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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

In questo articolo, descriviamo un metodo per misurare la glicolysi e la respirazione mitocondriale nelle cellule dell'assassino naturale umano primario (NK) isolate dal sangue periferico, a riposo o dopo l'attivazione indotta da IL15. Il protocollo descritto potrebbe essere facilmente esteso alle cellule NK umane primarie attivate da altre citochine o stimoli solubili.

Abstract

Le cellule natural killer (NK) mediano principalmente risposte immunitarie anti-tumorali e anti-virali innate e rispondono a una varietà di citochine e altri stimoli per promuovere la sopravvivenza, la proliferazione cellulare, la produzione di citochine come i programmi di interferone gamma (IFNγ) e/o citotossicità. L'attivazione delle cellule NK mediante stimolazione della citochina richiede un sostanziale ristrutturazione delle vie metaboliche per supportare i loro requisiti bioenergetici e biosintetici. C'è un grande corpo di prove che suggerisce che il metabolismo delle cellule NK alterato è associato a una serie di malattie croniche tra cui l'obesità e il cancro, che evidenzia l'importanza clinica della disponibilità di un metodo per determinare il metabolismo delle cellule NK. Qui descriviamo l'uso di un analizzatore di flusso extracellulare, una piattaforma che consente misurazioni in tempo reale del consumo di glicolisi e ossigeno mitocondriale, come strumento per monitorare i cambiamenti nel metabolismo energetico delle cellule NK umane. Il metodo qui descritto consente anche il monitoraggio dei cambiamenti metabolici dopo la stimolazione delle cellule NK con citochine come IL-15, un sistema attualmente in fase di studio in una vasta gamma di studi clinici.

Introduzione

Le cellule Natural Killer (NK) sono linfociti innati che mediano risposte anti-tumorali e anti-virali. Le cellule NK comprendono il 5-15% di tutti i linfociti nel sangue periferico umano e possono essere trovate anche nella milza, nel fegato, nel midollo osseo e nei linfonodi. Le cellule NK non esprimono recettori polimorfici clonotipici, come i recettori delle cellule T (TCR) o i recettori delle cellule B (BCR). Al contrario, l'attivazione delle loro funzioni citolitiche è stimolata dall'impegno di recettori che riconoscono liganti invariabili sulla superficie di una cella bersaglio1,2.

Le cellule NK umane a riposo isolate dal sangue periferico possono sopravvivere per diversi giorni in una coltura media integrata con siero umano. L'attivazione delle cellule NK da parte di citochine come IL-15 o IL-2 spinge le cellule alla proliferazione e ad un aumento della loro capacità diuccidere, tragli altri effetti 3,4,5. Diversi studi hanno dimostrato una correlazione diretta tra l'attivazione delle cellule NK e i cambiamenti nella loro attivitàmetabolica 6. Questi cambiamenti metabolici sono destinati a soddisfare i particolari requisiti delle cellule in termini di energia e biosintesi.

Le cellule e gli organismi aerobici ottengono energia attraverso una serie di reazioni chimiche che coinvolgono il catabolismo e l'ossidazione di carboidrati, grassi e proteine. Attraverso una combinazione di glicolisi, ciclo di acido tricarboxylico (TCA) e fosforilazione ossidativa, le cellule eucariotiche soddisfano la maggior parte della loro domanda ATP e ottengono gli intermedi necessari come elementi costitutivi per le macromolecole essenziali per la crescita e la proliferazione delle cellule. Il processo di glicolysis (Figura 1A) inizia con l'immissione di glucosio nella cella. Nel citosol, il glucosio viene fosforiato e trasformato in piruvato (con una produzione netta di 2 molecole di ATP per molecola di glucosio), che può essere ridotto a lattato o trasportato nei mitocondri per essere trasformato in Acetil-CoA ed entrare nel ciclo TCA. Il ciclo TCA continua a pedalare alimentato con più molecole di Acetil-CoA e produce CO2 (che alla fine si diffonderà al di fuori della cellula e, reagendo con H2O nel mezzo, genererà acido carbonico che porterà all'acidificazione del mezzo) e NADH, la molecola incaricata di donare elettroni alla catena di trasporto elettronico (ETC). Gli elettroni viaggiano attraverso diversi complessi proteici e sono finalmente accettati dall'ossigeno. Questi complessi (I, III e IV) pompano anche H- dalla matrice mitocondriale nello spazio intermembrana. Come conseguenza del gradiente elettrochimico generato,l'H - entreranno di nuovo nella matrice attraverso il complesso V (ATP-synthase), investendo l'energia potenziale accumulata nella generazione di ATP.

