Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

במאמר זה, אנו מתארים שיטה למדוד גליקוליזה ונשימה מיטוכונדריאלי בתאים קטלניים אנושיים עיקריים (NK) מבודדים מדם היקפי, במנוחה או בעקבות הפעלה המושרה IL15. הפרוטוקול המתואר יכול להיות מורחב בקלות לתאי NK אנושיים ראשוניים המופעלים על ידי ציטוקינות אחרים או גירויים מסיסים.

Abstract

תאי רוצח טבעי (NK) לתווך בעיקר תגובות אנטי-סרטיות ואנטי-ויראליות מולדות חיסוניות ומגיבים למגוון רחב של ציטוקינות וגירויים אחרים כדי לקדם הישרדות, התפשטות תאית, ייצור ציטוקינות כגון אינטרפרון גמא (IFNơ) ו / או תוכניות cytotoxicity. הפעלת תא NK על ידי גירוי ציטוקין דורש שיפוץ משמעותי של מסלולים מטבוליים כדי לתמוך בדרישות ביו-אנראזטיות וביו-סינתטיות שלהם. יש גוף גדול של ראיות המצביעות על כך חילוף חומרים לקוי של תאים NK קשורה מספר מחלות כרוניות כולל השמנת יתר וסרטן, אשר מדגיש את החשיבות הקלינית של הזמינות של שיטה כדי לקבוע את חילוף החומרים של תאים NK. כאן אנו מתארים את השימוש במנתח שטף חוץ-תאי, פלטפורמה המאפשרת מדידות בזמן אמת של גליקוליזה וצריכת חמצן מיטוכונדריאלי, ככלי לניטור שינויים בחילוף החומרים של האנרגיה של תאי NK אנושיים. השיטה המתוארת כאן מאפשרת גם ניטור של שינויים מטבוליים לאחר גירוי של תאי NK עם ציטוקינות כגון IL-15, מערכת כי הוא נחקר כעת במגוון רחב של ניסויים קליניים.

Introduction

תאי רוצח טבעי (NK) הם לימפוציטים מולדים לתווך תגובות אנטי-סרטני ואנטי ויראלי. תאי NK מהווים 5-15% מכל הלימפוציטים בדם היקפי אנושי, וניתן למצוא אותם גם בטחול, כבד, מח עצם ובלוטות לימפה. תאי NK אינם מבטאים קולטנים קלונוטיפים פולימורפיים, כגון קולטני תאי T (TCR) או קולטני תאי B (BCR). לעומת זאת, ההפעלה של פונקציות cytolytic שלהם מתבקש על ידי המעורבות של קולטנים המזהים ליגנדים שונים על פני השטח של תא היעד1,,2.

מנוחה תאי NK אנושיים מבודדים מדם היקפי יכול לשרוד במשך כמה ימים במדיום תרבות בתוספת נסיוב אנושי. הפעלה של תאי NK על ידי ציטוקינות כגון IL-15 או IL-2 מניעה את התאים להתפשטות ולעלייה ביכולת ההרג שלהם, בין היתר3,,4,,5. מספר מחקרים הראו מתאם ישיר בין הפעלת תא NK ושינויים בפעילות חילוף החומרים שלהם6. שינויים מטבוליים אלה נועדו לענות על הדרישות הספציפיות של התאים במונחים של אנרגיה וביוסינתזה.

תאים אירוביים ואורגניזמים להשיג אנרגיה באמצעות סדרה של תגובות כימיות המערבות את הקטבוליזם וחמצון של פחמימות, שומן וחלבונים. באמצעות שילוב של גליקוליזה, מחזור חומצה tricarboxylic (TCA) וphosphorylation חמצוני, תאים אאוקריוטיים לענות על רוב הביקוש ATP שלהם ולקבל ביניים הנדרשים אבני בניין עבור מקרומולקולות חיוני לצמיחת תאים והתפשטות. תהליך הגליקוליזה(איור 1A)מתחיל בכניסה של גלוקוז בתא. בציטוסול, גלוקוז הוא זרחן והפך pyruvate (עם ייצור נטו של 2 מולקולות של ATP לכל מולקולת גלוקוז), אשר ניתן להפחית ללקטאט או מועבר לתוך המיטוכונדריה כדי להפוך אצטיל-CoA ולהיכנס מחזור TCA. מחזור TCA ממשיך רכיבה על אופניים מתודלק עם מולקולות יותר של אצטיל-CoA ומייצר CO 2 (כי בסופו של דבריהיה לפזר מחוץ לתא, על ידי תגובה עם H2O במדיום, ייצור חומצה פחמתית תוביל חומציות של המדיום) ו NADH, המולקולה האחראית על תרומת אלקטרונים לשרשרת תחבורת אלקטרונים (ETC). האלקטרונים נעים דרך מתחמי חלבון שונים ולבסוף מתקבלים על ידי חמצן. מתחמים אלה (I, III ו- IV) גם לשאוב H+ מ מטריצה מיטוכונדריאלי לחלל intermembrane. כתוצאה מההדרגה האלקטרוכימית שנוצרה, ה-H+ ייכנס שוב למטריצה דרך V המורכב (ATP-סינתאז), וישקיע את האנרגיה הפוטנציאלית שנצברה בדור ה-ATP.

