JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В этой статье мы описываем метод измерения гликолиза и митохондриального дыхания в первичных клетках естественного убийцы человека (НК), изолированных от периферической крови, в состоянии покоя или после активации, вызванной IL15. Описанный протокол может быть легко распространен на первичные клетки НК человека, активированные другими цитокинами или растворимыми стимулами.

Аннотация

Естественные клетки Killer (NK) опосредуют главным образом врожденные противоопухолесные и противовирусные иммунные реакции и реагируют на различные цитокины и другие стимулы для содействия выживанию, клеточному распространению, выработке цитокинов, таких как гамма интерферона (ИФНЗ) и/или программы цитотоксичности. Активация НК-клеток при стимуляции цитокинов требует существенной реконструкции метаболических путей для поддержки их биоэнергетических и биосинтетических потребностей. Существует большое количество доказательств того, что нарушение метаболизма нк-клеток связано с рядом хронических заболеваний, включая ожирение и рак, что подчеркивает клиническую важность наличия метода для определения метаболизма нк-клеток. Здесь мы описываем использование внеклеточного анализатора потока, платформы, которая позволяет в режиме реального времени измерения гликолиза и митохондриального потребления кислорода, в качестве инструмента для мониторинга изменений в энергетическом метаболизме клеток НК человека. Описанный здесь метод также позволяет контролировать метаболические изменения после стимуляции НК-клеток с цитокинами, такими как IL-15, система, которая в настоящее время изучается в широком диапазоне клинических испытаний.

Введение

Природные клетки Killer (NK) являются врожденными лимфоцитами, которые являются посредниками противоопухоленных и противовирусных реакций. НК-клетки составляют 5-15% всех лимфоцитов в периферической крови человека, а также могут быть найдены в селезенке, печени, костном мозге и лимфатических узлах. НК-клетки не выражают полиморфные клонотичные рецепторы, такие как Т-клеточные рецепторы (TCR) или B-клеточные рецепторы (BCR). В отличие от этого, активация их цитолитических функций вызвана вовлечением рецепторов, которые распознают неизменные лиганды на поверхностицелевой клетки 1,,2.

Отдыхающие клетки НК человека, изолированные от периферической крови, могут прожить несколько дней в культурной среде, дополненной сывороткой человека. Активация НК-клеток цитокинами, такими как IL-15 или IL-2, приводит клетки к пролиферации и увеличению их способности убивать,среди прочих эффектов 3,,4,,5. Несколько исследований показали прямую корреляцию между активацией НК-клеток и изменениями в их метаболическойактивности 6. Эти метаболические изменения предназначены для удовлетворения конкретных потребностей клеток с точки зрения энергии и биосинтеза.

Аэробные клетки и организмы получают энергию через ряд химических реакций, которые включают катаболизм и окисление углеводов, жиров и белков. Благодаря сочетанию гликолиза, трикарбоксиновой кислоты (TCA) цикла и окислительного фосфорилирования, эукариотические клетки отвечают большинству их спроса АТФ и получить промежуточные необходимые в качестве строительных блоков для макромолекул, необходимых для роста клеток и распространения. Процесс гликолиза(рисунок 1A) начинается с ввода глюкозы в клетку. В цитозоле глюкоза фосфорилируется и преобразуется в пируват (с чистым производством 2 молекул АТФ на молекулу глюкозы), которые могут быть сведены к лактату или транспортированы в митохондрии, чтобы быть преобразованы в Ацетил-КоА и войти в цикл TCA. Цикл TCA продолжает езда на велосипеде подпитывается больше молекул Ацетил-КоА и производит CO 2 (чтов конечном итоге будет распространяться за пределами клетки и, реагируя с H2O в среде, будет генерировать углеродную кислоту, которая приведет к подкислению среды) и NADH, молекула отвечает за пожертвование электронов в электронной транспортной цепи (ETC). Электроны проходят через различные белковые комплексы и, наконец, принимаются кислородом. Эти комплексы (I, III и IV) также перекачивают H- из митохондриальной матрицы в пространство с интермембрана. В результате генерируемого электрохимического+ градиента, H- снова войдет в матрицу через комплекс V (ATP-синтазы), инвестируя потенциальную энергию, накопленную в генерацию АТФ.

Как гликолиз, так и митохондриальное дыхание могут быть заблокированы в разных точках с помощью ингибиторов. Знание и использование этих ингибиторов было основой для развития внеклеточного анализа потока. Измеряя два простых параметра в режиме реального времени, таких как рН и кислород, экстраклеточный анализатор потока делает вывод о скорости гликолиза и митохондриального дыхания в 96-хорошо пластины. Стресс-тест на гликолиз проводится в базальной среде без глюкозы(рисунок 1B)7. Первые измерения уровня внеклеточного подкисления (ECAR) свидетельствуют о гликолиз-независимом подкислению. Он называется негликолитической подкисления и коррелирует с CO2 производства TCA, что, как уже объяснялось ранее, сочетается с H2O в среде длягенерации H q (TCA-связанных ECAR). Первая инъекция глюкозы, чтобы вызвать использование глюкозы и повысить гликолиз. Вторая инъекция сочетает в себе как ротенон, ингибитор комплекса I, так и антимицин А, ингибитор комплекса III вместе, чтобы блокировать ETC. Клетки реагируют на это резкое снижение производства митохондриального АТФ путем активации гликолиза для поддержания клеточного уровня АТФ, и это представляет собой количество гликолиза, который не используется клеткой в базальном состоянии, но потенциально может быть завербован в ответ на увеличение спроса на АТФ. Третьей инъекцией является аналог глюкозы 2-Deoxyglucose (DG), который конкурирует с глюкозой в качестве субстрата для фермента гексокиназы. Продукт этого фосфорилирования, 2-дезиглиглукозы-6-фосфат не может быть преобразован в пируват, и поэтому гликолиз блокируется, что снижает ECAR до минимума. ECAR измеряется на данный момент включает в себя другие источники внеклеточного подкисления, которые не связаны с гликолизом или дыхательной деятельности, а также любой остаточный гликолиз не полностью ингибируется 2-DG (пост 2-DG-подкисления).