Sia la glicolysis che la respirazione mitocondriale possono essere bloccate in punti diversi utilizzando inibitori. La conoscenza e l'uso di questi inibitori è stata la base per lo sviluppo del flusso extracellulare. Misurando due semplici parametri in tempo reale come il pH e l'ossigeno, l'analizzatore di flusso extracellulare deduce il tasso di glicolysi e respirazione mitocondriale in una piastra a 96 ben. Il test di stress della glicolysi viene eseguito in un mezzo basale senza glucosio (Figura 1B)7. Le prime misurazioni del tasso di acidificazione extracellulare (ECAR) sono indicative dell'acidificazione indipendente dalla glicosisi. Si riferisce come acidificazione non glicolicotica e correla con CO2 prodotto dal TCA che, come spiegato in precedenza, si combina con H2O nel mezzo pergenerare H (ECAR collegato alla TCA). La prima iniezione è glucosio per indurre l'utilizzo del glucosio e aumentare la glicolysis. La seconda iniezione combina sia rotenone, un inibitore I complesso, e antimicina A, un inibitore Complex III insieme, per bloccare l'ETC. Le cellule rispondono a questa drammatica diminuzione della produzione di ATP mitocondriale attivando la glicolysis per mantenere i livelli di ATP cellulare, e questo rappresenta la quantità di glicolisi che non viene utilizzata dalla cellula nello stato basale, ma potrebbe essere potenzialmente reclutata in risposta agli aumenti della domanda di ATP (compensatore). La terza iniezione è il glucosio analogico 2-Deoxyglucose (DG), che compete con il glucosio come substrato per l'esochinasi enzimatica. Il prodotto di questa fosforilazione, 2-deossiglucosio-6-fosfato non può essere trasformato in piruvato, e quindi la glicolysis è bloccata, che abbassa l'ECAR al suo minimo. L'ECAR misurato a questo punto comprende altre fonti di acidificazione extracellulare che non sono attribuite alla glicoolisi o all'attività respiratoria, nonché qualsiasi glicolisi residua non completamente inibita da 2-DG (post 2-DG-acidificazione).

Il test di stress mitocondriale viene eseguito in un mezzo con glucosio (Figura 1C) 8. Le prime misurazioni del tasso di consumo di ossigeno (OCR) corrispondono alla linea di base della respirazione mitocondriale (respirazione basale). La prima iniezione è l'oligomicina, che inibisce il ritorno dei protoni attraverso la sintesi ATP (V complesso), bloccando la sintesi ATP e quindi iperpolarizzare rapidamente la membrana mitocondriale, che impedisce un ulteriore pompaggio di protoni attraverso complessi respiratori e porta ad una diminuzione dell'OCR. Il confronto tra la respirazione di base e il valore dato dall'aggiunta di oligomicina rappresenta la respirazione collegata all'ATP. Il rimanente tasso di consumo di ossigeno insensibile all'oligomicina è chiamato perdita di protoni, che rappresenta il flusso di protoni attraverso il bistrato lipidico o le proteine nella membrana mitocondriale interna come il translocase adenina nucleotide9. La seconda iniezione è il disaccoppiatore 2,4-dinitrophenol (DNP), un ionoforo che induce un ingresso massiccio di H- nella matrice mitocondriale, che porta alla depolarizzazione della membrana mitocondriale e interruzione della sintesi ATP mitocondriale. Le cellule rispondono alla dissipazione della forza protone-motivo aumentando il tasso di trasporto di elettroni e consumo di ossigeno ai livelli massimi nel tentativo inutile di recuperare il potenziale della membrana (capacità respiratoria massima). La differenza tra la capacità respiratoria massima e la respirazione basale è la capacità respiratoria di riserva della cellula, che rappresenta la quantità di respirazione che non viene utilizzata dalla cellula per generare ATP nello stato basale, ma potrebbe essere potenzialmente reclutata in risposta all'aumento della domanda di ATP o in condizioni di stress8. La terza iniezione è una combinazione di rotenone e antimicina A. Questa iniezione ferma completamente l'ETC e l'OCR diminuisce al suo livello più basso, con il consumo rimanente di ossigeno non mitocondriale (causato da NADPH-oxidasi, ecc.).

I cambiamenti nelle vie metaboliche potrebbero in qualche modo prevedere il funzionamento delle cellule NK, in quanto è stato suggerito che l'attivazione continua delle cellule NK con citochine in vitro potrebbe portare all'esaurimento delle cellule NK dallo studio di diverse vie metaboliche10,11. La correlazione tra lo stato metabolico delle cellule NK e la funzione è molto importante dal punto di vista dell'immunoterapia del cancro. In questo campo, l'attivazione di cellule NK con infusione di IL-15, da solo o in combinazione con anticorpi terapeutici monoclonali sono stati testati al fine di migliorare l'uccisione delle cellule tumorali12,13,14. La conoscenza dello stato metabolico delle cellule NK in risposta a queste strategie di trattamento fornirebbe un valido predittore dello stato di attivazione delle cellule NK e della funzione di uccisione.

