Calf Serum (FCS)Gibco10437-028NK cell separation buffer
FlowJo SoftwareBD BiosciencesFlow data analysis
GlucoseMilliporeSigmaG8270Component of mitochondrial stress test medium. Glycolysis stress test injector compound
Halt Protease Inhibitor CocktailThermoFisher Scientific78429Protease inhibitor 100X. Use in RIPA lysis buffer
Human IL-15Peprotech200-15-50ugNK cell stimulation
Human serum (HS)Valley Biomedical9C0539NK cell culture medium supplement
IMDMGibco12440053NK cell culture medium
L-Glutamine (200 mM)ThermoFisher Scientific25030-081Component of stress test media
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain KitThermoFisher ScientificL34965Viability dye for flow cytometry staining
LSMmpbio50494XPBMCs separation from human blood
Mouse anti-human CD3 BV711BD Biosciences563725T cell flow cytometry staining
Mouse anti-human CD56 PEBD Pharmingen555516NK flow cytometry staining
Mouse anti-human NKp46 PEBD Pharmingen557991NK flow cytometry staining
OligomycinMilliporeSigma75351Complex V inhibitor / mitochondrial stress test injector compound
PBS pH 7.4Gibco10010-023NK cell separation buffer
Pierce BCA Protein Assay KitThermoFisher Scientific23225For determination of protein concentration
RIPA BufferBoston BioProductsBP-115Cell lysis
RotenoneMilliporeSigmaR8875Complex II inhibitor / glycolysis and mitochondrial stress test injector compound
Seahorse Wave Controller SoftwareAgilentController for the Seahorse XFe96 Analyzer
Seahorse Wave Desktop SoftwareAgilentFor data analysis
Seahorse XF Base MediumAgilent102353-100Extracellular Flux assay base medium
Seahorse XFe96 AnalyzerAgilentExtracellular Flux Analyzer
Seahorse XFe96 FluxPakAgilent102416-100Includes 20 XF96 cell culture plates, 18 XFe96 sensor cartridges, loading guides for transferring compounds to the assay cartridge, and 1 bottle of calibrant solution (500 ml).
Sodium bicarbonateMilliporeSigmaS5761To prepare the Cell-Tak solution
Sodium pyruvate (100 mM)ThermoFisher Scientific11360-070Component of mitochondrial stress test medium

Referenzen

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