Митохондриальный стресс-тест проводится в среде с глюкозой(рисунок 1C)8. Первые измерения скорости потребления кислорода (OCR) соответствуют базовой линии митохондриального дыхания (базального дыхания). Первая инъекция олигомицин, который препятствует возвращению протонов через синтазу АТФ (комплекс V), блокируя синтез АТФ и тем самым быстро гиперполяризирует митохондриальную мембрану, что предотвращает дальнейшую прокачку протонов через дыхательные комплексы, и приводит к снижению OCR. Сравнение базового дыхания и значения, данное добавлением олигомицина, представляет собой дыхание, связанное с АТФ. Оставшаяся олигомицин-нечувствительная скорость потребления кислорода называется протонной утечкой, которая представляет поток протонов через липидный билейзер или белки во внутренней митохондриальной мембране, такие как адениновым нуклеотиднымтранзислойдом 9. Вторая инъекция является uncoupler 2,4-динитрофенол (DNP), ионофотор, который вызывает массовое вступлениеH в митохондриальной матрицы, что приводит к деполяризации митохондриальной мембраны и нарушение митохондриального синтеза АТФ. Клетки реагируют на рассеивание протонно-мотивной силы, увеличивая скорость транспортировки электронов и потребления кислорода до максимального уровня в тщетной попытке восстановить мембранный потенциал (максимальная дыхательная способность). Разница между максимальной дыхательной способности и базального дыхания запасных дыхательной способности клетки, которая представляет собой количество дыхания, которое не используется клеткой для создания АТФ в базальной состоянии, но потенциально может быть набран в ответ на увеличение спроса АТФ или вусловиях стресса 8. Третья инъекция представляет собой сочетание ротенона и антимицина А. Эта инъекция полностью останавливает ETC и OCR уменьшается до самого низкого уровня, при этом оставшееся потребление кислорода не митохондриальное (вызванное NADPH-оксидами и т.д.).

Изменения в метаболических путей может каким-то образом предсказать функционирование НК-клеток, как было высказано предположение, что непрерывная активация НК-клеток с цитокинами в пробирке может привести к истощению НК клеток путем изучения различных метаболическихпутей 10,11. Корреляция между метаболическим статусом и функцией НК-клеток очень важна с точки зрения иммунотерапии рака. В этой области, активация НК-клеток с вливанием IL-15, в одиночку или в сочетании с моноклональными терапевтическими антителами были протестированы для того, чтобы улучшить опухолевыеклетки убийство 12,13,14. Знание метаболического статуса НК-клеток в ответ на эти стратегии лечения обеспечит ценный предиктор статуса активации нк-клеток и функции убийства.

Изучение метаболических путей в других миелоидных и лимфоидных клеток, таких как моноциты, Т и Вклетки были описаны 15 и оптимизированные методы былиопубликованы 16. В этом протоколе мы предоставляем метод, который сочетает в себе как протокол изоляции НК, который дает большое количество чистых и жизнеспособных НК-клеток, так и оптимизированный протокол для измерения метаболической активности с помощью внеклеточного анализатора потока. Здесь мы показываем, что это действительный метод для изучения метаболических изменений в отдыха и IL-15 активированных клеток человека НК. Для анализа внеклеточного потока были протестированы и оптимизированы такие параметры, как количество клеток и концентрации наркотиков. По сравнению с другими респирометрическими методами, экстраклеточный анализатор потока полностью автоматизирован и способен тестировать в режиме реального времени, с очень низким количеством клеток, до 92 образцов одновременно, и, таким образом, позволяет высокую пропускную способность скринингов (с несколькими образцами и репликациями)в относительно быстром порядке 17.

Этот метод может быть использован исследователями, заинтересованными в оценке функции НК-клеток путем изучения метаболизма НК-клеток. Он может быть применен также к клеткам, активированным другими цитокинами, антителами или растворимыми стимулами.

протокол

Все эксперименты проводились в соответствии с Хельсинкской декларацией этических принципов медицинских исследований. Образцы периферической крови у доноров были получены из Nih Департамент переливания медицины в соответствии с 99-CC-0168 IRB утвержденный протокол, с пациентом письменного информированного согласия.