הן גליקוליזה והן הנשימה המיטוכונדריאלית ניתן לחסום בנקודות שונות באמצעות מעכבים. הידע והשימוש של מעכבים אלה היה הבסיס להתפתחות של תסיסה שטף חוץ תאי. על ידי מדידת שני פרמטרים פשוטים בזמן אמת כגון pH וחמצן, מנתח השטף החוץ-תאי משער את קצב גליקוליזה ונשימה מיטוכונדריאלית בצלחת 96-באר. בדיקת הלחץ גליקוליזה מבוצעת במדיום בסיס ללא גלוקוז (איור 1B)7. המדידות הראשונות של קצב החומציות החוץ-תאי (ECAR) מצביעות על חומציות עצמאית-גליקוליזה. הוא מכונה חומציות שאינה גליקולית ומתאים עם CO2 המיוצר על ידי TCA אשר, כפי שהוסבר קודם לכן, משתלב עם H2O במדיום כדי ליצור H+ (TCA מקושר ECAR). הזריקה הראשונה היא גלוקוז כדי לגרום לניצול גלוקוז ולהגביר את הגליקווליזה. הזריקה השנייה משלבת את שניהם רוטנון, מעכב מורכב אני, ואנטימיצין A, מעכב III מורכב יחד, כדי לחסום את התאים ETC. להגיב לירידה דרמטית זו בייצור ATP מיטוכונדריאלי על ידי הפעלת גליקוליזה כדי לשמור על רמות ATP הסלולר, וזה מייצג את כמות גליקוליזה כי אינו בשימוש על ידי התא במצב בסיס, אבל יכול להיות מגויס פוטנציאלי בתגובה לעליות בביקוש ATP (גליקוזיס מפצה). הזריקה השלישית היא הגלוקוז אנלוגי 2-Deoxyglucose (DG), אשר מתחרה עם גלוקוז כצע לאנזים hexokinase. המוצר של פוספורילציה זו, 2-deoxyglucose-6-פוספט לא ניתן להפוך pyruvate, ולכן גליקוליזה חסומה, אשר מוריד את ECAR למינימום שלה. ECAR נמדד בשלב זה כולל מקורות אחרים של חומציות חוץ תאית כי אינם מיוחסים גליקוליזה או פעילות נשימתית, כמו גם כל גליקוליזה שיורית לא מעוכב באופן מלא על ידי 2-DG (פוסט 2-DG-חומציות).

בדיקת הלחץ המיטוכונדריאלי מבוצעת במדיום עם גלוקוז(איור 1C)8. המדידות הראשונות של קצב צריכת החמצן (OCR) תואמות לקו הבסיס של הנשימה המיטוכונדריאלית (הנשימה הבסיסית). הזריקה הראשונה היא oligomycin, אשר מעכב את חזרתם של פרוטונים דרך סינתאז ATP (V מורכב), חסימת סינתזה ATP ובכך במהירות hyperpolarize קרום המיטוכונדריה, אשר מונע פרוטון נוסף שאיבה דרך מתחמי נשימה, ומוביל לירידה OCR. ההשוואה בין הנשימה הבסיסית לבין הערך שניתן על-ידי הוספת אוליגומיצין מייצגת את הנשימה המקושרת ל-ATP. שאר oligomycin-קצב רגיש של צריכת חמצן נקרא דליפת פרוטון, אשר מייצג את זרימת פרוטונים דרך דוטל השימנים או חלבונים קרום המיטוכונדריה הפנימית כגון טרנסלוקאז נוקלאוטיד אדנין9. הזריקה השנייה היא uncoupler 2,4-dinitrophenol (DNP), יונופור שגורם כניסה מסיבית של H+ לתוך מטריצת המיטוכונדריה, אשר מוביל depolarization של קרום המיטוכונדריה ושיבוש של סינתזה ATP מיטוכונדריאלי. תאים מגיבים לפיזה של כוח מניע פרוטון על ידי הגדלת קצב תחבורת אלקטרונים וצריכת חמצן לרמות מרביות בניסיון חסר תועלת לשחזר את פוטנציאל קרום (קיבולת נשימתית מקסימלית). ההבדל בין קיבולת הנשימה המקסימלית לנשימה הבסיסית הוא קיבולת הנשימה הרזרבית של התא, המייצג את כמות הנשימה שאינה בשימוש על ידי התא כדי ליצור ATP במצב בסיס, אבל יכול להיות מגויס בתגובה לעליות בביקוש ATP או בתנאים שלמתח 8. הזריקה השלישית היא שילוב של רוטנון ואנטימיצין A. הזרקה זו עוצרת לחלוטין את ETC ו OCR יורד לרמה הנמוכה ביותר שלה, עם צריכת החמצן הנותרת להיות לא מיטוכונדריאלי (נגרמת על ידי NADPH-oxidases, וכו ').

שינויים במסלולים מטבוליים יכול איכשהו לחזות את התפקוד של תאי NK, כפי שהוצע כי הפעלה רציפה של תאי NK עם ציטוקינות במבחנה יכול להוביל תשישות תא NK על ידי המחקר של מסלולים מטבולייםשונים 10,11. המתאם בין מצב חילוף החומרים של תא NK ותפקוד חשוב מאוד מנקודת המבט של אימונותרפיה סרטן. בתחום זה, הפעלה של תאי NK עם אינפוזיה של IL-15, לבד או בשילוב עם נוגדנים טיפוליים חד-בוניים נבדקו על מנת לשפר את הרג תאיםסרטניים 12,13,14. הידע של המצב חילוף החומרים של תאי NK בתגובה אסטרטגיות טיפול אלה יספק מנבא יקר של מצב הפעלת תא NK ופונקציית הרג.

המחקר של מסלולים מטבוליים בתאים מיאלואידים ולימפה אחרים כגון מונוציטים, T ו-B תאיםתוארו 15 ושיטות אופטימיזציהפורסמו 16. בפרוטוקול זה אנו מספקים שיטה המשלבת הן פרוטוקול בידוד NK המניב מספרים גבוהים של תאי NK טהורים ו-קיימא ופרוטוקול ממוטב כדי למדוד פעילות מטבולית באמצעות מנתח שטף חוץ-תאי. כאן אנו מראים כי זוהי שיטה חוקית לחקר שינויים מטבוליים במנוחה ו IL-15 מופעל תאי NK אנושיים. עבור אחסון שטף חוץ תאי, פרמטרים כגון מספר תא וריכוזי סמים נבדקו וממוטבים. בהשוואה לשיטות התרגם אחרות, מנתח השטף החוץ-תאי הוא אוטומטי לחלוטין ומצליח לבדוק בזמן אמת, עם כמויות נמוכות מאוד של תאים, עד 92 דגימות בו-זמנית, ובכך מאפשר הקרנות תפוקה גבוהות (עם דגימות מרובות ושכפולים) באופן מהיריחסית 17.