Lo studio delle vie metaboliche in altre cellule mieloidi e linfoidi come monociti, cellule T e B è statodescritto 15 e sono stati pubblicati metodi ottimizzati16. In questo protocollo forniamo un metodo che combina sia un protocollo di isolamento NK che produce un numero elevato di cellule NK pure e vitali sia un protocollo ottimizzato per misurare l'attività metabolica utilizzando un analizzatore di flusso extracellulare. Qui mostriamo che questo è un metodo valido per lo studio dei cambiamenti metabolici nel riposo e IL-15 attivato cellule NK umane. Per il test del flusso extracellulare, sono stati testati e ottimizzati parametri come il numero di cellule e le concentrazioni di farmaci. Rispetto ad altri metodi respirometrici, l'analizzatore di flusso extracellulare è completamente automatizzato e in grado di testare in tempo reale, con quantità molto basse di cellule, fino a 92 campioni contemporaneamente, e quindi consente screening ad alta velocità effettiva (con più campioni e repliche) in modo relativamente rapido17.

Questo metodo può essere utilizzato da ricercatori interessati a valutare la funzione cellulare NK studiando il metabolismo delle cellule NK. Potrebbe essere applicato anche alle cellule attivate da altre citochine, anticorpi o stimoli solubili.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con i principi etici di ricerca medica di Helsinki. I campioni di sangue periferico dei donatori sono stati ottenuti dal Dipartimento di Medicina trasfusionale niH nell'ambito del protocollo approvato dall'IRB 99-CC-0168, con il consenso informato scritto del paziente.

1. Preparazione del reagente

  1. Reagenti per l'isolamento delle cellule NK
    NOTE: Preparare questi reagenti in una cappa di coltura cellulare.
    1. Preparare il buffer di separazione NK: Supplemento PBS (pH 7.4) con 1 mM EDTA e 2% Fetal Calf Serum (FCS) che in precedenza è stato inattivato termico (a 56 gradi centigradi per 30 min).
    2. Preparare il mezzo di coltura NK: Supplemento Iscove's Modified Dulbecco's Media (IMDM) con 10% Human Sirum (HS). Filtro sterile e conservare a 2-8 gradi centigradi. Riscaldare il mezzo a 37 gradi centigradi prima di aggiungerlo alle cellule.
    3. Rispendere Human IL-15 in PBS a 200 g/mL.
  2. Reagenti per analisi del flusso extracellulare
    1. Preparare i supporti di analisi: per il mezzo di stress test mitocondriale, aggiungere 1 mM di piruvato di sodio, 2 mM L-glutamina e 10 mM di glucosio al mezzo di base; per il mezzo di stress test della glicolisi, aggiungere 2 mM L-glutamina al supporto di base.
      NOTA: Le concentrazioni di glucosio, piruvato e glutammina sono fornite come raccomandato dal produttore dell'analizzatore di flusso extracellulare. Tuttavia, la composizione dei media può essere modificata dai ricercatori per abbinare perfettamente quella del mezzo di coltura, se lo si desidera.
    2. Regolare il pH di entrambi i supporti a 7,4 con 0,1 N NaOH utilizzando un misuratore di pH panca, filtro sterile attraverso una dimensione di poro di 0,2 M e conservare a 2-8 gradi centigradi. Supporti caldi a 37 gradi centigradi, controllare il pH e riadattarlo a 7,4 prima dell'uso, se necessario.
      NOTA: Solo il CO2 ambientale è contenuto nell'atmosfera dell'analizzatore di flusso extracellulare, l'uso di supporti senza bicarbonato è fondamentale.
    3. Preparare soluzioni stock per reagenti: Oligomycin (inibitore della sintesi ATP), soluzione stock da 10 mM in DMSO; 2,4-dinitrophenol (DNP, disaccoppiatore), 1 M soluzione stock in DMSO; antimicina A (inibitore III complesso), soluzione stock da 10 mM in DMSO; rotenone (inibitore I complesso), soluzione stock da 10 mM in DMSO. Fare 30 aliquots di tutti i reagenti e conservare a -20 gradi centigradi.
      NOTA: Queste linee guida sono destinate ai reagenti acquistati singolarmente e preparati dal ricercatore. Se invece i reagenti vengono acquistati dal produttore dell'analizzatore, seguire le linee guida per la preparazione del reagente.

2. Isolamento delle cellule NK dal sangue periferico

  1. Preparazione delle cellule mononucleari del sangue periferico (PBDC) dal sangue umano
    NOTA: eseguire questi passaggi in una lingua di coltura di cella. Decontaminare tutti i residui e il materiale a contatto con il sangue con candeggina e scartarli nel contenitore appropriato da incenerire.
    1. Pipetta 20 mL di linfocito Separation Medium (LSM) in un tubo conico da 50 mL.
    2. Con attenzione, mantenendo il tubo ad un angolo di 30 gradi, pipetta 20 mL di sangue sopra il LSM, molto delicatamente e toccando la parete del tubo. Evitare la miscelazione di sangue con il LSM e creare un interfse visibile e ben definito tra i due fluidi.
      NOTA: è possibile utilizzare sangue periferico o prodotti di leucferesi arricchita.
    3. Centrifugare i tubi per 25 min, 1000 x g a temperatura ambiente. Non utilizzare freno, in quanto potrebbe fare entrambe le fasi nel tubo (LSM e sangue) mix.
    4. Togliere con cura i tubi dalla centrifuga e metterli in un rack. Verificare la presenza di un cospicuo strato di cellule (cellule mononucleari) che si formeranno all'interffusione tra LSM (chiaro) e plasma (giallo), mentre i globuli rossi pellet nella parte inferiore del tubo.
    5. Aspirare delicatamente lo strato cellulare mononucleare con una pipetta di plastica da 10 mL (circa 5-8 mL) e posizionarlo in un nuovo tubo conico da 50 mL. L'interfito linfocita di un massimo di 2 tubi diversi può essere messo insieme.
    6. Lavare le cellule mononucleari 2x rievocando in PBS 45 mL e centrifugando a 800 x g per 5 min, a temperatura ambiente.
      NOTA: Dopo questo passaggio, viene ottenuto un pellet di cellule mononucleari del sangue periferico (PBDC) e il ricercatore può procedere alla fase di isolamento NK.
  2. Isolamento NK dai PBMC
    1. Contare le celle da 2.1.6 e rissegnarle in NK Separation Buffer (1x 108 PBMCs/mL).
    2. Prendere 10 mL della resuspensione cellulare (109 PBMC ) e metterli in un tubo da 50 mL.
    3. Aggiungere 500 L (50 L/mL di tampone) della miscela di anticorpi di isolamento cellulare NK e 10 L (1 L/ mL di buffer) di miscela di anticorpi anti-CD3 di isolamento positivo ai PBMC e incubare a temperatura ambiente per 10 min.
    4. Vortex le perline magnetiche e aggiungere 1 mL al mix di PBMC con anticorpi (100 perline di L/ml PBMCs). Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente con a volte mescolando.
    5. Aggiungere 35 mL di buffer di isolamento NK (3,5 ml di buffer/ml PBMC), mescolare e posizionare sul magnete per 15 min (2,2 x 107 PBMCs/mL). Dopo quel tempo, le perline e le cellule selezionate positivamente (tutte le cellule tranne NK) avranno aderito alle pareti del tubo.
    6. Raccogliere con cura il supernatant (contenente celle NK) con una pipetta di plastica da 50 mL senza toccare i lati o il fondo del tubo.
    7. Contare le cellule utilizzando un contatore di cellule e centrifugare a 800 x g per 5 min.
    8. Riespese le cellule NK isolate a 5 x 106 cellule/mL in IMDM contenenti il 10% di HS e le colloca in un'incubatrice a 37 gradi centigradi con il 5% di CO2 fino all'esecuzione dell'esperimento.
      NOTA: Questo protocollo di isolamento NK indica i numeri di cellulare e i volumi di reagenti adattati per l'uso di un tubo da 50 mL e di un grande magnete. Questo protocollo può essere scalato (nel caso in cui si ottengono più PBFC) ripetendo le fasi di isolamento in tubi diversi o ridimensionate riducendo il volume nel tubo. Per i volumi finali da 14 a 45 mL viene utilizzato un tubo di polistirolo da 50 mL, per i volumi 4-14, viene utilizzato un tubo in polistirolo da 15 mL e per i volumi 1-4 mL viene utilizzato un tubo di polistirolo da 5 mL. Il magnete è diverso e si adatta al tubo appropriato in ogni caso. La quantità di mix di anticorpi e perline magnetiche può anche essere scalata in base al numero di cellule e al volume finale.
  3. Colorazione della popolazione cellulare NK per la citometria di flusso
    1. Prendere 0,25 x 106 cellule per campione dal punto 2.2.8, rimuovere il mezzo centrifugando a 800 x g per 5 min a temperatura ambiente e rispendere il pellet cellulare in 500 L di PBS.
    2. Aggiungere il colorante di vitalità secondo la raccomandazione del produttore (1 L di colorante ricostituito da DMSO a 1 mL di resuspensione cellulare) e incubare a temperatura ambiente per 30 min.
    3. Lavare 2x rievocando in PBS da 5 mL e centrifugando a 800 x g per 5 min, a temperatura ambiente.
    4. Macchia con i corrispondenti anticorpi anti-umani in 100 L di IMDM contenente 10% HS per 30 min sul ghiaccio protetto dalla luce (c'è la tabella 1). Tutti gli anticorpi possono essere combinati e utilizzati in un unico passo di colorazione.
    5. Analizzare i campioni per citometria di flusso per valutare la purezza della popolazione di cellule NK ottenuta. Utilizzare il metodo di analisi e gating delle celle descritte inprecedenza 18,19.
  4. Stimolazione delle cellule NK con IL-15 solubile
    1. Rispendere 0,75 x 106 celle dai punti 2.2.8 o 2.4.3 in 100 L di IMDM contenenti il 10% di HS in un pozzo di 96 ben piastra (fondo rotondo).
    2. Diluire l'IL-15 umano a 1 g/mL in IMDM contenente 10% HS. Aggiungere 100 L dell'IL-15 umano diluito alle cellule per raggiungere una concentrazione finale di 0,5 g/mL.
      NOTA: 0,5 g/mL è una concentrazione saturante di IL-15. Concentrazioni inferiori di IL-15 o di altre citochine come IL-2, IL-12 o IL-18 possono essere testate dai ricercatori, se lo si desidera.
    3. Collocare le cellule nell'incubatrice a 37 gradi centigradi e stimolare per 48 h prima di eseguire il saggio del flusso extracellulare. Rispendere le cellule non stimolate (controllo) alla stessa concentrazione e volume in IMDM contenente 10% HS senza IL-15, e metterli nello stesso incubatore per 48 h.

3. Idratazione della cartuccia del sensore

NOTA: le punte della sonda 96 della cartuccia del sensore contengono fluorofori a stato solido individuali per O2 eH, che devono essere idratati per rilevare le modifiche O2 e pH.

  1. Accendere l'analizzatore e lasciarlo riscaldare fino a 37 gradi centigradi.
  2. Aprire il pacchetto cartuccia del sensore e separare la cartuccia del sensore dalla piastra di utilità. Aggiungete 200 L della soluzione di calibrant in ogni pozzo della piastra di servizio e mettete la cartuccia del sensore sulla piastra, verificando che i sensori siano completamente sommersi nella soluzione. Per ottenere risultati ottimali incubare la cartuccia durante la notte a 37 gradi centigradi in un incubatore privo di CO2che viene adeguatamente umidificato per evitare l'evaporazione. Prevenire la formazione di bolle sotto i sensori durante l'idratazione.
    NOTA: Il tempo minimo di idratazione della cartuccia è di 4 h a 37 gradi centigradi inun'incubatrice senza CO 2. In alternativa, durante la notte, è possibile utilizzare l'idratazione notturna della cartuccia del sensore con 200 L di acqua sterile a 37 gradi centigradi in un'incubatrice priva di CO2,seguita da un'incubazione della cartuccia del sensore con 200 L di soluzione di caliborante pre-riscaldata 45 – 60 min prima dell'inizio della corsa.

4. Analisi del flusso extracellulare

  1. Preparazione di piastre rivestite con adesivo
    NOTA: Poiché la misurazione dei parametri metabolici avviene in una microcamera formata nella parte inferiore della piastra di analisi 96-wellsay, le cellule di sospensione devono prima essere rispettate sul fondo del pozzo. Viene impiegato un adesivo cellulare estratto dalla cozza Mytilus edulis. Il produttore dell'adesivo cellulare raccomanda una concentrazione di rivestimento da 1 a 5 g/cm2. Il pozzo della microplama di coltura cellulare dell'analizzatore ha una superficie di circa 0,110 cm2. Pertanto, per una concentrazione di 5 g/cm2, sono necessari circa 0,55 g di adesivo. Poiché 25 L della soluzione adesivo sarà utilizzata per rivestire ogni pozzo, la concentrazione ottimale della soluzione adesivo per le microplasi dell'analizzatore è di circa 22,4 g/mL (22,4 g/mL x 0,025 mL - 0,56 g).
    1. Preparare 2,5 mL di soluzione adesivo cellulare (22,4 g/mL) in 0,1 M di bicarbonato di sodio, pH 8.0. Il bicarbonato fornisce il pH ottimale per le prestazioni di aderenza alle cellule che, secondo il produttore, è compreso tra 6,5 e 8,0.
    2. Pipette 25 L della soluzione adesivo cellulare per ogni pozzo della piastra di analisi e incubare a temperatura ambiente per 20 min. Dopo di che, rimuovere la soluzione e lavare 2x con 200 L di acqua sterile / pozzo. Lasciare asciugare i pozzi tenendo la piastra aperta per 15 minuti all'interno di un cappuccio di coltura cellulare.
      NOTA: Le piastre rivestite possono essere conservate per un massimo di 1 settimana a 4 gradi centigradi.
  2. Semina cellulare in piastre rivestite con adesivo
    1. Celle di centrifugazione dal punto 2.4.3 a 200 x g per 5 min a temperatura ambiente. Rimuovere i supernatanti e lavare le cellule nel mezzo di stress test mitocondriale riscaldato (se viene eseguito un test di stress mitocondriale) o nel mezzo di stress test della glicolisi (se viene eseguito un test di stress per glicosisi). Pellet cellule di nuovo e rispendere alla concentrazione cellulare preferita nello stesso mezzo (volume di risussione dipenderà dalla concentrazione cellulare scelta; dal momento che ogni pozzo conterrà 180 L della sospensione cellulare, preparare 0,26 x 106, 0,52 x 106, 1,04 x 106, 2,08 x 106, 4,17 x 106 e 8,33 x 106 celle/mL sospensioni per celle per 0,047 x 106, 0,094 x 106, 0,187 x 106, 0,375 x 106, 0,75 x 106 e 1. 5 x 106 celle per pozzo rispettivamente).
    2. Piastra 180 L di sospensione cellulare per pozzo lungo il lato di ogni pozzo. Si consiglia una pipetta multicanale. Utilizzare i pozzetti A1, A12, H1 e H12 della piastra di coltura dell'analizzatore come pozzi di controllo per la correzione dello sfondo. Aggiungere 180 L del mezzo di saggio in questi pozzi (senza cellule). Se lo si desidera, è possibile utilizzare ulteriori pozzetti di controllo e se c'è abbastanza spazio nella piastra.
      NOTA: La presenza di siero può causare un cattivo attaccamento della cella.
    3. Incubare la piastra per 30 minuti a 37 gradi centigradi in un incubatore privo di CO2. Preparare composti 10x nel frattempo (vedere il punto 4.3 di seguito).
    4. Modificare le impostazioni di centrifuga per frenare a zero. Centrifugare la piastra a 200 x g per 5 min. Osservare le cellule al microscopio per verificare che fornino un monostrato nella parte inferiore del pozzo. Trasferire le piastre nell'incubatrice SENZA CO2per 25 minuti. Per ottenere i migliori risultati, il tempo totale dopo la placcatura non deve essere superiore a circa 1 h.
  3. Preparazione di 10x soluzioni di lavoro da caricare nella cartuccia del sensore
    NOTA: ognuna delle 96 punte della sonda della cartuccia del sensore ospita 4 porte (A, B, C e D) che possono essere utilizzate per iniettare composti in sequenza nei singoli pozzi.
    1. Per eseguire il test di stress mitocondriale, preparare 2,5 mL ciascuno di 10 oligomicina M, 1 mM DNP e una miscela di 10 M rotenone e 10 M antimicina A, nel mezzo di analisi dello stress mitocondriale (utilizzare le soluzioni di stock del punto 1.2.3). Le concentrazioni finali nel pozzo dopo l'iniezione saranno 1 oligomicina M, 0,1 mM DNP e 1 M antimicina A/rotenone.
    2. Per eseguire la prova di stress della glicosisi, preparare 2,5 mL di una miscela di 10 M rotenone e 10 M antimicina A in mezzo di analisi dello stress della glicolisi (utilizzare le soluzioni di stock del punto 1.2.3). Sciogliere il glucosio nel mezzo di stress test della glicolisi per una soluzione da 100 mM e 2-deossi-glucosio (2-DG) nel mezzo di stress test della glicolisi per una soluzione da 500 mM. Le concentrazioni finali nel pozzo dopo l'iniezione saranno di 10 mM di glucosio, 1 M antimicina A/rotenone e 50 mM 2-DG.
    3. Soluzioni calde a 37 gradi centigradi, controllare il pH e riadattare a 7,4, se necessario. Composti di carico preparati al punto 4.3.1. (per una prova di stress mitocondriale) o 4.3.2 (per una prova di stress della glicoisi) nelle porte A, B e C della cartuccia del sensore idratato (dal punto 3.2) utilizzando un micropipettor multicanale e le guide di carico della porta fornite con la cartuccia, come mostrato nella tabella 2.
      NOTA: per garantire una corretta iniezione in tutti i pozzi durante il test, ogni serie di porte utilizzate (ad esempio, tutte le porte A) deve contenere lo stesso volume di iniezione sull'intera cartuccia del sensore. Questo vale per i pozzetti di correzione di fondo e anche per quei pozzi non utilizzati nell'esperimento.
    4. Incubare la cartuccia del sensore caricato a 37 gradi centigradi in un incubatore privo di CO2durante la configurazione del programma.
  4. Impostazione di protocolli di analisi del flusso extracellulari
    1. Aprire il software di analisi del flusso extracellulare e utilizzando le schede Definizioni di gruppo e Mappa piastra indicano gruppi di pozzi con condizioni simili (ad esempio, pozzi con lo stesso numero di celle o pozzi con celle a riposo o celle stimolate da IL-15). Inoltre, indicare i pozzetti di correzione dello sfondo (per impostazione predefinita verranno impostati A1, A12, H1 e H12, ma è possibile utilizzare pozzi aggiuntivi) e pozzi vuoti.
    2. Impostare il programma descritto nella tabella 3 del software utilizzando la scheda Protocollo.
    3. Avviare il programma utilizzando la scheda Esegui analisi. Posizionare la cartuccia del sensore (idratata e caricata con composti 10x) e la piastra di servizio sul vassoio. Dopo la fase di calibrazione (15 – 20 min), quando richiesto, sostituire la piastra di calibrant per la piastra di analisi (senza coperchio) con le cellule attaccate. Dopo questo, la corsa è completamente automatizzata (la macchina eseguirà tutte le misurazioni e le iniezioni).
      NOTA: È possibile eseguire una prova di stress mitocondriale e una prova di stress glicolitico nella stessa piastra, purché i composti specifici siano caricati nelle porte appropriate (oligomicina, DNP e antimicina/rotenone nei porti A, B e C rispettivamente dei pozzi in cui viene eseguita una prova di stress mitocondriale; glucosio, antimicina/rotenone e 2-DG nelle Plate Map porte A, B e C rispettivamente dei pozzetti in cui viene eseguita una prova di stress per la glicolisi), gli stessi volumi per le iniezioni vengono utilizzati in ogni serie di porte e pozzi per ogni test sono correttamente identificati utilizzando le schede Di gruppo e Mappa piastra.
    4. Dopo il completamento dell'esecuzione, recuperare i dati e analizzarli utilizzando il software.

5. Determinazione del numero di cella

NOTA: i risultati possono essere normalizzati per tenere conto delle possibili differenze nel numero di cella. È possibile utilizzare due approcci principali descritti di seguito.

  1. Determinazione del contenuto del DNA
    1. Rimuovere il supporto di analisi rimanente con una pipetta da ogni pozzo. Quando aspirare mezzo, fare attenzione a non disturbare le cellule. La piastra può essere conservata a -20 gradi centigradi fino all'analisi.
      NOTA: La fase di congelamento è importante per l'efficiente lysis cellulare e la determinazione del contenuto di DNA.
    2. Preparare una soluzione 1x di buffer di analisi della proliferazione cellulare (20x) nell'acqua distillata (200 L/pozzo).
    3. Aggiungere la soluzione di colorante di analisi della proliferazione cellulare (400x) nel buffer 1x cell-lysis. Per il rilevamento di 50-50.000 cellule per pozzo, utilizzare 1x colorante di analisi della proliferazione cellulare. Per i numeri cellulari più elevati, si raccomanda di utilizzare il colorante di analisi della proliferazione cellulare ad una concentrazione finale superiore a 1x. In questo caso, utilizzare il colorante di analisi della proliferazione cellulare ad una concentrazione finale di 5x (diluire la soluzione di analisi della proliferazione cellulare 80 volte in un buffer di 1x cell-lysis).
    4. Aggiungere 200 L del reagente di analisi della proliferazione cellulare ad ogni pozzo. Incubare i campioni per 2-5 min a temperatura ambiente. Proteggere dalla luce.
    5. Misurare la fluorescenza dei campioni all'eccitazione: 480 nm; emissione: 520 nm utilizzando un lettore di microplacca di fluorescenza secondo le raccomandazioni del produttore.
  2. Determinazione del contenuto proteico
    1. Con attenzione, aspirare completamente il mezzo di analisi da ogni pozzo senza ˚toccare le cellule e congelare le cellule a -20 gradi centigradi per almeno 1 h. In alternativa, le cellule possono essere tenute congelate per periodi più lunghi (fino a 1 settimana) fino a quando non viene eseguita l'analisi.
    2. Aggiungere 50 L di analisi radioimmunoprecipitation (RIPA) lysis media integrata con inibitori della proteasi 1x (da una soluzione di stock 100x) ad ogni pozzo. Mettere la piastra su uno shaker per 5 minuti a temperatura ambiente, quindi incubare la piastra sul ghiaccio per 30 min per una lisi cellulare completa.
    3. Centrifugare la piastra per 5 min a 200 x g a temperatura ambiente. Questo passaggio pellet detriti cellulari per evitare interferenze con la misurazione della proteina.
    4. Misurare la concentrazione di proteine mediante analisi dell'acido bicinchoninico (BCA) secondo le raccomandazioni del produttore.

Risultati

L'isolamento delle cellule NK dal sangue periferico fornisce una popolazione pura e vitale

L'analisi extracellulare del flusso si basa sulla misurazionedella concentrazione di H e O2 nel pozzo e non distingue tra le diverse popolazioni di cellule o la loro vitalità. Per questo motivo, ottenere una popolazione altamente pura e vitale della cellula di interesse è stato il passo chiave per avere successo in questi esperimenti.

L...

Discussione

In questo articolo, abbiamo stabilito un protocollo per isolare e cultire in modo efficiente le cellule NK umane primarie pure e vitali dal sangue periferico. Abbiamo anche ottimizzato le condizioni per la misurazione dell'attività metabolica di queste cellule NK valutate dal tasso di consumo di ossigeno e dal tasso di acidificazione extracellulare utilizzando un analizzatore di flusso extracellulare. Rispetto ad altri metodi respirometrici, l'analizzatore di flusso extracellulare è veloce, richiede un numero ridotto d...

Divulgazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Riconoscimenti

Gli autori ringraziano il Dr. Michael N. Sack (National Heart, Lung, and Blood Institute) per il sostegno e la discussione. Questo studio è stato sostenuto dai programmi di ricerca intramurali del National Institutes of Health, National Cancer Institute e National Heart, Lung, and Blood Institute. JT è supportato dal programma Ramon y Cajal (grant RYC2018-026050-I) di MICINN (Spagna).

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
2-Deoxy-D-glucose (2-DG)MilliporeSigmaD8375-5GGlycolyisis stress test injector compound
2,4-Dinotrophenol (2,4-DNP)MilliporeSigmaD198501ETC uncoupler / mitochondrial stress test injector compound
96 Well Cell Culture Plate/ Round bottom with LidCostar3799NK cell culture
Antimycin AMilliporeSigmaA8674Complex III inhibitor / glycolysis and mitochondrial stress test injector compound
BD FACSDIVA SoftwareBD BiosciencesFlow data acquisition
BD LSR FortessaBD BiosciencesFlow data acquisition
Cell-TakCorning354240Cell adhesive
CyQUANT cell proliferation assayThermoFisher ScientificC7026Cell proliferation Assay for DNA quantification. Contains cell-lysis buffer and CyQUANT GR dye
EasySep Human CD3 Positive Selection Kit IIStemcell technologies17851NK cell isolation from PBMCs
EasySep Human NK cell Enrichment KitStemcell technologies19055NK cell isolation from PBMCs
EasySep MagnetStemcell technologies18001NK cell isolation from PBMCs
EDTA 0.5 M, pH 8Quality Biological10128-446NK sell separation buffer
FACS tubesFalcon-Fisher Scientific352235Flow cytometry experiment
Falcon 50 ml Conical tubesFalcon-Fisher Scientific14-432-22NK cell separation
Fetal Calf Serum (FCS)Gibco10437-028NK cell separation buffer
FlowJo SoftwareBD BiosciencesFlow data analysis
GlucoseMilliporeSigmaG8270Component of mitochondrial stress test medium. Glycolysis stress test injector compound
Halt Protease Inhibitor CocktailThermoFisher Scientific78429Protease inhibitor 100X. Use in RIPA lysis buffer
Human IL-15Peprotech200-15-50ugNK cell stimulation
Human serum (HS)Valley Biomedical9C0539NK cell culture medium supplement
IMDMGibco12440053NK cell culture medium
L-Glutamine (200 mM)ThermoFisher Scientific25030-081Component of stress test media
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain KitThermoFisher ScientificL34965Viability dye for flow cytometry staining
LSMmpbio50494XPBMCs separation from human blood
Mouse anti-human CD3 BV711BD Biosciences563725T cell flow cytometry staining
Mouse anti-human CD56 PEBD Pharmingen555516NK flow cytometry staining
Mouse anti-human NKp46 PEBD Pharmingen557991NK flow cytometry staining
OligomycinMilliporeSigma75351Complex V inhibitor / mitochondrial stress test injector compound
PBS pH 7.4Gibco10010-023NK cell separation buffer
Pierce BCA Protein Assay KitThermoFisher Scientific23225For determination of protein concentration
RIPA BufferBoston BioProductsBP-115Cell lysis
RotenoneMilliporeSigmaR8875Complex II inhibitor / glycolysis and mitochondrial stress test injector compound
Seahorse Wave Controller SoftwareAgilentController for the Seahorse XFe96 Analyzer
Seahorse Wave Desktop SoftwareAgilentFor data analysis
Seahorse XF Base MediumAgilent102353-100Extracellular Flux assay base medium
Seahorse XFe96 AnalyzerAgilentExtracellular Flux Analyzer
Seahorse XFe96 FluxPakAgilent102416-100Includes 20 XF96 cell culture plates, 18 XFe96 sensor cartridges, loading guides for transferring compounds to the assay cartridge, and 1 bottle of calibrant solution (500 ml).
Sodium bicarbonateMilliporeSigmaS5761To prepare the Cell-Tak solution
Sodium pyruvate (100 mM)ThermoFisher Scientific11360-070Component of mitochondrial stress test medium

Riferimenti

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