1. Реагентная подготовка

  1. Реагенты для изоляции НК-клеток
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте эти реагенты в капюшоне культуры клетки.
    1. Подготовка буфера разделения НК: Дополнение PBS (рН 7.4) с 1 мМ EDTA и 2% Фетальный теленка сыворотки (FCS), который ранее был тепло-инактивированных (при 56 градусов по Цельсию в течение 30 мин).
    2. Подготовка NK культуры среды: Дополнение Iscove модифицированных Dulbecco в средствах массовой информации (IMDM) с 10% человеческой сыворотки (HS). Стерильный фильтр и хранить при 2-8 градусов по Цельсию. Разогреть средний до 37 градусов по Цельсию, прежде чем добавлять в клетки.
    3. Повторное распределение человеческого Ил-15 в PBS при 200 мкг/мл.
  2. Реагенты для анализа внеклеточного потока
    1. Подготовка анализ средств массовой информации: Для митохондриального стресс-теста среды, добавить 1 мМ пируват натрия, 2 мМ Л-глутамин и 10 мМ глюкозы в базовую среду; для гликолиза стресс-тест среды, добавить 2 мМ L-глутамин в базовую среду.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрации глюкозы, пирувата и глутамина обеспечиваются в том случае, если это рекомендовано производителем анализатора внеклеточного потока. Тем не менее, состав средств массовой информации может быть изменен исследователями, чтобы идеально соответствовать культуре среды, при желании.
    2. Отрегулируйте рН обоих средств до 7,4 с 0,1 N NaOH с помощью счетчика pH на скамейке, стерильный фильтр через размер поры 0,2 МКМ и хранить при 2-8 градусах Цельсия. Теплые средства массовой информации до 37 градусов по Цельсию, проверить рН и скорректировать до 7,4 перед использованием, если это необходимо.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Только окружающий CO2 содержится в атмосфере внеклеточного анализатора потока, использование средств массовой информации без бикарбоната имеет решающее значение.
    3. Подготовка фондовых растворов для реагентов: олигомицин (ингибитор синтазы АТФ), 10 мМ в DMSO; 2,4-динитрофенол (DNP, uncoupler), 1 M стоковое решение в DMSO; антимицин А (комплексный ингибитор III), 10 мМ стокового раствора в ДМСО; ротенон (ингибитор комплекса I), 10-метровый стоковой раствор в ДМСО. Сделайте 30 алицитов всех реагентов и храните при -20 градусов по Цельсию.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эти руководящие принципы предназначены для реагентов, приобретенных индивидуально и подготовленных исследователем. Если реагенты закупаются у производителя анализаторов, следуйте их рекомендациям по приготовлению реагентов.