שיטה זו יכולה לשמש חוקרים המעוניינים להעריך את תפקוד תא NK על ידי לימוד חילוף החומרים של תאי NK. זה יכול להיות מיושם גם על תאים המופעלים על ידי ציטוקינות אחרים, נוגדנים או גירויים מסיסים.

Protocol

כל הניסויים בוצעו בהתאם להצהרת העקרונות האתיים של הלסינקי למחקר רפואי. דגימות דם היקפיות מתורמים התקבלו מהמחלקה לרפואה עירוי NIH תחת פרוטוקול 99-CC-0168 IRB אישר, עם המטופל בכתב הסכמה מדעת.

1. הכנת ריאה

  1. ריגנטים לבידוד תאי NK
    הערות: הכינו את הריגנטים האלה בשכונה של תרבות תאים.
    1. הכן מאגר הפרדת NK: PBS תוספת (pH 7.4) עם 1 mM EDTA ו 2% סרום עגל עוברי (FCS) כי כבר בעבר חום לא פעילות (ב 56 ° C במשך 30 דקות).
    2. להכין NK תרבות בינונית: תוספת של Iscove שונה Dulbecco של מדיה (IMDM) עם 10% סרום אנושי (HS). מסנן סטרילי ולאחסן ב 2-8 °C. מחממים את המדיום ל-37°C לפני הוספת התאים.
    3. תחזור את האדם IL-15 ב PBS ב 200 μg / מ"ל.
  2. רייגנטים לתוספת שטף חוץ-תאי
    1. להכין את אמצעי ההתזה: עבור מיטוכונדריאלי מבחן מתח בינוני, להוסיף 1 mM נתרן pyruvate, 2 mM L-גלוטמין ו 10 mM גלוקוז למדיום הבסיס; עבור בדיקת לחץ גליקוליזה בינוני, להוסיף 2 mM L-גלוטמין למדיום הבסיס.
      הערה: ריכוזי הגלוקוז, pyruvate ו גלוטמין מסופקים כפי שהומלץ על ידי יצרן מנתח השטף חוץ תאי. עם זאת, הרכב המדיה יכול להשתנות על ידי חוקרים כדי להתאים באופן מושלם את זה של מדיום התרבות, אם תרצה.
    2. כוונן את ה-pH של שתי המדיה ל- 7.4 עם 0.1 N NaOH באמצעות מד pH ספסל, מסנן סטרילי באמצעות גודל נקבוביות 0.2 μM ולאחסן ב 2-8 °C. מדיה חמה ל- 37°C, בדוק pH והתקן מחדש ל- 7.4 לפני השימוש במידת הצורך.
      הערה: רק CO2 סביבה כלול באווירה של מנתח שטף extracellular, השימוש במדיה ללא ביקרבונט הוא קריטי.
    3. הכן פתרונות מלאי עבור ריאגנטים: אוליגומיצין (מעכב סינתאז ATP), פתרון מניות 10 מיליון מ"מ ב- DMSO; 2,4-dinitrophenol (DNP, uncoupler), 1 M פתרון מניות ב DMSO; אנטימיצין A (מעכב III מורכב), פתרון מניות 10 mM ב DMSO; rotenone (מעכב מורכב אני), 10 mM פתרון מניות ב DMSO. הפוך 30 μL aliquots של כל reagents ולאחסן ב -20 ° C.
      הערה: קווים מנחים אלה מיועדים לריאגנטים שנרכשו בנפרד והוכנו על ידי החוקר. אם נרכשים מחדשים מיצרן המנתח במקום זאת, פעל בהתאם להנחיות שלהם להכנת רייגנט.

2. בידוד תאי NK מדם היקפי

  1. דם היקפי מונו-נו-נו-קלרי (PBMCs) הכנה מדם אנושי
    הערה: בצע שלבים אלה במכסה מנוע של תרבות תאים. תסתמו את כל השאריות ואת החומר במגע עם דם עם אקונומיקה והשליכו אותם לתוך המיכל המתאים כדי להישרף.
    1. פיפט 20 מ"ל של לימפוציט הפרדה בינונית (LSM) לתוך צינור חקוק 50 מ"ל.
    2. בזהירות, תוך שמירה על הצינור בזווית של 30 מעלות, פיפטה 20 מ"ל של דם מעל LSM, בעדינות רבה ונוגע בקיר של הצינור. הימנע מערבוב של דם עם LSM וליצור interphase גלוי ומוגדר היטב בין שני נוזלים.
      הערה: ניתן להשתמש בדם היקפי או במוצרי לוקפרס מועשרים.
    3. צנטריפוגה את הצינורות במשך 25 דקות, 1000 x g בטמפרטורת החדר. אין להשתמש בבלם, כפי שהוא יכול לעשות את שני השלבים בצינור (LSM ודם) לערבב.
    4. בזהירות להוציא את הצינורות מן הצנטריפוגה ולמקם אותם במדף. בדוק את הנוכחות של שכבה בולטת של תאים (תאים חד-צלולים) שתיווצר באינטרפאז בין LSM (ברור) ופלזמה (צהוב), בעוד כדוריות דם אדומות בתחתית הצינור.
    5. שאפף בעדינות את שכבת התא המונו-נו-נוקלירי עם פיפטה מפלסטיק של 10 מ"ל (כ-5-8 מ"ל) והניח אותה בצינור חרסי חדש של 50 מ"ל. interphase לימפוציטים של עד 2 צינורות שונים ניתן לאגף יחד.
    6. לשטוף את התאים המונו-נו-נקיים 2x על ידי תבולה מחדש ב 45 mL PBS וצנטריפוגה ב 800 x g עבור 5 דקות, בטמפרטורת החדר.
      הערה: לאחר שלב זה, מתקבלת גלולה של תאים חד-נו-נו-מקלרתיים בדם היקפי (PBMCs) והמתברר יכול להמשיך לשלב הבידוד של NK.
  2. בידוד NK ממחשבים אישיים
    1. ספור את התאים מ- 2.1.6 והתחל אותם מחדש במאגר ההפרדה NK (1x10 8 PBMCs/mL).
    2. קח 10 מ"ל של resuspension התא (109 PBMCs) ולמקם אותם לתוך צינור 50 מ"ל.
    3. להוסיף 500 μL (50 μL / מ"ל של מאגר) של תערובת נוגדנים בידוד תא NK ו 10 μL (1 μL / מ"ל של מאגר) של אנטי CD3 חיובי בידוד נוגדן לתמהיל PBMCs ותדגור בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות.
    4. מערבולת חרוזים מגנטיים ולהוסיף 1 מ"ל לתערובת של PBMCs עם נוגדנים (100 μL חרוזים / מ"ל PBMCs). דגירה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר עם ערבוב מדי פעם.
    5. הוסף מאגר בידוד של 35 מ"ל (מאגר 3.5 מ"ל/מ"ל PBMCs), ערבב והמקם במגנט למשך 15 דקות (2.2 x 107 מחשבי כף-קה-מ"ל/מ"ל). לאחר זמן זה, החרוזים והתאים שנבחרו באופן חיובי (כל מלבד תאי NK) יהיה דבק בקירות של הצינור.
    6. אספו בזהירות את הסופרנטנט (המכיל תאי NK) עם פיפטה מפלסטיק של 50 מ"ל מבלי לגעת בצדדים או בתחתית הצינור.
    7. לספור את התאים באמצעות מונה תא צנטריפוגה ב 800 x g במשך 5 דקות.
    8. תוסתה מחדש תאי NK מבודדים ב 5 x 106 תאים / מ"ל ב IMDM המכיל 10% HS ולמקם אותם באינקובטור ב 37 ° C עם 5% CO2 עד הניסוי מבוצע.
      הערה: פרוטוקול בידוד NK זה קובע מספרי תאים ונפחי reagent המותאמים לשימוש של צינור 50 מ"ל ומגנט גדול. ניתן לשנות את קנה המידה של פרוטוקול זה (במקרה של קבלת מחשבי PC נוספים) על-ידי חזרה על שלבי הבידוד בצינורות שונים או על-ידי הקטנת עוצמת הקול בצינור. עבור כרכים סופיים של 14-45 מ"ל 50 מ"ל פוליסטירן צינור משמש, עבור כרכים 4-14, צינור פוליסטירן 15 מ"ל משמש עבור כרכים 1-4 מ"ל, צינור פוליסטירן 5 מ"ל משמש. המגנט שונה ומתאים לצינור המתאים בכל מקרה. כמות תערובת הנוגדנים וחרוזים מגנטיים ניתן גם קנה מידה על פי מספר התאים ואת הכרך הסופי.
  3. NK תא האוכלוסייה מכתים עבור ציתומיה זרימה
    1. קח 0.25 x 106 תאים לדגימה מ שלב 2.2.8, להסיר את המדיום על ידי צנטריפוגה ב 800 x g עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר ולנוחה מחדש את גלולת התא ב 500 μL של PBS.
    2. להוסיף צבע כדאיות על פי המלצת היצרן (1 μL של DMSO-מחדש צבע 1 מ"ל של resuspension התא) וגירוד בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות.
    3. לשטוף 2x על ידי resspending ב 5 mL PBS וצנטריפוגה ב 800 x g עבור 5 דקות, בטמפרטורת החדר.
    4. כתם עם נוגדנים אנטי אנושיים המתאימים ב 100 μL של IMDM המכיל 10% HS במשך 30 דקות על קרח מוגן מפני אור (ראה טבלה 1). ניתן לשלב את כל הנוגדנים ולהשתמש בהם בשלב כתם אחד.
    5. נתח את הדגימות על-ידי ציתום זרימה כדי להעריך את הטוהר של אוכלוסיית תאי NK שהושגה. השתמש בשיטת הניתוח והניתוח של התא שתוארו בעבר18,19.
  4. גירוי תאי NK עם IL-15 מסיס
    1. תחזור 0.75 x 106 תאים מהצעדים 2.2.8 או 2.4.3 ב 100 μL של IMDM המכיל 10% HS בבאר של 96 צלחת היטב (תחתית עגולה).
    2. לדלל את האדם IL-15 כדי 1 μg / מ"ל ב IMDM המכיל 10% HS. להוסיף 100 μL של IL-15 אנושי מדולל לתאים כדי להגיע לריכוז הסופי של 0.5 μg / מ"ל.
      הערה: 0.5 μg/mL הוא ריכוז רווי של IL-15. ריכוזים נמוכים יותר של IL-15 או ציטוקינות אחרים כגון IL-2, IL-12 או IL-18 עשויים להיבדק על ידי חוקרים אם תרצו.
    3. מניחים את התאים באינקובטור ב-37°C ומעוררים במשך 48 שעות לפני ביצוע תסוואי השטף החוץ-תאי. תותאים לא מגורה (בקרה) באותו ריכוז ונפח ב- IMDM המכילים 10% HS ללא IL-15, והמקם אותם באותו אינקובטור למשך 48 שעות.

3. הידרציה של מחסנית חיישנים

הערה: 96 קצות הגשוש של מחסנית החיישן מכילים פלואורופורים בודדים במצב מוצק עבור O2 ו- H+ שיש לחות כדי לזהות שינויים O2 ו- pH.

  1. הפעל את המנתח ותן לו להתחמם עד 37 °C.
  2. פתח את חבילת מחסנית החיישן והפרד את מחסנית החיישנים מצלחת השירות. הוסף 200 μL של פתרון הכיול בכל באר של לוח השירות ולשים בחזרה את מחסנית חיישן על הלוח, אימות כי החיישנים שקועים לחלוטין בפתרון. לקבלת תוצאות אופטימליות דגירה את המחסנית למשך הלילה ב- 37°C באינקובטור ללא CO2,הלח כראוי למניעת אידוי. מנע היווצרות בועות תחת החיישנים במהלך הידרציה.
    הערה: זמן הלחות המינימלי של מחסנית הוא 4 שעות ב-37°C באינקובטור CO2ללא תשלום. לחלופין, הידרציה לילה של מחסנית החיישן עם 200 μL של מים סטריליים ב 37 °C בחממה CO2-חינם, ואחריו דגירה של מחסנית חיישן עם 200 μL של פתרון כיול חם מראש 45 – 60 דקות לפני תחילת הריצה, ניתן להשתמש.

4. שטף חוץ תאי

  1. הכנת צלחות מצופים דבק
    הערה: מאז המדידה של פרמטרים מטבוליים מתרחשת microchamber שנוצר בתחתית צלחת 96-גם assay, תאים תלויים יש לדבוק תחילה בתחתית הבאר. דבק תא שחולץ מהמולים Mytilus edulis מועסק. היצרן של דבק התא ממליץ על ריכוז ציפוי של 1 כדי 5 μg/ ס"מ2. הבאר של microplate תרבות תא מנתח יש משטח של כ 0.110 ס"מ2. לכן, עבור 5 μg / ס"מ2 ריכוז, סביב 0.55 μg של דבק נדרשים. כמו 25 μL של תמיסת דבק ישמש כדי לכסות כל באר, ריכוז פתרון דבק אופטימלי עבור microplates תרבות תא מנתח הוא סביב 22.4 μg/mL (22.4 μg/ mL x 0.025 מ"ל = 0.56 μg).
    1. הכן 2.5 מ"ל של תמיסת דבק תא (22.4 μg/mL) ב 0.1 M נתרן ביקרבונט, pH 8.0. ביקרבונט מספק את ה-pH האופטיממלי לביצועים דבקים בתא אשר, לדברי היצרן, הוא בין 6.5 ו 8.0.
    2. פיפטה 25 μL של תמיסת דבק התא לכל באר של צלחת assay דגירה בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות. לאחר מכן, להסיר את הפתרון ולשטוף 2x עם 200 μL של מים סטריליים / באר. תן הבארים להתייבש על ידי שמירה על הצלחת פתוחה במשך 15 דקות בתוך מכסה המנוע של תרבות התא.
      הערה: ניתן לאחסן לוחות מצופים למשך שבוע אחד ב- 4°C.
  2. זריעת תאים בצלחת מצופה דבק
    1. תאי צנטריפוגה מ שלב 2.4.3 ב 200 x g עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר. הסר supernatants ולשטוף תאים במדיום בדיקת מיטוכונדריאלית חמה (אם מתבצעת בדיקת מחץ מיטוכונדריאלי) או בדיקת מרד גליקוליזה בינוני (אם מתבצעת בדיקת מלחץ גליקוליזה). כדורית תאים שוב ולהיכנס מחדש לריכוז התא המועדף באותו מדיום (נפח resuspension יהיה תלוי בריכוז התא שנבחר; מאז כל באר תכיל 180 μL של מתלה התא, הכן 0.26 x 106, 0.52 x10 6, 1.04 x10 6, 2.08 x 106, 4.17 x10 6 ו- 8.33 x 10 6 תאים/מ"ל מתלים לתאים עבור 8.33 x10 6 תאים/מ"ל עבור 6 תאים 0.047 x10 6, 0.094 x10 6, 0.187 x10 6, 0.375 x10 6, 0.75 x10 6 ו- 1. 5 x10 6 תאים לבאר בהתאמה).
    2. צלחת 180 μL של מתלה תא לכל באר לאורך הצד של כל באר. מומלץ פיפטה רב ערוצית. השתמש בארות A1, A12, H1 ו- H12 של לוח תרבות מנתח, בארות שליטה לתיקון רקע. להוסיף 180 μL של מדיום assay בארות אלה (אין תאים). בארות בקרה נוספות ניתן להשתמש אם תרצה ואם יש מספיק מקום בלוח.
      הערה: הנוכחות של סרום עלולה לגרום לקובץ מצורף תא לקוי.
    3. דגירה את הצלחת במשך 30 דקות ב 37 ° C באינקובטורCO 2-חינם. להכין תרכובות 10x בינתיים (ראה שלב 4.3 להלן).
    4. שנה את הגדרות הצנטריפוגה לאפס בלימה. צנטריפוגה את הצלחת ב 200 x g במשך 5 דקות. שים לב לתאים מתחת למיקרוסקופ כדי לבדוק שהם יוצרים שכבת מונו בתחתית הבאר. מעבירים את הלוחות בחזרה לאקובטור ללאCO 2למשך 25 דקות. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, הזמן הכולל לאחר ציפוי לא צריך להיות גדול יותר מאשר סביב 1 שעה.
  3. הכנת פתרונות עבודה פי 10 לטעינה במחסנית חיישנים
    הערה: כל אחד מ-96 קצות הגשוש של מחסנית החיישן מכיל 4 יציאות (A, B, C ו-D) שניתן להשתמש בהן להזריק תרכובות באופן רצף לבארות בודדות.
    1. כדי לבצע בדיקת מיטוכונדריה, להכין 2.5 מ"ל כל אחד 10 μM אוליגומיצין, 1 mM DNP, ותערובת של 10 μM rotenone ו 10 μM אנטימיצין A, במדיום לחץ מיטוכונדריאלי (השתמש בפתרונות המניות של שלב 1.2.3). ריכוזים סופיים בבאר לאחר הזריקה יהיה 1 μM oligomycin, 0.1 mM DNP ו 1 μM אנטימיצין A/ rotenone.
    2. כדי לבצע בדיקת לחץ גליקוליזה, להכין 2.5 מ"ל של תערובת של רוטנון 10 μM ו 10 μM אנטימיצין A במדיום לחץ גליקוליזה (להשתמש בפתרונות המניות בשלב 1.2.3). המס גלוקוז במדיום בדיקת הלחץ גליקוליזה לתמיסת 100 מ"מ ו-2-דוקסי-גלוקוז (2-DG) במדיום בדיקת הלחץ גליקוליזה לפתרון של 500 מ"מ. ריכוזים סופיים בבאר לאחר ההזרקה יהיה 10 mM גלוקוז, 1 μM אנטימיצין A / rotenone ו 50 mM 2-DG.
    3. פתרונות חמים ל-37°C, בדוק pH והתקן מחדש ל- 7.4 במידת הצורך. טען תרכובות שהוכנו בשלב 4.3.1. (עבור בדיקת מרד מיטוכונדריאלי) או 4.3.2 (עבור בדיקת מלחץ גליקוליזה) לתוך יציאות A, B ו- C של מחסנית חיישן הידרציה (מ שלב 3.2) באמצעות מיקרופיפטטור רב ערוצי ומדריכי טעינת היציאה שסופקו עם המחסנית, כפי שמפורט בטבלה 2.
      הערה: כדי להבטיח הזרקה נכונה בכל בארות במהלך ההסכם, כל סידרה של יציאות בהן נעשה שימוש (לדוגמה, כל היציאות A) חייבת להכיל את אותו נפח הזרקה בכל מחסנית החיישן. זה חל על בארות תיקון רקע ואפילו על בארות אלה לא בשימוש בניסוי.
    4. דגירה את מחסנית החיישן הטעונה ב-37°C באינקובטור ללא CO2בעת הגדרת התוכנית.
  4. הגדרת פרוטוקולי שטף חוץ-תאי
    1. פתח את תוכנת מנתח השטף החוץ-תאי, ובשימוש בכרטיסיות הגדרות קבוצה ומפת לוחות, ציין קבוצות של בארות שיש להן תנאים דומים (לדוגמה, בארות עם אותו מספר תאים, או בארות עם תאי מנוחה או תאים מגורה IL-15). כמו כן, ציין בארות תיקון רקע (כברירת מחדל A1, A12, H1 ו- H12 יוגדרו, אך ניתן להשתמש בארות נוספות) ובבארות ריקות.
    2. הגדר את התוכנית המתוארת בטבלה 3 בתוכנה באמצעות הכרטיסיה פרוטוקול.
    3. התחל את התוכנית באמצעות הכרטיסיה הפעלה Assay. מניחים את מחסנית החיישן (לחה וטעון עם תרכובות 10x) וצלחת השירות על המגש. לאחר שלב הכיול (15 - 20 דקות), כאשר תתבקש, החלף את לוח הכיול עבור לוח ה-assay (ללא מכסה) בתאים מצורפים. לאחר מכן, הריצה היא אוטומטית לחלוטין (המכונה תבצע את כל המדידות והזריקות).
      הערה: ניתן לבצע בדיקת מלחץ מיטוכונדריאלי ובמבחן מלחץ גליקוליטי באותה צלחת, כל עוד התרכובות הספציפיות נטענות לתוך היציאות המתאימות (אוליגומיצין, DNP ואנטימיצין/רוטנון ביציאות A, B ו-C בהתאמה של הבארים שבהם מתבצעת בדיקת מלחץ מיטוכונדריאלית; גלוקוז, אנטימיצין/רוטנון ו-2-DG בנמלים A, B ו-C בהתאמה של הבארים שבהם מתבצעת בדיקת מפגמים), אותם כרכים לזריקות משמשים בכל סדרה של יציאות וברזות עבור כל בדיקה מזוהים כראוי באמצעות הגדרות הקבוצה ולשונית מפת לוחות של התוכנה.
    4. לאחר השלמת הריצה, אחזר את הנתונים ונתח אותם באמצעות התוכנה.

5. קביעת מספר תא

הערה: ניתן לנרמל את התוצאות כדי להסביר הבדלים אפשריים במספר התא. ניתן להשתמש בשתי גישות עיקריות המתוארות להלן.

  1. קביעת תוכן DNA
    1. הסר את אמצעי ה-assay הנותר עם פיפטה מכל באר. בעת שאגן בינוני, לדאוג לא להפריע לתאים. ניתן לאחסן את הלוח ב-20°C עד לניתוח.
      הערה: שלב ההקפאה חשוב לקביעת תוכן תאית יעילה ו-DNA.
    2. להכין פתרון 1x של התפשטות תאים סיסאי מאגר תא lysis (20x) במים מזוקקים (200 μL / גם).
    3. הוסף את פתרון מלאי צבע התפשטות התא (400x) לתוך מאגר 1x תא-lysis. לגילוי של 50 עד 50.000 תאים לבאר, השתמש 1x צבע התפשטות תאים. עבור מספרי תאים גבוהים יותר, באמצעות צבע התפשטות התא בריכוז הסופי גבוה יותר מ 1x מומלץ. במקרה זה, השתמש בצבע תסיסה התפשטות התא בריכוז הסופי 5x (לדלל את פתרון מלאי התפשטות התא 80-פי לתוך 1x תא-lysis מאגר).
    4. להוסיף 200 μL של ריאגנט התפשטות התאים לכל באר. מדגרים את הדגימות במשך 2-5 דקות בטמפרטורת החדר. הגן מפני אור.
    5. למדוד את הפלואורסצינציה של הדגימות בהתעוררות: 480 צפון; פליטה: 520 צפון-מ' באמצעות קורא מיקרו-פלטות פלואורסצנה בהתאם להמלצות היצרן.
  2. קביעת תוכן חלבון
    1. בזהירות, לשאוף לחלוטין את אמצעי ההסתה מכל באר מבלי לגעת בתאים ולהקפיא את התאים ב -20 °C לפחות 1 שעה. לחלופין, ניתן לשמור את התאים קפואים למשך זמנים ארוכים יותר (עד שבוע אחד) עד ביצוע הניתוח.
    2. להוסיף 50 μL של אסיי רדיוימונו-פוליספיטי (RIPA) פירוק בינוני בתוספת עם מעכבי פרוטאז 1x (מפתרון מניות 100x) לכל באר. מניחים את הצלחת על שייקר במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן דגירה את הצלחת על קרח במשך 30 דקות עבור lysis תא מלא.
    3. צנטריפוגה את הצלחת במשך 5 דקות ב 200 x g בטמפרטורת החדר. שלב זה יהיה כדורי פסולת תאית כדי למנוע הפרעה עם מדידת החלבון.
    4. למדוד את ריכוז החלבון על ידי חומצה bicinchoninic (BCA) סיסה על פי המלצות היצרן.

תוצאות

בידוד תאי NK מדם היקפי מספק אוכלוסייה טהורה וכדאית

תסוואי השטף החוץ-תאי מבוסס על מדידה של ריכוז H+ ו- O2 בבאר ולא יבחין בין אוכלוסיות שונות של תאים או הכדאיות שלהם. מסיבה זו, השגת אוכלוסייה טהורה מאוד בת קיימא של התא של עניין היה הצעד המרכזי כדי להצליח בניסו?...

Discussion

בנייר זה, הקמנו פרוטוקול לבידוד יעיל וculing טהור וית קיימא תאי NK אנושיים ראשוניים מדם היקפי. יש לנו גם אופטימיזציה התנאים למדידה של הפעילות חילוף החומרים של תאי NK אלה העריכו על ידי קצב צריכת חמצן וקצב חומציות חוץ תאית באמצעות מנתח שטף חוץ תאי. בהשוואה לשיטות התרגם אחרות, מנתח השטף החוץ-תאי מה?...

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgements

המחברים מודים לד"ר מייקל נ. סאק (המכון הלאומי ללב, ריאות ודם) על התמיכה והדיון. מחקר זה נתמך על ידי תוכניות המחקר התוך-ממורל של המכונים הלאומיים לבריאות, המכון הלאומי לסרטן והמכון הלאומי ללב, ריאות ודם. JT נתמכת על ידי תוכנית רמון y Cajal (להעניק RYC2018-026050-I) של MICINN (ספרד).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
2-Deoxy-D-glucose (2-DG)MilliporeSigmaD8375-5GGlycolyisis stress test injector compound
2,4-Dinotrophenol (2,4-DNP)MilliporeSigmaD198501ETC uncoupler / mitochondrial stress test injector compound
96 Well Cell Culture Plate/ Round bottom with LidCostar3799NK cell culture
Antimycin AMilliporeSigmaA8674Complex III inhibitor / glycolysis and mitochondrial stress test injector compound
BD FACSDIVA SoftwareBD BiosciencesFlow data acquisition
BD LSR FortessaBD BiosciencesFlow data acquisition
Cell-TakCorning354240Cell adhesive
CyQUANT cell proliferation assayThermoFisher ScientificC7026Cell proliferation Assay for DNA quantification. Contains cell-lysis buffer and CyQUANT GR dye
EasySep Human CD3 Positive Selection Kit IIStemcell technologies17851NK cell isolation from PBMCs
EasySep Human NK cell Enrichment KitStemcell technologies19055NK cell isolation from PBMCs
EasySep MagnetStemcell technologies18001NK cell isolation from PBMCs
EDTA 0.5 M, pH 8Quality Biological10128-446NK sell separation buffer
FACS tubesFalcon-Fisher Scientific352235Flow cytometry experiment
Falcon 50 ml Conical tubesFalcon-Fisher Scientific14-432-22NK cell separation
Fetal Calf Serum (FCS)Gibco10437-028NK cell separation buffer
FlowJo SoftwareBD BiosciencesFlow data analysis
GlucoseMilliporeSigmaG8270Component of mitochondrial stress test medium. Glycolysis stress test injector compound
Halt Protease Inhibitor CocktailThermoFisher Scientific78429Protease inhibitor 100X. Use in RIPA lysis buffer
Human IL-15Peprotech200-15-50ugNK cell stimulation
Human serum (HS)Valley Biomedical9C0539NK cell culture medium supplement
IMDMGibco12440053NK cell culture medium
L-Glutamine (200 mM)ThermoFisher Scientific25030-081Component of stress test media
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain KitThermoFisher ScientificL34965Viability dye for flow cytometry staining
LSMmpbio50494XPBMCs separation from human blood
Mouse anti-human CD3 BV711BD Biosciences563725T cell flow cytometry staining
Mouse anti-human CD56 PEBD Pharmingen555516NK flow cytometry staining
Mouse anti-human NKp46 PEBD Pharmingen557991NK flow cytometry staining
OligomycinMilliporeSigma75351Complex V inhibitor / mitochondrial stress test injector compound
PBS pH 7.4Gibco10010-023NK cell separation buffer
Pierce BCA Protein Assay KitThermoFisher Scientific23225For determination of protein concentration
RIPA BufferBoston BioProductsBP-115Cell lysis
RotenoneMilliporeSigmaR8875Complex II inhibitor / glycolysis and mitochondrial stress test injector compound
Seahorse Wave Controller SoftwareAgilentController for the Seahorse XFe96 Analyzer
Seahorse Wave Desktop SoftwareAgilentFor data analysis
Seahorse XF Base MediumAgilent102353-100Extracellular Flux assay base medium
Seahorse XFe96 AnalyzerAgilentExtracellular Flux Analyzer
Seahorse XFe96 FluxPakAgilent102416-100Includes 20 XF96 cell culture plates, 18 XFe96 sensor cartridges, loading guides for transferring compounds to the assay cartridge, and 1 bottle of calibrant solution (500 ml).
Sodium bicarbonateMilliporeSigmaS5761To prepare the Cell-Tak solution
Sodium pyruvate (100 mM)ThermoFisher Scientific11360-070Component of mitochondrial stress test medium

References

  1. Long, E. O., Kim, H. S., Liu, D., Peterson, M. E., Rajagopalan, S. Controlling natural killer cell responses: integration of signals for activation and inhibition. Annual Review of Immunology. 31, 227-258 (2013).
  2. Caligiuri, M. A. Human natural killer cells. Blood. 112 (3), 461-469 (2008).
  3. Anton, O. M., Vielkind, S., Peterson, M. E., Tagaya, Y., Long, E. O. NK Cell Proliferation Induced by IL-15 Transpresentation Is Negatively Regulated by Inhibitory Receptors. Journal of Immunology. 195 (10), 4810-4821 (2015).
  4. Henney, C. S., Kuribayashi, K., Kern, D. E., Gillis, S. Interleukin-2 augments natural killer cell activity. Nature. 291 (5813), 335-338 (1981).
  5. Anton, O. M., et al. Trans-endocytosis of intact IL-15Ralpha-IL-15 complex from presenting cells into NK cells favors signaling for proliferation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (1), 522-531 (2020).
  6. Marcais, A., et al. The metabolic checkpoint kinase mTOR is essential for IL-15 signaling during the development and activation of NK cells. Nature Immunology. 15 (8), 749-757 (2014).
  7. Mookerjee, S. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. Determining Maximum Glycolytic Capacity Using Extracellular Flux Measurements. PloS One. 11 (3), 0152016 (2016).
  8. Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).
  9. Cheng, J., et al. Mitochondrial Proton Leak Plays a Critical Role in Pathogenesis of Cardiovascular Diseases. Advances in Experimental Medicine and Biology. 982, 359-370 (2017).
  10. Terren, I., Orrantia, A., Vitalle, J., Zenarruzabeitia, O., Borrego, F. NK Cell Metabolism and Tumor Microenvironment. Frontiers in Immunology. 10, 2278 (2019).
  11. Felices, M., et al. Continuous treatment with IL-15 exhausts human NK cells via a metabolic defect. Journal of Clinical Investigation Insight. 3 (3), 96219 (2018).
  12. Miller, J. S., et al. A First-in-Human Phase I Study of Subcutaneous Outpatient Recombinant Human IL15 (rhIL15) in Adults with Advanced Solid Tumors. Clinical Cancer Research. 24 (7), 1525-1535 (2018).
  13. Conlon, K. C., et al. IL15 by Continuous Intravenous Infusion to Adult Patients with Solid Tumors in a Phase I Trial Induced Dramatic NK-Cell Subset Expansion. Clinical Cancer Research. 25 (16), 4945-4954 (2019).
  14. Dubois, S., et al. IL15 Infusion of Cancer Patients Expands the Subpopulation of Cytotoxic CD56(bright) NK Cells and Increases NK-Cell Cytokine Release Capabilities. Cancer Immunology Research. 5 (10), 929-938 (2017).
  15. Traba, J., et al. Fasting and refeeding differentially regulate NLRP3 inflammasome activation in human subjects. Journal of Clinical Investigation. 125 (12), 4592-4600 (2015).
  16. Traba, J., Miozzo, P., Akkaya, B., Pierce, S. K., Akkaya, M. An Optimized Protocol to Analyze Glycolysis and Mitochondrial Respiration in Lymphocytes. Journal of Visualized Experiments. (117), e54918 (2016).
  17. Horan, M. P., Pichaud, N., Ballard, J. W. Review: quantifying mitochondrial dysfunction in complex diseases of aging. Journals of Gerontology. Series A, Biological Sciences and Medical Sciences. 67 (10), 1022-1035 (2012).
  18. Tognarelli, S., Jacobs, B., Staiger, N., Ullrich, E. Flow Cytometry-based Assay for the Monitoring of NK Cell Functions. Journal of Visualized Experiments. (116), e54615 (2016).
  19. Theorell, J., Bryceson, Y. T. Analysis of Intracellular Ca(2+) Mobilization in Human NK Cell Subsets by Flow Cytometry. Methods in Molecular Biology. 1441, 117-130 (2016).
  20. Mookerjee, S. A., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. Quantifying intracellular rates of glycolytic and oxidative ATP production and consumption using extracellular flux measurements. Journal of Biological Chemistry. 292 (17), 7189-7207 (2017).
  21. O'Brien, K. L., Finlay, D. K. Immunometabolism and natural killer cell responses. Nature Reviews: Immunology. 19 (5), 282-290 (2019).
  22. Ahn, B. H., et al. A role for the mitochondrial deacetylase Sirt3 in regulating energy homeostasis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (38), 14447-14452 (2008).
  23. Stram, A. R., Payne, R. M. Post-translational modifications in mitochondria: protein signaling in the powerhouse. Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (21), 4063-4073 (2016).
  24. Armstrong, J. A., et al. Oxidative stress alters mitochondrial bioenergetics and modifies pancreatic cell death independently of cyclophilin D, resulting in an apoptosis-to-necrosis shift. Journal of Biological Chemistry. 293 (21), 8032-8047 (2018).
  25. Mookerjee, S. A., Goncalves, R. L. S., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. The contributions of respiration and glycolysis to extracellular acid production. Biochimica et Biophysica Acta. 1847 (2), 171-181 (2015).
  26. Mookerjee, S. A., Brand, M. D. Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate. Journal of Visualized Experiments. (106), e53464 (2015).
  27. Lichtshtein, D., Kaback, H. R., Blume, A. J. Use of a lipophilic cation for determination of membrane potential in neuroblastoma-glioma hybrid cell suspensions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (2), 650-654 (1979).
  28. Michelet, X., et al. Metabolic reprogramming of natural killer cells in obesity limits antitumor responses. Nature Immunology. 19 (12), 1330-1340 (2018).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

160

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved