Desentrañando el papel de las áreas discretas del cerebro de la rata en la regulación de la ovulación a través de la inactivación reversible por microinyecciones de tetrodotoxina

Resumen

Este protocolo describe la construcción de un sistema de microinyección de bajo costo, su implantación estereotáxica en estructuras cerebrales profundas y el procedimiento para microinyecciones cronometradas de tetrodotoxina en ratas despiertas y sin restricciones. El objetivo es revelar la participación de las estructuras hipotalámicas en la regulación de la ovulación mediante la inhibición de su actividad neuronal.

Resumen

Se han utilizado muchos enfoques experimentales para estudiar el papel del cerebro en la regulación de la ovulación. Los ejemplos incluyen la lesión y la desaferenciación de grupos neuronales, que son métodos invasivos que perjudican permanentemente la integridad del área objetivo. Estos métodos van acompañados de efectos colaterales que pueden afectar al análisis de los mecanismos reguladores agudos y temporales. La implantación estereotáxica de cánulas guía dirigidas a regiones cerebrales específicas, seguidas de un período de recuperación, permite a los investigadores microinyectar diferentes fármacos tras la desaparición de los efectos no deseados de la cirugía. La tetrodotoxina se ha utilizado para determinar el papel de varias áreas del cerebro en diversos procesos fisiológicos porque inhibe transitoriamente los potenciales de acción dependientes del sodio, bloqueando así toda la actividad neuronal en la región objetivo. Este protocolo combina este método con estrategias para la evaluación del ciclo estral y la ovulación para revelar el papel de las regiones cerebrales discretas en la regulación de la ovulación en momentos particulares de cualquier etapa dada del ciclo estral. Se utilizaron ratas despiertas y desenfrenadas(Rattus norvegicus)para evitar los efectos de bloqueo que los anestésicos y las hormonas del estrés ejercen sobre la ovulación. Este protocolo se puede adaptar fácilmente a otras especies, dianas cerebrales y agentes farmacológicos para estudiar diferentes procesos fisiológicos. Las mejoras futuras a este método incluyen el diseño de un sistema de microinyección utilizando capilares de vidrio de pequeño diámetro en lugar de cánulas guía. Esto reducirá la cantidad de tejido dañado durante la implantación y disminuirá la propagación de los medicamentos infundidos fuera del área objetivo.

Introducción

La ovulación es el proceso por el cual uno o más ovocitos maduros se liberan de los ovarios una vez cada ciclo estral/menstrual. Como todas las especies de mamíferos dependen de la producción de gametos para reproducirse, la comprensión de los mecanismos que regulan la ovulación tiene un gran impacto en áreas que van desde la biomedicina, la industria ganadera y el mantenimiento de especies en peligro de extinción. La ovulación está regulada por el eje hipotalámico-hipofisario-ovárico, que involucra varias áreas hipotalámicas y extra-hipotalámicas, los gonadotropos en la hipófisis anterior y las células de la teca y la granulosa que, junto con los ovocitos, forman los folículos ováricos dentro de los ovarios¹.

Los folículos ováricos crecen, se desarrollan y eventualmente ovulan en respuesta a la secreción tónica y fásica de la hormona estimulante del folículo y la hormona luteinizante, las dos gonadotropinas secretadas por los gonadotropos. El patrón de secreción de gonadotropina es fundamental para el desarrollo folicular adecuado y la ovulación y está regulado por la hormona liberadora de gonadotropina (GnRH)^1,2. Este neuropéptido es sintetizado por neuronas dispersas por todo el diencéfalo basal y luego secretadas a la vasculatura portal que une el hipotálamo y la hipófisis anterior. La actividad secretora de las neuronas GnRH es a su vez modulada por la entrada sináptica que surge de diversas estructuras cerebrales. Estas estructuras transmiten información sobre el estado del entorno externo e interno del organismo, incluida la disponibilidad de alimentos, la duración del fotoperíodo y la concentración de hormonas en la sangre. En este sentido, dan forma al patrón reproductivo de cada especie y se deben determinar los roles específicos de tales estructuras para comprender adecuadamente los mecanismos que gobiernan la ovulación. A título de ejemplo, se ha demostrado que la fluctuación en los niveles de estradiol durante el ciclo estral regula la secreción de GnRH; sin embargo, las neuronas GnRH no expresan la isoforma del receptor de estradiol necesaria para detectar tales cambios. Dos poblaciones de neuronas que expresan estos receptores se localizan en la región periventricular rostral del tercer ventrículo y en el núcleo arqueado, respectivamente, y establecen sinapsis con las neuronas GnRH. Existe evidencia que sugiere que estas neuronas interpretan la concentración de estradiol y luego estimulan la actividad de las neuronas GnRH liberando kisspeptina, un potente inductor de la secreción de GnRH³.

Los experimentos que involucran lesiones térmicas o químicas, así como la deaferenciación mecánica, permitieron a los investigadores determinar la participación de varias estructuras cerebrales en la regulación de la ovulación^{4,5,6,7,8,9,10,11,12} . Estos experimentos, sin embargo, tienen la desventaja de ser invasivos y traumáticos, requiriendo varios días de recuperación antes de evaluar los efectos del tratamiento, impidiendo el análisis de los efectos agudos del tratamiento. Además, afectan permanentemente las áreas objetivo e interrumpen otros procesos fisiológicos a largo plazo. Debido a estos problemas, los resultados de estos experimentos suelen estar oscurecidos por los mecanismos compensatorios homeostáticos en el cuerpo del animal y extraer información precisa sobre la dinámica reguladora temporal en la que está involucrada el área es bastante difícil.

La microinyección de fármacos que interrumpen transitoriamente la actividad de las neuronas a través de cánulas guía es una alternativa adecuada que supera las desventajas mencionadas anteriormente. Las cánulas se pueden colocar en cualquier región del cerebro mediante una cirugía estereotáxica, lo que permite al investigador comenzar el tratamiento farmacológico después de que desaparezcan los efectos de confusión de la cirugía. La microinyección cronometrada de los medicamentos permite a los investigadores probar hipótesis sobre la contribución de la región a un paso particular del proceso y se puede realizar en animales despiertos restringidos o en movimiento libre. Una variedad de medicamentos que incluyen anestésicos locales, agonistas, antagonistas, agonistas inversos y toxinas biológicas como la tetrodotoxina (TTX) pueden microinyectarse en la región de interés en momentos específicos.

TTX es una toxina biológica sintetizada por bacterias que viven en el cuerpo del pez globo, así como otros vertebrados e invertebrados. TTX silencia la actividad neuronal a través del bloqueo selectivo y transitorio de los canales de sodio, lo que resulta en la inhibición de los potenciales de acción dependientes del sodio. En presencia de TTX, las células experimentan una alteración en la fase de despolarización y, por lo tanto, no son excitables, sino que permanecen vivas. El efecto de bloqueo de TTX se explica por su composición molecular: un grupo guanidinio es capaz de pasar a través del aspecto extracelular del canal de sodio, pero el resto de la molécula no puede pasar debido a su tamaño, por lo que se atasca y bloquea el canal^{13,14,15,16,17} . El mecanismo de acción del TTX permitió su uso como herramienta para estudiar el sistema nervioso tanto in vitro como in vivo. La inyección intracerebral de esta toxina se ha utilizado para estudiar el papel de las áreas discretas del cerebro en varios procesos como la retención de la memoria^18,el sueño y la excitación^19,el reconocimiento de^{lugares 20,}la navegación espacial^21,el abuso de drogas^22,la termorregulación^23,el desarrollo de la esquizofrenia^24,el comportamiento sexual²⁵ y la regulación de la ovulación²⁶ entre otros. En este protocolo describimos los efectos sobre la ovulación de la inactivación transitoria de núcleos hipotalámicos por microinyección TTX en ratas despiertas y desenfrenadas.

Protocolo

Los procedimientos con animales fueron aprobados por el Comité de Ética de la Facultad de Estudios Superiores Zaragoza, UNAM. Esta institución opera en estricto cumplimiento con las normas mexicanas para el manejo de animales, Norma Oficial: NOM-062-ZOO-1999, que concueerda con los lineamientos internacionales.

1. Construcción de cánulas bilaterales

1. Extraiga el eje de acero inoxidable del cubo de dos agujas hipodérmicas de 23 G con pinzas de presión y luego retire el pegamento restante con una cuchilla de bisturí.
2. Dibuje una línea de 15 mm aparte del extremo romo de los ejes con un marcador permanente fino. Use pinzas de corte para quitar los extremos biselados.
3. Sujetar los segmentos de 15 mm con hemostáticos finos y presionarlos perpendicularmente con un disco de corte unido a una herramienta rotatoria hasta obtener segmentos de tubo de 14 mm. Este paso se realiza con el fin de eliminar la parte ocluida de los ejes, creando extremos abiertos y romos. Finalmente, inserte una aguja de 30 G a través de los segmentos para eliminar cualquier obstrucción interna.
4. Determinar la distancia entre las estructuras de interés en los hemisferios izquierdo y derecho del cerebro con la ayuda de un atlas cerebral²⁷. Utilice arcilla moldeadora para unir los dos segmentos de 14 mm a un portaobjetos de microscopio y asegúrese de que ambos estén al mismo nivel horizontal. Observar a través de un micrómetro ocular (10x) y ajustar los segmentos con pinzas finas hasta obtener la distancia deseada.
5. Mezcle la pasta de soldadura con ácido clorhídrico al 10% en una proporción de 2: 1 y agregue una gota de la mezcla 2 mm por debajo del extremo romo de los segmentos. Suda ambos segmentos con un solo punto utilizando un soldador y alambre de soldadura de 0,5 mm de diámetro. Asegúrese de que la soldadura no obstruya la luz de los segmentos.
6. Cree un soporte para unir la cánula al soporte estereotáxico cortando un segmento de 10 mm de alambre resistente de acero inoxidable de 0,3 mm. Use arcilla moldeadora para colocar 2 mm del alambre en contacto con el punto de soldadura anterior y el resto colocado sobre el extremo romo de las cánulas. Suerda el alambre a las cánulas.
7. Limpiar la superficie de las cánulas con etanol al 70% para eliminar el exceso de la pasta de soldadura. Enjuague el interior de las cánulas con agua estéril para eliminar las partículas metálicas. Repita este proceso hasta que no se puedan detectar partículas bajo el microscopio a un aumento de 10x.

2. Construcción de obturadores y tapas

1. Para construir los obturadores corte dos segmentos de 16 mm de alambre blando redondo de acero inoxidable (0,35 mm de diámetro). Sostenga una cánula bilateral con hemostáticos, perpendicular a un banco de laboratorio, e inserte uno de estos segmentos en cada cánula hasta que lleguen al banco. Dobla el remanente en un ángulo de 90°.
2. Para las tapas corte dos segmentos de 2 mm de tubo de silicona (diámetro interior = 0,76 mm) y aplique una gota de pegamento de silicio en uno de los extremos de cada segmento. No deje que el pegamento entre en el tubo. Dejar secar durante al menos 24 horas.

3. Construcción de microinyectores

1. Repita el paso 1.1, usando agujas hipodérmicas de 30 G en su lugar para crear los ejes.
2. Dibuje una línea de 18,5 mm aparte del extremo romo de los ejes y retire el resto de los extremos biselados con pinzas de corte.
3. Repita el paso 1.1 con una sola aguja de 23 G para construir adaptadores cortando dos segmentos de 6 mm de largo a partir del extremo romo.
4. Eliminar las porciones ocluidas de los segmentos de 6 mm presionándolos perpendicularmente contra el disco de corte hasta obtener dos adaptadores de 4 mm. Eliminar cualquier obstrucción interna.
5. Inserte el extremo biselado de los segmentos de 30 G en los adaptadores. Mire a través de un estereomitroscopio para asegurarse de que el extremo de ambos, segmentos y adaptadores, estén al mismo nivel. Aplique pegamento de cianoacrilato en la articulación distal con un hisopo de algodón y deje secar durante 15 minutos.
6. Remoje dos conectores de tubos de teflón en etanol al 70% durante 5 minutos y luego conéctelos a los microinyectores a través de los adaptadores. Espere hasta que el diámetro de los conectores se reduzca durante al menos 24 horas y luego esterilice el microinyector con un método de baja temperatura para evitar daños en los conectores (se recomienda la esterilización por óxido de etileno).

4. Mantenimiento animal y frotis vaginales

1. Utilice ratas encapuchadas hembras adultas cíclicas(Rattus norvegicus,cepa CIIZ-V) que pesen entre 230 y 260 gramos. Aloja a las ratas en grupos de cuatro en jaulas estándar de polipropileno en una habitación con un fotoperíodo de luz-oscuridad de 14:10. Ajuste la temperatura y la humedad a 22 ± 2 ° C y al 40%, respectivamente. Proporcionar alimentos y agua ad libitum.
2. Tome frotis vaginales todos los días entre las 10:00 y las 12:00 h.
   1. Esterilizar un lazo bacteriológico modificado con un diámetro interior de 1 mm utilizando una lámpara de alcohol y enfriarlo con agua estéril. Sostenga a la rata con un agarre seguro e introduzca 5 mm del asa bacteriológica en la vagina, tocando sus paredes internas. Retire el asa bacteriológica. Si tiene éxito, se verá una caída nublada en la punta. Coloque esta gota en un portaobjetos de microscopio.
   2. Repita este proceso para cada rata esterilizando y enfriando el bucle entre cada animal.
   3. Después de que las gotas se sequen, se tiñe con hematoxilina-eosina y observe las muestras bajo un microscopio a 10x.
   4. Determinar la proporción de leucocitos, células nucleadas epiteliales y células queratinizadas en cada frotis y clasificarlo según los criterios de etapas del ciclo estral reportados en la Figura 1,que concueerda con la literatura previa^28,29.

5. Implantación estereotáxica de las cánulas

NOTA: Realizar la implantación de las cánulas después de una cirugía estereotáxica aséptica regular y cumpliendo con las normas institucionales.

1. Antes de la cirugía
   1. Esterilizar instrumentos quirúrgicos, cánulas, tornillos quirúrgicos, obturadores, gasas e hisopos de algodón de madera 24 horas antes de la cirugía utilizando un autoclave de vapor. Esterilizar las puntas de los instrumentos metálicos entre cirugías consecutivas limpiándolas con peróxido de hidrógeno al 10% seguido de agua y luego colocarlas en un esterilizador de cuentas calientes.
   2. Prepare las áreas de trabajo y el instrumento estereotáxico antes de sacar al animal de la sala de clases. Prepare al animal para la cirugía en un área que se encuentre lo más lejos posible de la mesa de cirugía para evitar la contaminación durante el procedimiento.
   3. Limpie las áreas de preparación y cirugía con etanol al 70% seguido de una aplicación de una solución de cloruro al 10% durante diez minutos. Limpie la base, el marco y los manipuladores del instrumento estereotáxico con etanol al 70% y esterilice las puntas de las barras para los oídos con un esterilizador de cuentas calientes y enfríe al aire antes de la cirugía.
   4. Realice la cirugía con una bata de laboratorio dedicada, máscara facial, capó para la cabeza, mangas quirúrgicas, cubiertas de zapatos y guantes quirúrgicos. Pídale al asistente que prepare a los animales para la cirugía y verifique su estado general durante el procedimiento.
   5. Conecte la cánula al soporte estereotáxico. Pídale al asistente que traiga al primer animal que será operado a la habitación. Seleccione ratas en diestro para la cirugía, ya que las observaciones de nuestro laboratorio indican que estos animales recuperan los ciclos estrales adecuados más rápido que las ratas operadas en otras etapas, probablemente porque la respuesta al estrés cambia junto con el ciclo estral.
   6. Pesar al animal e inducir anestesia con 4% de isoflurano en oxígeno al 100% dentro de una cámara de inducción para ratas conectada a un vaporizador de isoflurano. Para evitar estresar a los animales, no prellene la cámara. Confirme un plano quirúrgico de anestesia comprobando la dilatación de la pupila y la pérdida de dolor medida por las pruebas de pellizco de la cola y el oído después de observar la pérdida del reflejo de enrechamiento.
      1. Anestesiar a la rata mediante una inyección intraperitoneal de una mezcla de ketamina (100 mg/kg) y xilazina (10 mg/kg) si no se dispone de un vaporizador de isoflurano.
   7. Retire la rata de la cámara de inducción y use un cono nasal en la tabla de preparación para mantener los efectos de la anestesia con isoflurano al 2,5% en oxígeno al 100%. Recorte el cabello del cuero cabelludo con cortapelos y elimine el vello suelto con un rodillo de pelusa. Inyecte una dosis subcutánea preoperatoria de 2 mg/kg de Meloxicam y 5 mg/kg de Enrofloxacina como antiinflamatorio/analgésico no esteroideo y antibiótico, respectivamente.
      1. Aplique lágrimas artificiales de hipromelosa en cada ojo para evitar la desecación durante la cirugía.
   8. Monte al animal en el instrumento estereotáxico sobre una almohadilla de calentamiento utilizando barras para los oídos sin ruptura y una máscara de anestesia. Ajuste la abrazadera de la nariz para asegurarse de que la cabeza del animal sea plana. Realice un exfoliante quirúrgico en el área afeitada alternando entre povidona yodada con jabón y etanol al 70% una vez y luego usando povidona yodada y etanol al 70% dos veces. Inserte un termómetro rectal para registrar la temperatura del animal durante el procedimiento y luego cúbralo con un campo quirúrgico estéril.
2. Durante la cirugía
   1. Use un bisturí para hacer una incisión de 2 cm en la piel y el músculo en el medio del área afeitada. Retire el periostio del cráneo usando un hisopo de algodón recubierto con peróxido de hidrógeno al 2% para revelar bregma o lambda, los puntos de referencia que se utilizarán para calcular las coordenadas objetivo. Seque el cráneo con aire para una mejor visualización del punto de referencia.
   2. Utilice los manipuladores del instrumento estereotáxico para mover la cánula a una posición directamente encima del punto de referencia de su elección. Registre las coordenadas anterior-posterior y medial-lateral del instrumento estereotáxico y utilícelas para calcular las coordenadas del área objetivo de acuerdo con el atlas cerebral²⁷.
   3. Establezca las coordenadas calculadas en el instrumento estereotáxico y coloque la punta de la cánula en la superficie del cráneo. Registre la coordenada dorsal-ventral y utilí ante ella para calcular la profundidad en el área objetivo.
   4. Retire el brazo del manipulador desenroscándolo del marco. Use una rebaba dental unida a una herramienta rotatoria a una velocidad de 15,000 rpm para hacer una marca en el lugar donde se realizará la craneotomía. Luego use la rebaba para hacer tres agujeros, formando un triángulo equilátero alrededor de la marca. Estos agujeros no deben perforar el cráneo. Inserte los tornillos quirúrgicos en los orificios, asegurándose de que estén bien colocados.
   5. Haga que la craneotomía sea lo suficientemente ancha como para acomodar la distancia entre las áreas objetivo en cada hemisferio. Debe ser lo más pequeño posible en diámetro pero lo suficientemente grande como para permitir la bajada de la cánula sin tocar los bordes del cráneo, ya que esto modificará la trayectoria. Realizar la craneotomía de forma gradual, aplicando la menor presión posible. El cráneo del roedor tiene solo unos pocos milímetros de grosor y es fundamental para preservar la integridad de los tejidos de abajo.
   6. Una vez que la duramadre sea visible, use una aguja estéril de 21 G con la punta curvada en un ángulo de 90 ° para eliminar las astillas de hueso y hacer un corte anterior-posterior en las meninges. Use la técnica Wirtshafter y sus colegas³⁰ para evitar daños en el seno sagital superior si el área objetivo se encuentra cerca de la línea media.
      1. Coloque el soporte con la cánula en el marco y use el manipulador dorsal-ventral para alcanzar la coordenada ventral. Verifique que la aguja no toque los bordes mientras desciende y aumente el diámetro de la craneotomía si es necesario.
         NOTA: Es importante que la punta de las cánulas guía se dirija a una región que va de 0,5 a 2,0 mm por encima de la región de interés. Esto se debe a la reacción inflamatoria del cerebro en respuesta a la introducción de cuerpos extraños y a la destrucción del tejido. Esto es especialmente crítico si la región de interés es pequeña y la distancia de trabajo debe calcularse empíricamente de antemano.
   7. Aplique cemento dental para unir la cánula al cráneo y déjela secar. Asegúrese de que el cemento dental no cubra el extremo romo de la cánula, ya que esto la obstruirá irreversiblemente. Espere hasta que el cemento se solidifique por completo.
   8. Inserte los obturadores para evitar obstrucciones adicionales y para garantizar la permeabilidad durante el estudio. Póngase la tapa de silicona para evitar la contaminación.
3. Después de la cirugía
   1. Reemplace los líquidos perdidos mediante una inyección intraperitoneal de 1.0 ml de solución salina estéril a temperatura fisiológica. Coloque al animal en una jaula de recuperación con soporte térmico hasta que se recupere de la anestesia. Verifique la temperatura y la frecuencia cardíaca / respiratoria del animal periódicamente. Los efectos del isoflurano duran unos minutos después de la interrupción del flujo de gases, mientras que los efectos de ketamina/xilazina duran de 40 a 50 minutos.
   2. Proporcionar inyecciones postoperatorias de los medicamentos antibióticos, analgésicos y antiinflamatorios (a las mismas dosis y rutas indicadas anteriormente) durante 48-72 h e inspeccionar de cerca a los animales diariamente durante el resto del experimento. Informe cualquier signo de dolor, estrés o pérdida de peso a los servicios veterinarios o a un miembro capacitado del laboratorio. No realice ninguna otra manipulación a las ratas durante este período.
   3. Comience a tomar frotis vaginales después del tratamiento postoperatorio y continúe haciéndolo hasta que el animal muestre tres ciclos estrales consecutivos de cuatro días.
      NOTA: Los catéteres yugulares crónicos se pueden implantar quirúrgicamente, lo que permite al investigador tomar muestras de sangre en serie para analizar la secreción de hormonas como estradiol, progesterona, testosterona, hormona luteinizante, hormona estimulante del folículo y corticosterona. Recomendamos colocar un catéter de este tipo una vez que el animal se recupera de la cirugía cerebral, ya que esto mejorará la tasa de supervivencia al tiempo que evita la obstrucción del catéter que puede resultar de un tiempo de recuperación prolongado.

6. Manejo de tetrodotoxinas y preparación de soluciones

PRECAUCIÓN: TTX es una de las sustancias más tóxicas conocidas. Actúa sobre los músculos esqueléticos y el tejido nervioso. La intoxicación por contacto es poco probable, pero cualquier herida abierta es una vía potencial para la inoculación en el cuerpo. Las principales preocupaciones a la hora de trabajar con TTX son la punción de la piel con instrumentos afilados que han estado en contacto con la toxina y la generación de aerosoles que pueden llegar a la boca, ojos y mucosas. Dependiendo de la dosis, TTX puede ser letal si es inhalado, ingerido o inoculado por la piel. Causará una fuerte irritación de los ojos. La DL50 ha sido probada en ratones mediante administración oral e intravenosa y es de 334 μg/kg y 7,3 μg/kg, respectivamente. No hay antitoxina disponible en este momento.

NOTA: La sustancia inactivante es un NaOCl al 1,0% con o sin 0,25 N NaOH, o una solución de lejía al 10%. La inactivación completa ocurre después de 30 minutos de exposición. TTX no puede ser completamente inactivado por ningún derivado de cloruro a una concentración inferior al 10%, por autoclave ni por esterilización por calor seco a una temperatura inferior a 500 ° F. Todos los procedimientos que involucran TTX deben ser realizados por dos personas bien informadas que usan pares internos y externos de guantes de nitrilo, bata de laboratorio dedicada, gafas de seguridad, máscara facial desechable, zapatos cerrados y pantalones de cuerpo entero.

1. Preparación de la solución de stock
   1. Coloque una almohadilla que esté empapada con la sustancia inactivante en la campana de humos para evitar la contaminación en caso de derrame. Asegúrese de que la campana extractora de humos funciona correctamente antes de comenzar. Prepare un receptáculo con la solución inactivante para desechar las puntas de pipeta.
   2. Resuspend polvo liofilizado estéril de citrato TTX de acuerdo con las instrucciones del fabricante mediante una titulación extremadamente cuidadosa y lenta con líquido cefalorraquídeo artificial estéril, enjuagando las paredes del vial en el proceso. Evite la formación de espuma y aerosol. Siga una técnica aséptica para evitar la contaminación de la solución TTX, ya que se inyectará en el cerebro de animales vivos. Use una jeringa con una aguja en lugar de una micropipeta si sus viales de TTX tienen una membrana externa para evitar la formación de aerosoles.
   3. Alicuar la solución de caldo en microtubos estériles. Haga que las alícuotas sean lo más pequeñas posible, ya que los ciclos de congelación / descongelación pueden alterar la estabilidad de las moléculas. No llene más de la mitad de los tubos porque el agua aumenta de volumen cuando se congela, lo que puede provocar la apertura de la tapa y la contaminación del tubo y otras muestras almacenadas en el recipiente.
   4. Descontaminar el exterior de los tubos y las superficies donde se utilizó TTX con la sustancia inactivante. Guarde los tubos a -20 °C en una caja de viales dentro de un recipiente secundario.
2. Diluir la solución de caldo a una concentración de trabajo
   1. Prepare soluciones recién diluidas el día en que se utilizarán, ya que las soluciones diluidas son menos estables. Coloque una almohadilla que esté empapada con la sustancia inactivante en la campana de humos y un micro tubo-rack encima de ella. Prepare un receptáculo con la solución inactivante para desechar las puntas de pipeta.
   2. Pipetear la solución de caldo en la parte inferior de un microtubo estéril y luego agregar la cantidad calculada de líquido cefalorraquídeo artificial para lograr una concentración de 10 ng / μL. Como se describe para la re-suspensión del polvo TTX, realice una titulación extremadamente cuidadosa y lenta, enjuagando las paredes del vial y evitando la formación de espuma y aerosol.
   3. Si las muestras que han estado en el congelador se utilizarán para la microinyección, se les debe permitir equilibrar a temperatura ambiente durante al menos una hora antes del experimento.

7. Microinyección de TTX o soluciones de vehículos en ratas que se mueven libremente

1. Configure la bomba de microinyección con la velocidad de infusión y el tiempo total de inyección según el experimento. Calcule estos parámetros de antemano teniendo en cuenta el volumen ocupado por la estructura objetivo y la cantidad de solución a inyectar. Para este experimento, inyecte 200 nL de solución a una velocidad de 50 nL por minuto durante un tiempo total de perfusión de 4 minutos.
2. Llene dos jeringas Hamilton de 10 μL con agua destilada estéril, inserte un trozo de tubo de teflón estéril en el conector del tubo de cada microinyector, asegurándose de que la longitud del tubo no limite el movimiento de la rata (el tubo se puede esterilizar con óxido de etileno).
3. Coloque una almohadilla que esté empapada con la sustancia inactivante y un cuadrado de 2 cm x 2 cm de película de parafina sobre ella. Pipetear una cantidad suficiente de TTX para llenar la aguja del inyector y 1 cm del tubo por encima de la película. Absorba la gota TTX retrayendo suavemente el émbolo. Monte las jeringas en la bomba de microinyección y use sus controles para manipular el émbolo hasta que se pueda ver una gota de TTX en la punta de cada microinyector. Deseche las gotas en la almohadilla empapadas con sustancia inactivante.
4. Seleccione las ratas que serán microinyectadas. Use solo ratas que mostraron al menos tres ciclos consecutivos después de la cirugía. Considere su etapa del ciclo y la hora del día. Tanto el tiempo como la etapa dependen de la hipótesis específica que va a probar, para este experimento se producen 14:00 horas de proestro seleccionadas ya que las señales preovulatorias nerviosas que gobiernan la secreción fástica de GnRH se producen en este momento. Transportarlos a la habitación donde se llevará a cabo la inyección dentro de sus propias jaulas de vivienda para evitar angustia.
5. Sostenga a la rata con un agarre firme, retire la tapa y los obturadores de las cánulas, inserte los microinyectores en las cánulas guía y devuelva al animal a la jaula.
6. Encienda la bomba y espere hasta que finalice la microinyección. Observar al animal durante este período para detectar un posible desprendimiento de los microinyectores y evitar la torsión de los tubos de teflón.
7. Deje los microinyectores en su lugar durante dos minutos adicionales para evitar el reflujo de la solución. Retíralos, limpia la superficie del implante con solución antiséptica de yodopovidona, evitando su flujo dentro de las cánulas guía. Inserte obturadores estériles, póngase la tapa y devuelva al animal a la sala de la colonia. Observe al animal periódicamente para detectar cualquier posible efecto secundario de la droga.
8. Encienda la bomba con los mismos parámetros que durante la microinyección y compruebe si hay un flujo correcto para asegurarse de que la permeabilidad del sistema se haya conservado durante el procedimiento.
9. Presione el émbolo para expulsar el TTX/vehículo fuera del microinyector hasta que la burbuja de aire llegue a la punta de la aguja. Recuerda el TTX en su microtubo. Llene la jeringa con agua destilada y utilícesla para limpiar el interior de los tubos. Deseche el agua en la sustancia inactivante y repita este proceso al menos tres veces. Limpie el exterior de jeringas, tubos y microinyectores con un paño empapado en la sustancia inactivante.

8. Eutanasia y procesamiento de tejidos

1. El día del estro predicho o confirmado vaginalmente, inyecte a la rata una sobredosis intraperitoneal de pentobarbital de sodio (75 mg / kg). Verifique si hay pérdida de conciencia e inyecte 200 nL de una solución de azul de metileno al 0.5% a través de las cánulas guía como se describe en los pasos 7.1 a 7.9. Verifique si hay signos de dolor usando la prueba de pellizco de dedo del dedo deldo del día o la cola y, si no se detecta ninguno, decapitar a la rata con una guillotina de roedores.
2. Use tijeras para abrir la cavidad abdominal y encontrar los ovarios. Use tijeras finas de iris para diseccionar cada ovario, cortando en la unión útero-trompa con la ayuda de una lupa. Evite dañar el oviducto porque esto resultará en la pérdida de ovocitos.
3. Coloque los ovarios debajo de un estereomitroscopio y use una cuchilla de afeitar para eliminar todo el tejido graso sin dañar el órgano. Retire el oviducto de cada ovario cortando con la cuchilla de afeitar lo más lejos posible de la región de la ampolla. Monte cada oviducto en un tobogán diferente y cúbralo con una gota de agua. Guarde los ovarios en un vial que contenga la solución de Bouin.
4. Seque suavemente los oviductos con una toalla de papel absorbente y busque la ampolla debajo del estereomitroscopio. Con la mano no dominante, sostenga el oviducto en su lugar pellizcando lejos de la ampolla con una aguja de 23 G, luego use otra aguja de 23 G en la mano dominante para hacer una incisión de 1 mm en la región media de la ampolla. Los complejos cúmulo-ovocito sobresaldrán de la incisión como una gota de líquido viscoso (Figura 2D). Use la aguja en la mano dominante para tirar suave y lentamente de la gota lejos del oviducto. Presione el remanente de la ampolla para asegurarse de que no queden ovocitos en el interior. Extraiga los ovocitos de los oviductos lo más rápido posible, ya que la desecación del oviducto atrapará irreversiblemente los ovocitos en su interior.
5. Retire el oviducto del portaobjetos y espere hasta que la gota de líquido que contiene los ovocitos se seque. Mante la muestra con hematoxilina-eosina. Utilice el medio de montaje para cubrir el deslizamiento. Observar bajo el microscopio (10x) para determinar el número de ovocitos desprendidos por cada ovario.
   NOTA: El sacrificio por perfusión cardíaca no se realiza en este protocolo ya que los ovocitos quedarían atrapados en los oviductos y por lo tanto serían necesarios métodos histológicos para valorar la ovulación. Si el usuario debe perfundirse para analizar otros tejidos, primero se pueden extirpar los ovarios y sujetar las arterias descendentes con hemostáticos gruesos debajo del hígado para evitar fugas de fijador.
6. Retire la piel de la cabeza y sumerja el cráneo en un recipiente de vidrio con una solución de formalina al 10%. Permita la fijación de la cabeza durante al menos diez días antes de retirar la cánula para evitar la distorsión del tejido. Para eliminar la cánula, use tijeras para separar todos los músculos de la región del cráneo que la rodea. Corte entre los huesos nasales y frontales con recortadores de hueso y luego retire el hueso occipital. Inserte la punta de los recortadores en el foramen magnum y comience a cortar a través de las crestas sagitales que llegan al remanente del hueso nasal.
7. La región aislada de la parte superior del cráneo debe contener los huesos frontales y parietales. Retire la cánula implantada unida a la parte superior del cráneo tirando lentamente hacia arriba perpendicularmente a la cabeza. Corte cualquier porción adjunta de las meninges con tijeras finas de iris para evitar la deformación del cerebro.
8. Haga un corte anterior-posterior en las meninges y póngalas a un lado para eliminar el cerebro de la base del cráneo. Inserte pinzas romas debajo de los bulbos olfativos y tire suavemente del cerebro hasta que los nervios ópticos sean visibles. Corta los nervios con tijeras finas de iris y saca el cerebro. Preservar el cerebro en solución fijadora.
9. Obtener secciones de 50 μm de espesor del cerebro utilizando un vibratomo, montarlas en portaobjetos recubiertos de poli-L-lisina (0,1% en agua destilada) y teñir con la técnica Nissl. Observe las diapositivas bajo el microscopio (10x) para determinar la posición final de las cánulas(Figura 2A-2C)y la propagación del tinte con la ayuda de un atlas cerebral de^{rata 27}.

Resultados

El protocolo descrito anteriormente se probó mediante la evaluación de los efectos de un solo TTX o vehículo (líquido cefalorraquídeo artificial; ACSF) microinyección en uno de los dos núcleos diferentes que se sabe que están involucrados en la regulación de la ovulación en la rata: el supraquiasmático y el núcleo arqueado. Se eligió el núcleo supraquiasmático ya que contiene el marcapasos circadiano central en mamíferos. Está implicado en la regulación de eventos cíclicos como la secreción de gonadot...

Discusión

Este artículo describe un método para inactivar transitoriamente, en un momento dado, una región discreta en el cerebro de ratas despiertas y sin restricciones. También se proporciona un método simple para rastrear su ciclo estral y evaluar la ovulación. Este protocolo permite un análisis directo de la contribución de regiones cerebrales específicas a los mecanismos que impulsan la ovulación al comparar el resultado ovulatorio de los animales tratados con TTX con el de los tratados con vehículos. Con la excepc...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 μL Hamilton syringes	Hamilton	80314
21 G x 1" stainless steel hypdermic needle	BD	305165
23 G x 1" stainless steel hypdermic needle	BD	305145
30 G x 1/2" stainless steel hypdermic needle	BD	305106
Artificial cerebrospinal fluid	BASi	MD-2400
Bone trimer	Fine Science Tools	16152-12
Burr for micro drill	Fine Science Tools	19007-05
Clipper	Wahl
Cut-off disc	Dremel	SM5010
Cutting tweezers	Truper	17367
Cyanocrylate glue	Kola loka	K-1
Dental cement	Nic Tone
Enrofloxasin	Senosiain
Eosin	Sigma	E4009
Estereoscope	Zeiss
Extra fine Bonn scissors	Fine Science Tools	14084-08
Face mask	Lanceta HG	60036
Graefe Forceps	Fine Science Tools	11050-10
Hematoxilin	Sigma	H3136
Hemostats	Fine Science Tools	13008-12
Hot bead sterilizer	Fine Science Tools	18000-45
Hydrochloric acid	Sigma	320331
Hypromelose artificial tears	Sophia Labs	8950015
Isoflurane	Pisa Agropecuaria
Meloxicam	Aranda	1183
Microinjection pump	KD Scientific	788380
Monomer	Nic Tone
Mototool	Dremel	3000
Nitrile gloves	Lanceta HG	69028
Non-Rupture Ear Bars	David Kopf Instruments	855
Poly-L lysine	Sigma	P4707
Povidone-iodine	Dermo Dine
Povidone-iodine with soap	Germisin espuma
Pressure tweezers	Truper	17371
Rat anesthesia mask	David Kopf Instruments	Model 906
Saline solution	PISA
Scalpel	Fine Science Tools	10004-13
Scalpel blade	Fine Science Tools	10015-00
Sodium pentobarbital	Pisa Agropecuaria
Standard electrode holder	David Kopf Instruments	1770
Stainless steel wire	American Orthodontic	856-612
Stereotaxic apparatus	David Kopf Instruments	Model 900LS
Surgical Sissors	Fine Science Tools	14001-12
Teflon connectors	Basi	MD-1510
Teflon tubing	Basi	MF-5164
Tetrodotoxin	Alomone labs	T-500
Vaporizer	Kent scientific	VetFlo