2. НК-клетки изолированы от периферической крови

  1. Периферические моноядерные клетки крови (ПБМТ) препарат из крови человека
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните эти шаги в капюшоне культуры клеток. Обеззараживать все остатки и материал в контакте с кровью с отбеливателем и выбросить их в соответствующий контейнер для сжигания.
    1. Pipette 20 мл лимфоцитов Разлука Средний (LSM) в 50 мл конической трубки.
    2. Осторожно, сохраняя трубку под углом 30 градусов, пипетка 20 мл крови над LSM, очень мягко и касаясь стенки трубки. Избегайте смешивания крови с LSM и создайте видимый и четко определенный интерфаз между двумя жидкостями.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Периферическая кровь или обогащенные продукты лейкафереза могут быть использованы.
    3. Центрифуга труб в течение 25 мин, 1000 х г при комнатной температуре. Не используйте тормоз, так как он может сделать обе фазы в трубке (LSM и крови) смеси.
    4. Аккуратно вынюйте трубки из центрифуги и поместите их в стойку. Проверьте наличие заметного слоя клеток (моноядерных клеток), которые образуются на интерфазе между LSM (ясно) и плазмы (желтый), в то время как красные кровяные тельца гранулы в нижней части трубки.
    5. Аккуратно аспирировать моноядерный слой клетки с 10 мл пластиковой пипетки (около 5-8 мл) и поместить его в новую 50 мл конической трубки. Лимфоциты интерфазы до 2 различных труб могут быть объединились вместе.
    6. Вымойте моноядерные клетки 2x путем повторного перерасхода в 45 мл PBS и центрифугирования при 800 х г в течение 5 мин, при комнатной температуре.
      ПРИМЕЧАНИЕ: После этого шага, гранулы периферических моноядерных клеток крови (PBMCs) получено и исследователь может перейти к шагу изоляции НК.
  2. Изоляция Нагорного Карабаха от ПХМ
    1. Подсчитайте ячейки от 2.1.6 и повторно посчитайте их в буфере разделения НК (1x 108 PBMCs/mL).
    2. Возьмите 10 мл повторного деления клетки (109 PBMCs) и поместите их в трубку 50 мл.
    3. Добавьте 500 йл (50 йл/мл буфера) смеси антител изоляции нк-клеток и 10 йл (1 мл/мл буфера) анти-CD3 положительной изоляционные антитела смешиваются с ПКМК и инкубируют при комнатной температуре в течение 10 минут.
    4. Вихрь магнитных бусин и добавить 1 мл в смесь ПКМК с антителами (100 йл бисер / мл ПКМК). Инкубировать в течение 10 минут при комнатной температуре с иногда помешивая.
    5. Добавьте 35 мл буфера изоляции НК (3,5 мл буфера/мл ПБМТ), перемешайте и поместите на магнит на 15 мин (2,2 х 107 ПМХ/мл). После этого времени, бисер и клетки положительно выбраны (все, кроме НК-клеток) будут придерживаться стенок трубки.
    6. Тщательно соберите супернатант (содержащий НК-клетки) с пластиковой пипеткой 50 мл, не касаясь сторон или нижней части трубки.
    7. Подсчитайте клетки с помощью клеточного счетчика и центрифуги на 800 х г в течение 5 мин.
    8. Resuspend изолированных нк-клеток на 5 х 106 клеток / мл в IMDM, содержащих 10% СС и поместить их в инкубатор при 37 градусов по Цельсию с 5% CO2 до тех пор, пока эксперимент не будет выполнен.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе изоляции НК говорится о количестве клеток и объемах реагентов, адаптированных для использования трубки объемом 50 мл и большого магнита. Этот протокол может быть расширен (в случае получения большего количества ПМГ) путем повторения этапов изоляции в различных трубках или уменьшен за счет уменьшения объема в трубке. Для конечных объемов 14-45 мл используется полистироловая трубка объемом 50 мл, для объемов 4-14 используется полистироловая трубка объемом 15 мл и для объемов 1-4 мл используется полистироловая трубка объемом 5 мл. Магнит отличается и подходят соответствующие трубки в каждом конкретном случае. Количество смеси антител и магнитных бусин также может быть уменьшено в зависимости от количества клеток и конечного объема.
  3. Окрашивание популяции НК-клеток для цитометрии потока
    1. Возьмите 0,25 х 106 клеток на образец из шага 2.2.8, удалите средний центрифугированием на 800 х г в течение 5 мин при комнатной температуре и повторно посходит гранулы клетки в 500 МЛ PBS.
    2. Добавьте краситель жизнеспособности в соответствии с рекомендацией производителя (1 мл красителя DMSO-восстановленного до 1 мл повторного незаменимости клетки) и инкубировать при комнатной температуре в течение 30 мин.
    3. Вымойте 2x путем повторного перерасхода в 5 мл PBS и центрифугирования при 800 х г в течение 5 минут, при комнатной температуре.
    4. Пятно с соответствующими анти-человеческими антителами в 100 МКЛ IMDM, содержащих 10% ГС в течение 30 мин на льду, защищенном от света (см. таблицу 1). Все антитела могут быть объединены и использованы в одном шаге окрашивания.
    5. Проанализируйте образцы по цитометрии потока, чтобы оценить чистоту полученной популяции нк-клеток. Используйте метод вымывания клеток и анализа, который ранее былописан 18,,19.
  4. Стимуляция НК-клеток растворимым ИЛ-15
    1. Resuspend 0.75 x 106 ячеек из шагов 2.2.8 или 2.4.3 в 100 йл IMDM, содержащих 10% HS в колодец 96 хорошо пластины (круглое дно).
    2. Разбавить человека IL-15 до 1 мкг/мл в IMDM, содержащий 10% ВТ. Добавьте 100 МКЛ разбавленного человеческого ИЛ-15 в клетки, чтобы достичь конечной концентрации 0,5 мкг/мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: 0,5 мкг/мл является насыщая концентрацией Ил-15. При желании исследователи могут протестировать более низкие концентрации ИЛ-15 или других цитокинов, таких как ИЛ-2, ИЛ-12 или ИЛ-18.
    3. Поместите клетки в инкубатор при 37 градусов по Цельсию и стимулировать в течение 48 ч, прежде чем выполнять внеклеточный анализ потока. Повторное несыходное нестимулированные (контрольные) клетки в той же концентрации и объеме в IMDM, содержащее 10% ВГ без ИЛ-15, и поместить их в тот же инкубатор на 48 ч.

3. Гидратация сенсорного картриджа

ПРИМЕЧАНИЕ: 96 наконечников зонда картриджа датчика содержат отдельные твердотопливныефлюорофоры для O 2и H, которые должны быть увлажнены для того, чтобы обнаружить O2 и рН изменений.

  1. Включите анализатор и дайте ему прогреться до 37 градусов по Цельсию.
  2. Откройте пакет картриджа датчика и отделяете сенсорный картридж от полезной пластины. Добавьте 200 мкл раствора калибранта в каждую колодец полезной пластины и положите обратно картридж датчика на пластину, проверяя, что датчики полностью погружены в раствор. Для достижения оптимальных результатов инкубировать картридж на ночь при 37 градусовпо Цельсию вCO 2-бесплатный инкубатор, который правильно увлажняется, чтобы предотвратить испарение. Предотвращение образования пузырьков под датчиками во время гидратации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Минимальное время гидратации картриджа составляет 4 ч при 37 градусах цельсия в инкубаторе, свободном от CO2. Кроме того, можно использовать ночную гидратацию сенсорного картриджа с 200 мкл стерильной воды при37 градусов по Цельсиюв инкубаторе, свободном от CO 2, а затем инкубацию сенсорного картриджа с 200 МКЛ предварительно разогретого раствора калибранта 45 - 60 минут до начала пробега.

4. Анализ внеклеточного потока

  1. Приготовление клеевых пластин
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку измерение метаболических параметров происходит в микрокамере, сформированной в нижней части 96-хорошо анализной пластины, суспензиочные клетки должны сначала быть прилипли к нижней части хорошо. Используется клеточный клей, извлеченный из мидии Mytilus edulis. Производитель клея клетки рекомендует концентрацию покрытия от 1 до 5 мкг/см2. Колодец микроплюера культуры клеток анализатора имеет поверхность приблизительно 0.110 cm2. Таким образом, для концентрации 5мкг/см 2 требуется около 0,55 мкг клея. Поскольку для покрытия каждой хорошо будет использоваться 25 МКЛ клеевых растворов, оптимальная концентрация клеевых растворов для микропластиров культуры клеток анализатора составляет около 22,4 мкг/мл (22,4 мкг/мл х 0,025 мл и 0,56 мкг).
    1. Приготовьте 2,5 мл клеточного клея раствора (22,4 мкг/мл) в 0,1 м бикарбоната натрия, рН 8,0. Бикарбонат обеспечивает оптимальный рН для производительности адепта клеток, который, по словам производителя, составляет от 6,5 до 8,0.
    2. Пипетка 25 МКЛ клеточного клея раствора для каждой колодец анализной пластины и инкубировать при комнатной температуре в течение 20 минут. После этого, удалить раствор и мыть 2x с 200 йл стерильной воды / хорошо. Пусть колодцы высохнут, сохраняя пластину открытой в течение 15 минут внутри капота культуры клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Покрытые пластины могут храниться до 1 недели при 4 градусах Цельсия.
  2. Посев клеток в тарелках, покрытых клеем
    1. Центрифуга клеток из шага 2.4.3 при 200 x g в течение 5 мин при комнатной температуре. Удалить супернатанты и мыть клетки в разогретой митохондриальной среде стресс-теста (если проводится митохондриальный стресс-тест) или гликолиз стресс-тест среды (если проводится стресс-тест на гликолиз). Пеллетные клетки снова и повторное увеличение предпочтительной концентрации клеток в той же среде (объем повторной суспензии будет зависеть от выбранной концентрации клеток; так как каждая хорошо будет содержать 180 МКЛ клеточной подвески, подготовить 0,26 х 106, 0,52 х10 6, 1,04 х 106, 2,08 х 106, 4,17 х 106 и 8,33 х 106 ячеек / мл ячейки подвески для 8,33 х 10 6 ячеек / мл ячейки подвески для 8,33 х 10 6 ячеек / мл ячейки подвески для 8,33 х 10 6 ячеек / мл ячейки подвески для 8,33 х 10 6 ячеек / мл ячейки подвески для 8,33 х 10 6 ячеек / мл0.047 x 106, 0.094 x 106, 0.187 x 106, 0.375 x 106, 0.75 x 106 и 1. 5 x 106 ячеек на колодец соответственно).
    2. Плита 180 МКЛ клеточной суспензии на колодец вдоль стороны каждой хорошо. Рекомендуется многоканальный пипетка. Для коррекции фона используйте скважины A1, A12, H1 и H12 пластины культуры анализатора. Добавьте 180 МКЛ среды анализа в этих скважинах (без ячеек). При желании можно использовать дополнительные контрольные скважины и при достаточном пространстве в плите.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Наличие сыворотки может привести к плохой привязанности клеток.
    3. Инкубировать пластину в течение 30 мин при 37 градусов по Цельсию в CO2-бесплатныйинкубатор. Подготовка 10x соединений в то же время (см. шаг 4.3 ниже).
    4. Измените настройки центрифуги до нулевого торможения. Центрифуга пластины на 200 х г в течение 5 мин. Наблюдайте за клетками под микроскопом, чтобы проверить, что они образуют монослой в нижней части колодец. Перенесите пластины обратно в инкубатор CO2в течение 25 минут. Для получения наилучших результатов общее время после покрытия должно быть не более 1 ч.
  3. Подготовка 10-х рабочих решений для загрузки в сенсорный картридж
    ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый из 96 наконечников зонда картриджа датчик гавани 4 порта (A, B, C и D), которые могут быть использованы для инъекций соединений последовательно в отдельных скважин.
    1. Для выполнения митохондриального стресс-теста подготовьтесь к 2,5 мл каждого из 10 Олигомицинов, 1 мМ ДНП и смеси ротенона 10 МКМ и 10 МКМ антимицина А в среде анализа митохондриального стресса (используйте стоковые растворы из шага 1.2.3). Окончательные концентрации в колодец после инъекции будут 1 МКМ олигомицин, 0,1 мМ ДНП и 1 МКМ антимицин А/ротенон.
    2. Для выполнения стресс-теста на гликолиз подготовьтесь к 2,5 мл смеси из 10 ротенонов и 10 МКМ антимицина А в среде анализа стресса гликолиза (используйте фондовые растворы из шага 1.2.3). Растворите глюкозу в среде стресс-теста гликолиза для раствора 100 мМ и 2-дезикси-глюкозы (2-DG) в гликолизной среде стресс-теста для раствора 500 мМ. Окончательные концентрации в хорошо после инъекции будет 10 мМ глюкозы, 1 МКМ антимицин А / ротенон и 50 мм 2-DG.
    3. Теплые растворы до 37 градусов по Цельсию, проверить рН и скорректировать до 7,4, если это необходимо. Нагрузка соединений, подготовленных в шаге 4.3.1. (для митохондриального стресс-теста) или 4.3.2 (для стресс-теста на гликолиз) в порты A, B и C гидратированного сенсорного картриджа (от шага 3.2) с использованием многоканального микропайпютора и портовых направляющих, обеспеченных картриджем, как показано в таблице 2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для обеспечения надлежащего впрыска во всех скважинах во время анализа, каждая серия портов, которые используются (например, все порты А) должны содержать тот же объем впрыска по всему картриджу датчика. Это относится к фоновой коррекции скважин и даже к тем скважинам, которые не используются в эксперименте.
    4. Инкубировать загруженный картридж датчика при 37 градусов по Цельсию в CO2-бесплатныйинкубатор при настройке программы.
  4. Настройка протоколов анализа внеклеточного потока
    1. Откройте программное обеспечение для анализатора внеклеточного потока, и с помощью вкладок Group Definitions and Plate Map показаны группы скважин, которые имеют схожие условия (например, скважины с одинаковым количеством ячеек или колодцы с либо ячейками покоя, либо ИЛ-15-стимулируемыми ячейками). Также будут установлены фоновые коррекционые скважины (по умолчанию будут установлены A1, A12, H1 и H12, но могут быть использованы дополнительные скважины) и пустые скважины.
    2. Настройка программы, описанной в таблице 3 в программном обеспечении с помощью вкладки Протокол.
    3. Запустите программу с помощью вкладки Run Assay. Поместите сенсорный картридж (гидратированный и загруженный 10x соединениями) и утилиту пластины на лоток. После шага калибровки (15 - 20 мин), по запросу, замените калибрантную пластину на анализную пластину (без крышки) с прикрепленными клетками. После этого пробег полностью автоматизирован (машина будет выполнять все измерения и инъекции).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Можно выполнить митохондриальный стресс-тест и гликолитический стресс-тест в той же тарелке, до тех пор, как конкретные соединения загружаются в соответствующие порты (олигомицин, DNP и антимицин/ротенон в портах A, B и C соответственно скважин, где проводится митохондриальный стресс-тест; глюкоза, антимицин/ротенон Group Definitions и 2-DG в портах A, B и C соответственно скважин, где проводится стресс-тест гликолиза), одинаковые объемы для инъекций используются в каждой серии портов и скважин для каждого теста. Plate Map
    4. После завершения выполнения извлечения данных и анализа их с помощью программного обеспечения.

5. Определение номера ячейки

ПРИМЕЧАНИЕ: Результаты могут быть нормализованны с учетом возможных различий в количестве клеток. Можно использовать два основных подхода, описанных ниже.

  1. Определение содержания ДНК
    1. Удалите оставшуюся среду анализа с пипеткой из каждой хорошо. При аспирации среды, заботиться, чтобы не беспокоить клетки. Пластина может храниться при -20 градусов по Цельсию до анализа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Замораживание шаг имеет важное значение для эффективного клеточного лиза и определения содержания ДНК.
    2. Подготовь 1x раствор буфера клеточного пролиферации клеточного лиза (20x) в дистиллированной воде (200 МКЛ/колодец).
    3. Добавьте раствор клеточного пролиферации красителя (400x) в буфер 1x cell-lysis. Для обнаружения от 50 до 50.000 клеток на колодец, используйте 1x клеточного пролиферации анализа красителя. Для более высоких номеров клеток рекомендуется использовать краситель для анализа пролиферации клеток в конечной концентрации выше 1x. В этом случае используйте краситель анализа пролиферации клеток в 5-кратной конечной концентрации (разбавляют раствор пролиферации клеток в 80 раз в буфер 1x клеточного лиза).
    4. Добавьте 200 МКЛ реагента пролиферации клеток к каждой хорошо. Инкубировать образцы в течение 2-5 минут при комнатной температуре. Защитите от света.
    5. Измерьте флуоресценцию образцов при возбуждении: 480 нм; выброс: 520 нм с использованием микроплеся флуоресценции в соответствии с рекомендациями производителя.
  2. Определение содержания белка
    1. Осторожно, аспирировать полностью анализ среды из каждого хорошо, не касаясь ˚клеток и заморозить клетки при -20 градусов по Цельсию, по крайней мере 1 ч. Кроме того, клетки могут быть заморожены в течение более длительного времени (до 1 недели) до тех пор, пока анализ не будет выполнен.
    2. Добавьте 50 МКЛ радиоиммунопреципийного анализа (RIPA) среды лиза, дополненной 1x ингибиторами протеазы (от 100x раствора запаса) к каждой хорошо. Поместите тарелку на шейкер в течение 5 минут при комнатной температуре, а затем инкубировать пластину на льду в течение 30 минут для полного лиза клетки.
    3. Центрифуга пластины в течение 5 мин при температуре 200 х г при комнатной температуре. Этот шаг будет гранул клеточного мусора для предотвращения вмешательства в измерение белка.
    4. Измерьте концентрацию белка с помощью анализа бицинхониновой кислоты (BCA) в соответствии с рекомендациями производителя.

Результаты

Изоляция НК-клеток от периферической крови обеспечивает чистую и жизнеспособную популяцию

Анализ внеклеточного потока основан на измеренииконцентрации H и O2 в хорошо и не будет различать различные популяции клеток или их жизнеспособность. По этой ?...

Обсуждение

В этой статье мы установили протокол для эффективной изоляции и культивирования чистых и жизнеспособных первичных клеток НК человека из периферической крови. Мы также оптимизировали условия для измерения метаболической активности этих НК-клеток, оцениваемых по скорости потребления ...

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Авторы благодарят д-ра Майкла Н. Сака (Национальный институт сердца, легких и крови) за поддержку и обсуждение. Это исследование было поддержано интрамуральными исследовательскими программами Национальных институтов здравоохранения, Национального института рака и Национального института сердца, легких и крови. JT поддерживается программой Рамон у Cajal (грант RYC2018-026050-I) MICINN (Испания).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
2-Deoxy-D-glucose (2-DG)MilliporeSigmaD8375-5GGlycolyisis stress test injector compound
2,4-Dinotrophenol (2,4-DNP)MilliporeSigmaD198501ETC uncoupler / mitochondrial stress test injector compound
96 Well Cell Culture Plate/ Round bottom with LidCostar3799NK cell culture
Antimycin AMilliporeSigmaA8674Complex III inhibitor / glycolysis and mitochondrial stress test injector compound
BD FACSDIVA SoftwareBD BiosciencesFlow data acquisition
BD LSR FortessaBD BiosciencesFlow data acquisition
Cell-TakCorning354240Cell adhesive
CyQUANT cell proliferation assayThermoFisher ScientificC7026Cell proliferation Assay for DNA quantification. Contains cell-lysis buffer and CyQUANT GR dye
EasySep Human CD3 Positive Selection Kit IIStemcell technologies17851NK cell isolation from PBMCs
EasySep Human NK cell Enrichment KitStemcell technologies19055NK cell isolation from PBMCs
EasySep MagnetStemcell technologies18001NK cell isolation from PBMCs
EDTA 0.5 M, pH 8Quality Biological10128-446NK sell separation buffer
FACS tubesFalcon-Fisher Scientific352235Flow cytometry experiment
Falcon 50 ml Conical tubesFalcon-Fisher Scientific14-432-22NK cell separation
Fetal Calf Serum (FCS)Gibco10437-028NK cell separation buffer
FlowJo SoftwareBD BiosciencesFlow data analysis
GlucoseMilliporeSigmaG8270Component of mitochondrial stress test medium. Glycolysis stress test injector compound
Halt Protease Inhibitor CocktailThermoFisher Scientific78429Protease inhibitor 100X. Use in RIPA lysis buffer
Human IL-15Peprotech200-15-50ugNK cell stimulation
Human serum (HS)Valley Biomedical9C0539NK cell culture medium supplement
IMDMGibco12440053NK cell culture medium
L-Glutamine (200 mM)ThermoFisher Scientific25030-081Component of stress test media
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain KitThermoFisher ScientificL34965Viability dye for flow cytometry staining
LSMmpbio50494XPBMCs separation from human blood
Mouse anti-human CD3 BV711BD Biosciences563725T cell flow cytometry staining
Mouse anti-human CD56 PEBD Pharmingen555516NK flow cytometry staining
Mouse anti-human NKp46 PEBD Pharmingen557991NK flow cytometry staining
OligomycinMilliporeSigma75351Complex V inhibitor / mitochondrial stress test injector compound
PBS pH 7.4Gibco10010-023NK cell separation buffer
Pierce BCA Protein Assay KitThermoFisher Scientific23225For determination of protein concentration
RIPA BufferBoston BioProductsBP-115Cell lysis
RotenoneMilliporeSigmaR8875Complex II inhibitor / glycolysis and mitochondrial stress test injector compound
Seahorse Wave Controller SoftwareAgilentController for the Seahorse XFe96 Analyzer
Seahorse Wave Desktop SoftwareAgilentFor data analysis
Seahorse XF Base MediumAgilent102353-100Extracellular Flux assay base medium
Seahorse XFe96 AnalyzerAgilentExtracellular Flux Analyzer
Seahorse XFe96 FluxPakAgilent102416-100Includes 20 XF96 cell culture plates, 18 XFe96 sensor cartridges, loading guides for transferring compounds to the assay cartridge, and 1 bottle of calibrant solution (500 ml).
Sodium bicarbonateMilliporeSigmaS5761To prepare the Cell-Tak solution
Sodium pyruvate (100 mM)ThermoFisher Scientific11360-070Component of mitochondrial stress test medium

Ссылки

  1. Long, E. O., Kim, H. S., Liu, D., Peterson, M. E., Rajagopalan, S. Controlling natural killer cell responses: integration of signals for activation and inhibition. Annual Review of Immunology. 31, 227-258 (2013).
  2. Caligiuri, M. A. Human natural killer cells. Blood. 112 (3), 461-469 (2008).
  3. Anton, O. M., Vielkind, S., Peterson, M. E., Tagaya, Y., Long, E. O. NK Cell Proliferation Induced by IL-15 Transpresentation Is Negatively Regulated by Inhibitory Receptors. Journal of Immunology. 195 (10), 4810-4821 (2015).
  4. Henney, C. S., Kuribayashi, K., Kern, D. E., Gillis, S. Interleukin-2 augments natural killer cell activity. Nature. 291 (5813), 335-338 (1981).
  5. Anton, O. M., et al. Trans-endocytosis of intact IL-15Ralpha-IL-15 complex from presenting cells into NK cells favors signaling for proliferation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (1), 522-531 (2020).
  6. Marcais, A., et al. The metabolic checkpoint kinase mTOR is essential for IL-15 signaling during the development and activation of NK cells. Nature Immunology. 15 (8), 749-757 (2014).
  7. Mookerjee, S. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. Determining Maximum Glycolytic Capacity Using Extracellular Flux Measurements. PloS One. 11 (3), 0152016 (2016).
  8. Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).
  9. Cheng, J., et al. Mitochondrial Proton Leak Plays a Critical Role in Pathogenesis of Cardiovascular Diseases. Advances in Experimental Medicine and Biology. 982, 359-370 (2017).
  10. Terren, I., Orrantia, A., Vitalle, J., Zenarruzabeitia, O., Borrego, F. NK Cell Metabolism and Tumor Microenvironment. Frontiers in Immunology. 10, 2278 (2019).
  11. Felices, M., et al. Continuous treatment with IL-15 exhausts human NK cells via a metabolic defect. Journal of Clinical Investigation Insight. 3 (3), 96219 (2018).
  12. Miller, J. S., et al. A First-in-Human Phase I Study of Subcutaneous Outpatient Recombinant Human IL15 (rhIL15) in Adults with Advanced Solid Tumors. Clinical Cancer Research. 24 (7), 1525-1535 (2018).
  13. Conlon, K. C., et al. IL15 by Continuous Intravenous Infusion to Adult Patients with Solid Tumors in a Phase I Trial Induced Dramatic NK-Cell Subset Expansion. Clinical Cancer Research. 25 (16), 4945-4954 (2019).
  14. Dubois, S., et al. IL15 Infusion of Cancer Patients Expands the Subpopulation of Cytotoxic CD56(bright) NK Cells and Increases NK-Cell Cytokine Release Capabilities. Cancer Immunology Research. 5 (10), 929-938 (2017).
  15. Traba, J., et al. Fasting and refeeding differentially regulate NLRP3 inflammasome activation in human subjects. Journal of Clinical Investigation. 125 (12), 4592-4600 (2015).
  16. Traba, J., Miozzo, P., Akkaya, B., Pierce, S. K., Akkaya, M. An Optimized Protocol to Analyze Glycolysis and Mitochondrial Respiration in Lymphocytes. Journal of Visualized Experiments. (117), e54918 (2016).
  17. Horan, M. P., Pichaud, N., Ballard, J. W. Review: quantifying mitochondrial dysfunction in complex diseases of aging. Journals of Gerontology. Series A, Biological Sciences and Medical Sciences. 67 (10), 1022-1035 (2012).
  18. Tognarelli, S., Jacobs, B., Staiger, N., Ullrich, E. Flow Cytometry-based Assay for the Monitoring of NK Cell Functions. Journal of Visualized Experiments. (116), e54615 (2016).
  19. Theorell, J., Bryceson, Y. T. Analysis of Intracellular Ca(2+) Mobilization in Human NK Cell Subsets by Flow Cytometry. Methods in Molecular Biology. 1441, 117-130 (2016).
  20. Mookerjee, S. A., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. Quantifying intracellular rates of glycolytic and oxidative ATP production and consumption using extracellular flux measurements. Journal of Biological Chemistry. 292 (17), 7189-7207 (2017).
  21. O'Brien, K. L., Finlay, D. K. Immunometabolism and natural killer cell responses. Nature Reviews: Immunology. 19 (5), 282-290 (2019).
  22. Ahn, B. H., et al. A role for the mitochondrial deacetylase Sirt3 in regulating energy homeostasis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (38), 14447-14452 (2008).
  23. Stram, A. R., Payne, R. M. Post-translational modifications in mitochondria: protein signaling in the powerhouse. Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (21), 4063-4073 (2016).
  24. Armstrong, J. A., et al. Oxidative stress alters mitochondrial bioenergetics and modifies pancreatic cell death independently of cyclophilin D, resulting in an apoptosis-to-necrosis shift. Journal of Biological Chemistry. 293 (21), 8032-8047 (2018).
  25. Mookerjee, S. A., Goncalves, R. L. S., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. The contributions of respiration and glycolysis to extracellular acid production. Biochimica et Biophysica Acta. 1847 (2), 171-181 (2015).
  26. Mookerjee, S. A., Brand, M. D. Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate. Journal of Visualized Experiments. (106), e53464 (2015).
  27. Lichtshtein, D., Kaback, H. R., Blume, A. J. Use of a lipophilic cation for determination of membrane potential in neuroblastoma-glioma hybrid cell suspensions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (2), 650-654 (1979).
  28. Michelet, X., et al. Metabolic reprogramming of natural killer cells in obesity limits antitumor responses. Nature Immunology. 19 (12), 1330-1340 (2018).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

160

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены