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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt den Aufbau eines kostengünstigen Mikroinjektionssystems, seine stereotaktische Implantation in Tiefehirnstrukturen und das Verfahren zur zeitgesteuerten Mikroinjektion von Tetrodotoxin bei wachen und hemmungslosen Ratten. Ziel ist es, die Beteiligung hypothalamischer Strukturen an der Regulation des Eisprungs durch Hemmung ihrer neuronalen Aktivität aufzudecken.

Zusammenfassung

Viele experimentelle Ansätze wurden verwendet, um die Rolle des Gehirns bei der Regulation des Eisprungs zu untersuchen. Beispiele sind die Läsion und Taubferentation neuronaler Gruppen, beides invasive Methoden, die die Integrität des Zielbereichs dauerhaft beeinträchtigen. Diese Methoden gehen mit Kollateraleffekten einher, die die Analyse akuter und zeitlicher Regulationsmechanismen beeinflussen können. Die stereotaxische Implantation von Leitkanülen, die auf bestimmte Gehirnregionen abzielen, gefolgt von einer Erholungsphase, ermöglicht es den Forschern, verschiedene Medikamente nach dem Verschwinden der unerwünschten Auswirkungen der Operation zu mikroinjektieren. Tetrodotoxin wurde verwendet, um die Rolle mehrerer Hirnareale in verschiedenen physiologischen Prozessen zu bestimmen, da es vorübergehend die natriumabhängigen Aktionspotentiale hemmt und so alle neuronalen Aktivitäten in der Zielregion blockiert. Dieses Protokoll kombiniert diese Methode mit Strategien zur Beurteilung des Östrogenzyklus und des Eisprungs, um die Rolle diskreter Hirnregionen bei der Regulation des Eisprungs zu bestimmten Zeiten eines bestimmten Stadiums des Östrogenzyklus aufzudecken. Wache und hemmungslose Ratten (Rattus norvegicus) wurden verwendet, um die blockierenden Wirkungen zu vermeiden, die Anästhetika und Stresshormone auf den Eisprung ausüben. Dieses Protokoll kann leicht an andere Spezies, Gehirnziele und pharmakologische Wirkstoffe angepasst werden, um verschiedene physiologische Prozesse zu untersuchen. Zukünftige Verbesserungen dieser Methode umfassen das Design eines Mikroinjektionssystems, das Glaskapillaren mit kleinem Durchmesser anstelle von Führungskanülen verwendet. Dies reduziert die Menge an Gewebe, die während der Implantation beschädigt wird, und verringert die Ausbreitung der infundierten Medikamente außerhalb des Zielbereichs.

Einleitung

Der Eisprung ist der Prozess, bei dem eine oder mehrere reife Eizellen einmal in jedem Estral- / Menstruationszyklus aus den Eierstöcken freigesetzt werden. Da alle Säugetierarten auf die Produktion von Gameten angewiesen sind, um sich zu vermehren, hat das Verständnis der Mechanismen, die den Eisprung regulieren, einen großen Einfluss auf Bereiche von der Biomedizin über die Viehwirtschaft bis hin zur Erhaltung gefährdeter Arten. Der Eisprung wird durch die Hypothalamus-Hypophysen-Ovarial-Achse reguliert, die mehrere hypothalamische und extrahypophthalamische Bereiche, die Gonadotrope in der vorderen Hypophyse und die Theka- und Granulosazellen umfasst, die zusammen mit den Eizellen die Eierstockfollikel in den Eierstöcken bilden1.

Eierstockfollikel wachsen, entwickeln und ovulieren schließlich als Reaktion auf die tonische und phasische Sekretion des follikelstimulierenden Hormons und des luteinisierenden Hormons, der beiden Gonadotropine, die von den Gonadotropen abgesondert werden. Das Muster der Gonadotropinsekretion ist entscheidend für die richtige Follikelentwicklung und den Eisprung und wird durch das Gonadotropin-Releasing-Hormon (GnRH)1,2reguliert. Dieses Neuropeptid wird von Neuronen synthetisiert, die im gesamten basalen Zwischenhirn verstreut sind, und dann an das Portalgefäß abgesondert, das den Hypothalamus und die vordere Hypophyse verbindet. Die sekretorische Aktivität der GnRH-Neuronen wird wiederum durch synaptischen Input aus verschiedenen Gehirnstrukturen moduliert. Diese Strukturen vermitteln Informationen über den Zustand der äußeren und inneren Umgebung des Organismus, einschließlich der Verfügbarkeit von Nahrung, der Länge der Photoperiode und der Konzentration von Hormonen im Blut. In diesem Sinne prägen sie das Fortpflanzungsmuster jeder Art und die spezifischen Rollen solcher Strukturen müssen bestimmt werden, um die Mechanismen des Eisprungs richtig zu verstehen. Als Beispiel wurde gezeigt, dass die Schwankung des Östradiolspiegels während des Östrogenzyklus die Sekretion von GnRH reguliert; GnRH-Neuronen exprimiert jedoch nicht die Estradiolrezeptor-Isoform, die zum Nachweis solcher Veränderungen erforderlich ist. Zwei Populationen von Neuronen, die diese Rezeptoren exprimieren, befinden sich in der rostralen periventrikulären Region des dritten Ventrikels bzw. im Arkuatkern und stellen Synapsen mit GnRH-Neuronen her. Es gibt Hinweise darauf, dass diese Neuronen die Konzentration von Östradiol interpretieren und dann die Aktivität von GnRH-Neuronen stimulieren, indem sie Kisspeptin, einen starken Induktor der GnRH-Sekretion3,freisetzen.

Experimente mit thermischen oder chemischen Läsionen sowie mechanischer Taubferentation ermöglichten es den Forschern, die Beteiligung mehrerer Gehirnstrukturen an der Regulation des Eisprungs zu bestimmen4,5,6,7,8,9,10,11,12 . Diese Experimente haben jedoch den Nachteil, dass sie invasiv und traumatisch sind und mehrere Tage der Genesung erfordern, bevor die Auswirkungen der Behandlung bewertet werden, was die Analyse der akuten Auswirkungen der Behandlung behindert. Zudem beeinflussen sie dauerhaft die Zielbereiche und stören langfristig andere physiologische Prozesse. Aufgrund dieser Probleme werden die Ergebnisse dieser Experimente in der Regel durch die homöostatischen Kompensationsmechanismen im Körper des Tieres verdeckt und es ist ziemlich schwierig, genaue Informationen über die zeitliche Regulationsdynamik zu extrahieren, an der der Bereich beteiligt ist.

Die Mikroinjektion von Medikamenten, die die Aktivität von Neuronen durch Leitkanülen vorübergehend stören, ist eine geeignete Alternative, die die oben genannten Nachteile übertrifft. Die Kanülen können durch eine stereotaxische Operation in jeder Gehirnregion platziert werden, so dass der Forscher die medikamentöse Behandlung beginnen kann, nachdem die verwirrenden Auswirkungen der Operation verschwunden sind. Die zeitgesteuerte Mikroinjektion der Medikamente ermöglicht es den Forschern, Hypothesen über den Beitrag der Region zu einem bestimmten Schritt des Prozesses zu testen und kann bei wachen, zurückhaltenden oder sich frei bewegenden Tieren durchgeführt werden. Eine Vielzahl von Medikamenten, darunter Lokalanästhetika, Agonisten, Antagonisten, inverse Agonisten und biologische Toxine wie Tetrodotoxin (TTX), können zu bestimmten Zeiten in die Region des Interesses mikroinjektiert werden.

TTX ist ein biologisches Toxin, das von Bakterien synthetisiert wird, die im Körper des Kugelfisches sowie anderer Wirbeltiere und Wirbellose leben. TTX stillt die neuronale Aktivität durch die selektive und transiente Blockade von Natriumkanälen, was zur Hemmung natriumabhängiger Aktionspotentiale führt. In Gegenwart von TTX erfahren Zellen eine Veränderung in der Depolarisationsphase und sind somit nicht erregbar, sondern bleiben am Leben. Die blockierende Wirkung von TTX erklärt sich durch seine molekulare Zusammensetzung: Eine Guanidiniumgruppe ist in der Lage, den extrazellulären Aspekt des Natriumkanals zu passieren, aber der Rest des Moleküls kann aufgrund seiner Größe nicht passieren, so dass es feststeckt und den Kanal13,14,15,16,17 blockiert . Der Wirkmechanismus des TTX ermöglichte seine Verwendung als Werkzeug zur Untersuchung des Nervensystems sowohl in vitro als auch in vivo. Die intrazerebrale Injektion dieses Toxins wurde verwendet, um die Rolle diskreter Hirnareale in verschiedenen Prozessen wie Gedächtnisretention18, Schlaf und Erregung19, Ortserkennung20, räumliche Navigation21,Drogenmissbrauch 22, Thermoregulation23, Entwicklung von Schizophrenie24, Sexualverhalten25 und Regulierung des Eisprungs26 zu untersuchen unter anderem. In diesem Protokoll beschreiben wir die Auswirkungen der vorübergehenden Inaktivierung von Hypothalamuskernen durch TTX-Mikroinjektion bei wachen und hemmungslosen Ratten auf den Eisprung.

Protokoll

Verfahren mit Tieren wurden von der Ethikkommission der Facultad de Estudios Superiores Zaragoza, UNAM, genehmigt. Diese Institution arbeitet in strikter Übereinstimmung mit den mexikanischen Regeln für den Umgang mit Tieren, offizielle Norm: NOM-062-ZOO-1999, die mit internationalen Richtlinien übereinstimmt.

1. Bau von bilateralen Kanülen

  1. Ziehen Sie den Edelstahlschaft mit einer Druckpinzette aus der Nabe von zwei 23 G Hypodermienadeln und entfernen Sie dann den verbleibenden Kleber mit einer Skalpellklinge.
  2. Zeichnen Sie eine Linie 15 mm vom stumpfen Ende der Wellen mit einem feinen Permanentmarker. Verwenden Sie eine Schneidpinzette, um die abgeschrägenen Enden zu entfernen.
  3. Halten Sie die 15 mm Segmente mit feinen Hämostaten und drücken Sie sie senkrecht mit einer Abschaltscheibe, die an einem Rotationswerkzeug befestigt ist, bis 14 mm Rohrsegmente erhalten sind. Dieser Schritt wird durchgeführt, um den verdeckten Teil der Wellen zu beseitigen und offene und stumpfe Enden zu erzeugen. Führen Sie abschließend eine 30-G-Nadel durch die Segmente ein, um interne Hindernisse zu beseitigen.
  4. Bestimmen Sie den Abstand zwischen den interessierenden Strukturen in der linken und rechten Hemisphäre des Gehirns mit Hilfe eines Hirnatlas27. Verwenden Sie Formton, um die beiden 14-mm-Segmente an einem Objektträger zu befestigen und sicherzustellen, dass sich beide auf der gleichen horizontalen Ebene befinden. Beobachten Sie durch ein Augenmikrometer (10x) und stellen Sie die Segmente mit einer feinen Pinzette ein, bis der gewünschte Abstand erreicht ist.
  5. Lötpaste mit 10% Salzsäure im Verhältnis 2:1 mischen und einen Tropfen der Mischung 2 mm unter das stumpfe Ende der Segmente geben. Löten Sie beide Segmente mit einem einzigen Punkt mit einem Lötkolben und einem Lötdraht mit einem Durchmesser von 0,5 mm. Stellen Sie sicher, dass das Lot das Lumen der Segmente nicht behindert.
  6. Erstellen Sie eine Stütze, um die Kanüle an der stereotaxischen Halterung zu befestigen, indem Sie ein 10-mm-Segment aus elastischem 0,3-mm-Edelstahldraht schneiden. Verwenden Sie Formmasse, um 2 mm des Drahtes in Kontakt mit dem vorherigen Lötpunkt zu legen und den Rest über dem stumpfen Ende der Kanülen zu legen. Löten Sie den Draht an die Kanülen.
  7. Reinigen Sie die Oberfläche der Kanülen mit 70% Ethanol, um den Überschuss der Lotpaste zu entfernen. Spülen Sie das Innere der Kanülen mit sterilem Wasser, um metallische Partikel zu entfernen. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis bei einer 10-fachen Vergrößerung keine Partikel mehr unter dem Mikroskop nachgewiesen werden können.

2. Bau von Obturatoren und Kappen

  1. Zum Bau der Obturatoren schneiden sie zwei 16 mm Segmente aus rundem Edelstahl-Weichdraht (0,35 mm Durchmesser). Halten Sie eine beidseitige Kanüle mit Hämostaten senkrecht zu einer Laborbank und führen Sie eines dieser Segmente in jede Kanüle ein, bis sie die Bank erreichen. Biegen Sie den Rest in einem Winkel von 90°.
  2. Für die Kappen zwei 2 mm Segmente Silikonschläuche (Innendurchmesser =0,76 mm) schneiden und an einem der Enden jedes Segments einen Tropfen Silikonkleber auftragen. Lassen Sie den Kleber nicht in den Schlauch eindringen. Mindestens 24 Stunden trocknen lassen.

3. Bau von Mikroinjektoren

  1. Wiederholen Sie Schritt 1.1 und verwenden Sie stattdessen 30 G Hypodermienadeln, um die Schäfte zu erzeugen.
  2. Zeichnen Sie eine Linie 18,5 mm vom stumpfen Ende der Wellen und entfernen Sie den Rest der abgeschrägen Enden mit einer Schneidpinzette.
  3. Wiederholen Sie Schritt 1.1 mit einer einzigen 23-G-Nadel, um Adapter zu bauen, indem Sie zwei 6 mm lange Segmente ab dem stumpfen Ende schneiden.
  4. Entfernen Sie die verdeckten Teile der 6-mm-Segmente, indem Sie sie senkrecht gegen die Abschaltscheibe drücken, bis zwei 4-mm-Adapter erhalten sind. Beseitigen Sie interne Hindernisse.
  5. Setzen Sie das abgeschrämte Ende der 30 G-Segmente in die Adapter ein. Schauen Sie durch ein Stereomikroskop, um sicherzustellen, dass das Ende von Segmenten und Adaptern auf dem gleichen Niveau ist. Cyanacrylatkleber mit einem Wattestäbchen auf das distale Gelenk auftragen und 15 Minuten trocknen lassen.
  6. Zwei Teflonschlauchanschlüsse 5 Minuten lang in 70% Ethanol einweichen und dann über die Adapter an den Mikroinjektoren befestigen. Warten Sie, bis der Durchmesser der Steckverbinder mindestens 24 Stunden schrumpft, und sterilisieren Sie dann den Mikroinjektor mit einer Niedertemperaturmethode, um eine Beschädigung der Steckverbinder zu vermeiden (Ethylenoxidsterilisation wird empfohlen).

4. Tierpflege und Vaginalabstriche

  1. Verwenden Sie zyklische erwachsene weibliche Kapuzenratten(Rattus norvegicus,CIIZ-V-Stamm) mit einem Gewicht zwischen 230 und 260 Gramm. Beherbergen Sie die Ratten in Vierergruppen in Standard-Polypropylenkäfigen in einem Raum mit einer Hell-Dunkel-Fotoperiode von 14:10. Stellen Sie die Temperatur und Luftfeuchtigkeit auf 22 ± 2 °C bzw. auf 40% ein. Stellen Sie Nahrung und Wasser ad libitum zurVerfügung.
  2. Nehmen Sie vaginale Abstriche jeden Tag zwischen 10:00 und 12:00 Uhr.
    1. Sterilisieren Sie eine modifizierte bakteriologische Schleife mit einem Innendurchmesser von 1 mm mit einer Alkohollampe und kühlen Sie sie mit sterilem Wasser ab. Halten Sie die Ratte mit einem sicheren Griff und führen Sie 5 mm der bakteriologischen Schleife in die Vagina ein und berühren Sie ihre Innenwände. Entfernen Sie die bakteriologische Schleife. Bei Erfolg wird an der Spitze ein bewölkter Tropfen zu sehen sein. Legen Sie diesen Tropfen auf einen Objektträger.
    2. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jede Ratte, die den Kreislauf zwischen jedem Tier sterilisiert und kühlt.
    3. Nachdem die Tropfen abgetrocknet sind, mit Hämatoxylin-Eosin abfärben und die Proben unter einem Mikroskop bei 10x beobachten.
    4. Bestimmen Sie den Anteil von Leukozyten, epithelialen Kernzellen und verhornten Zellen auf jedem Abstrich und klassifizieren Sie ihn nach den Kriterien der Östrogenzyklusstadien, die in Abbildung 1beschrieben sind, die mit der vorherigen Literatur28,29übereinstimmt .

5. Stereotaxische Implantation der Kanülen

HINWEIS: Führen Sie die Implantation der Kanülen nach einer regelmäßigen aseptischen stereotaktischen Operation und unter Einhaltung der institutionellen Normen durch.

  1. Vor der Operation
    1. Sterilisieren Sie chirurgische Instrumente, Kanülen, chirurgische Schrauben, Obturatoren, Gaze und hölzerne Wattestäbchen 24 Stunden vor der Operation mit einem Dampfautoklaven. Sterilisieren Sie die Spitzen metallischer Instrumente zwischen aufeinanderfolgenden Operationen, indem Sie sie mit 10% Wasserstoffperoxid, gefolgt von Wasser, reinigen und dann in einen heißen Perlensterilisator legen.
    2. Bereiten Sie die Arbeitsbereiche und das stereotaktische Instrument vor, bevor Sie das Tier aus dem Heimzimmer entfernen. Bereiten Sie das Tier auf die Operation in einem Bereich vor, der sich so weit wie möglich vom Operationstisch entfernt befindet, um eine Kontamination während des Eingriffs zu vermeiden.
    3. Reinigen Sie die Vorbereitungs- und Operationsbereiche mit 70% Ethanol, gefolgt von einer Anwendung einer 10% igen Chloridlösung für zehn Minuten. Reinigen Sie die Basis, den Rahmen und die Manipulatoren des stereotaktischen Instruments mit 70% Ethanol und sterilisieren Sie die Spitzen der Ohrbügel mit einem heißen Perlensterilisator und kühlen Sie sie vor der Operation luftgekühlt.
    4. Führen Sie die Operation mit einem speziellen Laborkittel, einer Gesichtsmaske, einer Kopfhaube, chirurgischen Ärmeln, Schuhüberzügen und chirurgischen Handschuhen durch. Bitten Sie den Assistenten, die Tiere auf die Operation vorzubereiten und ihren allgemeinen Zustand während des Eingriffs zu überprüfen.
    5. Befestigen Sie die Kanüle am stereotaxischen Halter. Bitten Sie den Assistenten, das erste zu bedienende Tier in den Raum zu bringen. Wählen Sie Ratten in Diestrus für die Operation aus, da Beobachtungen aus unserem Labor darauf hindeuten, dass diese Tiere die richtigen Östrogenzyklen schneller wiederherstellen als Ratten, die in anderen Stadien operiert werden, wahrscheinlich weil sich die Reaktion auf Stress zusammen mit dem Östrogenzyklus ändert.
    6. Wiegen Sie das Tier und induzieren Sie die Anästhesie mit 4% Isofluran in 100% Sauerstoff in einer Induktionskammer für Ratten, die an einen Isofluran-Vaporizer angeschlossen sind. Um eine Belastung der Tiere zu vermeiden, füllen Sie die Kammer nicht vor. Bestätigen Sie eine chirurgische Anästhesieebene, indem Sie die Pupillenerweiterung und den Schmerzverlust überprüfen, gemessen durch die Schwanz- und Ohrquetschtests, nachdem Sie den Verlust des Aufreinheitsreflexes beobachtet haben.
      1. Betäubung der Ratte durch eine intraperitoneale Injektion einer Mischung aus Ketamin (100 mg/kg) und Xylazin (10 mg/kg), wenn kein Isofluran-Vaporizer verfügbar ist.
    7. Entfernen Sie die Ratte aus der Induktionskammer und verwenden Sie einen Nasenkegel in der Vorbereitungstabelle, um die Wirkung der Anästhesie mit 2,5% Isofluran in 100% Sauerstoff aufrechtzuerhalten. Schneiden Sie die Haare der Kopfhaut mit Clippern und entfernen Sie lose Haare mit einer Fusselrolle. Injizieren Sie eine präoperative subkutane Dosis von 2 mg/kg Meloxicam bzw. 5 mg/kg Enrofloxacin als nichtsteroidales entzündungshemmendes/analgetisches und antibiotisches Antibiotikum.
      1. Tragen Sie künstliche Hypromellose-Tränen auf jedes Auge auf, um Austrocknung während der Operation zu vermeiden.
    8. Montieren Sie das Tier im stereotaktischen Instrument über einem Wärmepad mit reißenden Ohrbügeln und einer Anästhesiemaske. Stellen Sie die Nasenklemme ein, um sicherzustellen, dass der Kopf des Tieres flach ist. Führen Sie ein chirurgisches Peeling im rasierten Bereich durch, abwechselnd zwischen Povidon-Jod mit Seife und 70% Ethanol einmal und dann mit Povidon-Jod und 70% Ethanol zweimal. Setzen Sie ein Rektalthermometer ein, um die Temperatur des Tieres während des Eingriffs aufzuzeichnen, und bedecken Sie es dann mit einem sterilen Operationsfeld.
  2. Während der Operation
    1. Verwenden Sie ein Skalpell, um einen 2 cm großen Schnitt in der Haut und den Muskeln in der Mitte des rasierten Bereichs zu machen. Entfernen Sie das Periost aus dem Schädel mit einem Wattestäbchen, das mit 2% Wasserstoffperoxid beschichtet ist, um Bregma oder Lambda zu enthüllen, die Landmarken, die zur Berechnung der Zielkoordinaten verwendet werden. Trocknen Sie den Schädel mit Luft, um das Wahrzeichen besser zu visualisieren.
    2. Verwenden Sie die Manipulatoren des stereotaxischen Instruments, um die Kanüle in eine Position direkt über dem Wahrzeichen der Wahl zu bewegen. Registrieren Sie die vorderen-hinteren und die medial-lateralen Koordinaten aus dem stereotaxischen Instrument und berechnen Sie daraus die Koordinaten des Zielbereichs nach dem Hirnatlas27.
    3. Legen Sie die berechneten Koordinaten im stereotaktischen Instrument fest und platzieren Sie die Spitze der Kanüle auf der Schädeloberfläche. Registrieren Sie die dorsal-ventrale Koordinate und berechnen Sie daraus die Tiefe zum Zielbereich.
    4. Entfernen Sie den Arm des Manipulators, indem Sie ihn vom Rahmen abknählen. Verwenden Sie einen Zahngrat, der mit einer Geschwindigkeit von 15.000 U / min an einem Rotatorwerkzeug befestigt ist, um an der Stelle, an der die Kraniotomie durchgeführt wird, eine Markierung zu hinterlassen. Verwenden Sie dann den Grat, um drei Löcher zu machen und ein gleichseitiges Dreieck um die Markierung zu bilden. Diese Löcher dürfen den Schädel nicht durchbohren. Setzen Sie die chirurgischen Schrauben in die Löcher ein und stellen Sie sicher, dass sie fest platziert sind.
    5. Machen Sie die Kraniotomie breit genug, um den Abstand zwischen den Zielbereichen in jeder Hemisphäre zu berücksichtigen. Es sollte so klein wie möglich sein, aber groß genug, um das Absenken der Kanüle zu ermöglichen, ohne die Grenzen des Schädels zu berühren, da dies die Flugbahn verändern wird. Führen Sie die Kraniotomie schrittweise durch und wenden Sie den geringstmöglichen Druck an. Der Nagetierschädel ist nur wenige Millimeter dick und es ist entscheidend, die Integrität des darunter stehenden Gewebes zu erhalten.
    6. Sobald die Dura mater sichtbar ist, verwenden Sie eine sterile 21 G-Nadel mit der Spitze in einem 90 ° -Winkel gekrümmt, um Knochensplitter zu entfernen und einen vorderen hinteren Schnitt in den Meningen vorzunehmen. Verwenden Sie die Wirtshafter und Kollegen30 Technik, um Schäden am oberen sagittalen Sinus zu vermeiden, wenn sich der Zielbereich in der Nähe der Mittellinie befindet.
      1. Setzen Sie den Halter mit der Kanüle in den Rahmen und verwenden Sie den dorsal-ventralen Manipulator, um die ventrale Koordinate zu erreichen. Überprüfen Sie, ob die Nadel beim Absteigen die Ränder nicht berührt und erhöhen Sie bei Bedarf den Durchmesser der Kraniotomie.
        HINWEIS: Es ist wichtig, dass die Spitze der Leitkanülen auf eine Region abzielt, die zwischen 0,5 und 2,0 mm über der interessierenden Region liegt. Dies ist auf die Entzündungsreaktion des Gehirns als Reaktion auf die Einführung von Fremdkörpern und auf die Zerstörung des Gewebes zurückzuführen. Dies ist besonders kritisch, wenn die interessierende Region klein ist und der Arbeitsabstand im Vorfeld empirisch berechnet werden muss.
    7. Tragen Sie Zahnzement auf, um die Kanüle am Schädel zu befestigen und trocknen zu lassen. Stellen Sie sicher, dass der Zahnzement das stumpfe Ende der Kanüle nicht bedeckt, da dies sie irreversibel behindert. Warten Sie, bis der Zement vollständig erstarrt ist.
    8. Setzen Sie die Obturatoren ein, um weitere Hindernisse zu vermeiden und die Durchgängigkeit während der Studie zu gewährleisten. Setzen Sie die Silikonkappe auf, um eine Kontamination zu vermeiden.
  3. Nach der Operation
    1. Ersetzen Sie verlorene Flüssigkeiten durch eine intraperitoneale Injektion von 1,0 ml steriler Kochsalzlösung bei physiologischer Temperatur. Legen Sie das Tier in einen Erholungskäfig mit thermischer Unterstützung, bis es sich von der Anästhesie erholt. Überprüfen Sie regelmäßig die Temperatur und die Herd-/Atemfrequenz des Tieres. Isofluran-Effekte dauern einige Minuten nach Unterbrechung des Gasflusses an, während Ketamin / Xylazin-Effekte 40-50 min anhalten.
    2. Stellen Sie postoperative Injektionen der Antibiotika, Analgetika und entzündungshemmenden Medikamente (in den gleichen Dosen und Wegen wie zuvor angegeben) für 48-72 h zur Verfügung und untersuchen Sie die Tiere täglich für den Rest des Experiments genau. Melden Sie alle Anzeichen von Schmerzen, Stress oder Gewichtsverlust an Tierarztdienste oder an ein geschultes Mitglied des Labors. Führen Sie während dieser Zeit keine weiteren Manipulationen an den Ratten durch.
    3. Beginnen Sie mit der Einnahme von Vaginalabstrichen nach der postoperativen Behandlung und fahren Sie fort, bis das Tier drei aufeinanderfolgende Östrogenzyklen von vier Tagen zeigt.
      HINWEIS: Chronische Jugularkatheter können chirurgisch implantiert werden, so dass der Forscher serielle Blutproben entnehmen kann, um die Sekretion von Hormonen wie Östradiol, Progesteron, Testosteron, luteinisierendem Hormon, follikelstimulierendem Hormon und Corticosteron zu analysieren. Wir empfehlen, einen solchen Katheter zu platzieren, sobald sich das Tier von der Gehirnoperation erholt hat, da dies die Überlebensrate verbessert und gleichzeitig eine Verstopfung des Katheters vermeidet, die sich aus einer längeren Erholungszeit ergeben kann.

6. Tetrodotoxin Handhabung und Herstellung von Lösungen

ACHTUNG: TTX ist eine der giftigsten bekannten Substanzen. Es wirkt auf Skelettmuskeln und Nervengewebe. Eine Intoxikation durch Kontakt ist unwahrscheinlich, aber jede offene Wunde ist ein potenzieller Weg für die Impfung in den Körper. Die Hauptanliegen bei der Arbeit mit TTX sind die Punktion der Haut mit scharfen Instrumenten, die mit dem Toxin in Kontakt gekommen sind, und die Erzeugung von Aerosolen, die Mund, Augen und Schleimhäute erreichen können. Abhängig von der Dosis kann TTX tödlich sein, wenn es von der Haut eingeatmet, verschluckt oder geimpft wird. Es wird starke Reizung der Augen verursachen. Der LD50 wurde an Mäusen durch orale und intravenöse Verabreichung getestet und beträgt 334 μg/kg bzw. 7,3 μg/kg. Derzeit ist kein Antitoxin verfügbar.

HINWEIS: Inaktivierende Substanz ist eine 1,0% ige NaOCl mit oder ohne 0,25 N NaOH oder eine 10% ige Bleichlösung. Die vollständige Inaktivierung erfolgt nach 30 Minuten Exposition. TTX kann nicht vollständig durch ein Chloridderivat in einer Konzentration unter 10%, durch Autoklavieren oder durch Trockenexterilisation bei einer Temperatur unter 500 ° F inaktiviert werden. Alle Verfahren mit TTX müssen von zwei sachkundigen Personen durchgeführt werden, die innere und äußere Paar Nitrilhandschuhe, einen speziellen Laborkittel, eine Schutzbrille, eine Einweg-Gesichtsmaske, geschlossene Schuhe und eine Hose in voller Länge tragen.

  1. Vorbereitung der Lagerlösung
    1. Legen Sie ein Pad, das mit der inaktivierenden Substanz getränkt ist, in den Abzug, um eine Kontamination im Falle eines Verschüttens zu verhindern. Stellen Sie sicher, dass der Abzug ordnungsgemäß funktioniert, bevor Sie beginnen. Bereiten Sie einen Behälter mit der inaktivierenden Lösung vor, um die Pipettenspitzen zu entsorgen.
    2. Steriles TTX-Citrat-lyophilisiertes Pulver gemäß Herstelleranweisungen durch eine äußerst sorgfältige und langsame Titration mit steriler künstlicher Zerebrospinalflüssigkeit wiedergeben und dabei die Wände der Durchstechflasche abspülen. Vermeiden Sie die Bildung von Schaum und Aerosol. Befolgen Sie eine aseptische Technik, um eine Kontamination der TTX-Lösung zu vermeiden, da sie in das Gehirn lebender Tiere injiziert wird. Verwenden Sie eine Spritze mit einer Nadel anstelle einer Mikropipette, wenn Ihre TTX-Fläschchen eine äußere Membran haben, um die Aerosolbildung zu verhindern.
    3. Aliquot die Stammlösung in sterile Mikroröhrchen. Machen Sie Aliquoten so klein wie möglich, da Gefrier- / Auftauzyklen die Stabilität der Moleküle verändern können. Füllen Sie nicht mehr als die Hälfte der Röhrchen, da das Wasser im gefrorenen Fall an Volumen zunimmt, was zum Öffnen des Deckels und zur Kontamination des Röhrchens und anderer im Behälter gelagerter Proben führen kann.
    4. Dekontaminieren Sie die Außenseite der Röhren und die Oberflächen, auf denen TTX verwendet wurde, mit der inaktivierenden Substanz. Lagern Sie die Röhrchen bei -20 °C in einer Durchstechflaschenbox in einem Sekundärbehälter.
  2. Verdünnen der Stammlösung auf eine Arbeitskonzentration
    1. Bereiten Sie frisch verdünnte Lösungen an dem Tag vor, an dem sie verwendet werden, da verdünnte Lösungen weniger stabil sind. Legen Sie ein Pad, das mit der inaktivierenden Substanz getränkt ist, in den Abzug und ein Mikrorohrgestell darauf. Bereiten Sie einen Behälter mit der inaktivierenden Lösung vor, um die Pipettenspitzen zu entsorgen.
    2. Pipettieren Sie die Stammlösung am Boden eines sterilen Mikroröhrchens und fügen Sie dann die berechnete Menge an künstlicher Zerebrospinalflüssigkeit hinzu, um eine Konzentration von 10 ng / μL zu erreichen. Wie für das erneute Suspendieren des TTX-Pulvers beschrieben, führen Sie eine äußerst vorsichtige und langsame Titration durch, spülen Sie die Wände der Durchstechflasche ab und vermeiden Sie die Bildung von Schaum und Aerosol.
    3. Wenn Proben, die sich auf dem Gefrierschrank befinden, für die Mikroinjektion verwendet werden, müssen sie vor dem Experiment mindestens eine Stunde lang bei Raumtemperatur ausgeglichen werden.

7. Mikroinjektion von TTX- oder Fahrzeuglösungen in frei bewegliche Ratten

  1. Konfigurieren Sie die Mikroinjektionspumpe mit der Infusionsrate und der Gesamtzeit der Injektion gemäß dem Experiment. Berechnen Sie diese Parameter im Voraus unter Berücksichtigung des von der Zielstruktur belegten Volumens und der Menge der zu injizierenden Lösung. Für dieses Experiment injizieren Sie 200 nL Lösung mit einer Rate von 50 nL pro Minute für eine Gesamtinfusionszeit von 4 Minuten.
  2. Füllen Sie zwei 10 μL Hamilton-Spritzen mit sterilem destilliertem Wasser, führen Sie ein Stück sterilen Teflonschlauch in den Schlauchanschluss jedes Mikroinjektors ein, um sicherzustellen, dass die Länge des Schlauchs die Bewegung der Ratte nicht einschränkt (Schläuche können mit Ethylenoxid sterilisiert werden).
  3. Legen Sie ein Pad, das mit der inaktivierenden Substanz getränkt ist, und ein 2 cm x 2 cm großes Quadrat Paraffinfilm darüber. Pipetten Sie eine ausreichende Menge TTX, um die Nadel des Injektors und 1 cm des Schlauchs über der Folie zu füllen. Absorbieren Sie den TTX-Tropfen, indem Sie den Kolben vorsichtig einfahren. Montieren Sie die Spritzen in der Mikroinjektionspumpe und verwenden Sie ihre Steuerung, um den Kolben zu manipulieren, bis ein Tropfen TTX an der Spitze jedes Mikroinjektors zu sehen ist. Entsorgen Sie die Tropfen in das mit inaktivierender Substanz getränkte Pad.
  4. Wählen Sie die Ratten aus, die mikroinjektiert werden sollen. Verwenden Sie nur Ratten, die nach der Operation mindestens drei aufeinanderfolgende Zyklen zeigten. Betrachten Sie ihr Stadium des Zyklus und die Tageszeit. Sowohl die Zeit als auch das Stadium hängen von der spezifischen Hypothese ab, die Sie testen werden, für dieses Experiment 14:00 Stunden Proestrus ausgewählt, da die nervösen präovulatorischen Signale, die die phasische GnRH-Sekretion steuern, in diesem Moment auftreten. Transportieren Sie sie in den Raum, in dem die Injektion in ihren eigenen Gehäusekäfigen stattfindet, um Stress zu vermeiden.
  5. Halten Sie die Ratte mit einem festen Griff, entfernen Sie die Kappe und die Obturatoren von den Kanülen, führen Sie die Mikroinjektoren in die Führungskanülen ein und bringen Sie das Tier in den Käfig zurück.
  6. Schalten Sie die Pumpe ein und warten Sie, bis die Mikroinjektion abgeschlossen ist. Beobachten Sie das Tier während dieser Zeit, um eine mögliche Ablösung der Mikroinjektoren zu erkennen und das Verdrehen der Teflonröhren zu vermeiden.
  7. Lassen Sie die Mikroinjektoren für zwei weitere Minuten an Ort und Stelle, um einen Rückfluss der Lösung zu vermeiden. Entfernen Sie sie, reinigen Sie die Oberfläche des Implantats mit Jodpovidon antiseptischer Lösung und vermeiden Sie den Fluss in den Führungskanülen. Setzen Sie sterile Obturatoren ein, setzen Sie die Kappe auf und bringen Sie das Tier in den Kolonieraum zurück. Beobachten Sie das Tier regelmäßig, um mögliche Nebenwirkungen des Arzneimittels zu erkennen.
  8. Schalten Sie die Pumpe mit den gleichen Parametern wie bei der Mikroinjektion ein und überprüfen Sie, ob ein korrekter Durchfluss vorn ist, um sicherzustellen, dass die Durchgängigkeit des Systems während des Verfahrens erhalten bleibt.
  9. Drücken Sie den Kolben, um den TTX/das Fahrzeug aus dem Mikroinjektor auszustoßen, bis die Luftblase die Nadelspitze erreicht. Erinnern Sie sich an den TTX in seinem Mikroröhrchen. Füllen Sie die Spritze mit destilliertem Wasser und reinigen Sie damit das Innere der Röhrchen. Entsorgen Sie das Wasser in der inaktivierenden Substanz und wiederholen Sie diesen Vorgang mindestens dreimal. Reinigen Sie die Außenseite von Spritzen, Röhrchen und Mikroinjektoren mit einem Tuch, das mit der inaktivierenden Substanz getränkt ist.

8. Euthanasie und Gewebeverarbeitung

  1. Am Tag des vorhergesagten oder vaginal bestätigten Östrus injizieren Sie der Ratte eine intraperitoneale Überdosis Natriumpentobarbital (75 mg/ kg). Überprüfen Sie auf Bewusstlosigkeit und injizieren Sie 200 nL einer 0,5% igen Methylenblaulösung durch die Leitkanülen, wie in den Schritten 7.1 bis 7.9 beschrieben. Überprüfen Sie die Ratte mit dem Zehen- oder Schwanzquetschtest auf Schmerzzeichen und enthaupten Sie die Ratte mit einer Nagetierguillotine, wenn keine entdeckt werden.
  2. Verwenden Sie eine Schere, um die Bauchhöhle zu öffnen und die Eierstöcke zu finden. Verwenden Sie eine feine Irisschere, um jeden Eierstock zu sezieren, und schneiden Sie mit Hilfe einer Lupe an der utero-tubealen Verbindung. Vermeiden Sie es, den Eileiter zu beschädigen, da dies zum Verlust von Eizellen führt.
  3. Legen Sie die Eierstöcke unter ein Stereomikroskop und verwenden Sie eine Rasierklinge, um das gesamte Fettgewebe zu entfernen, ohne das Organ zu beschädigen. Entfernen Sie den Eileiter von jedem Eierstock, indem Sie mit der Rasierklinge so weit wie möglich aus der Ampullenregion schneiden. Montieren Sie jeden Eileiter auf einer anderen Rutsche und bedecken Sie sie mit einem Tropfen Wasser. Lagern Sie die Eierstöcke in einer Durchstechflasche mit Bouins Lösung.
  4. Trocknen Sie die Eileiter vorsichtig mit einem saugfähigen Papiertuch ab und suchen Sie unter dem Stereomikroskop nach der Ampulle. Halten Sie mit der nicht dominanten Hand den Eileiter an Ort und Stelle, indem Sie mit einer 23-G-Nadel weit von der Ampulle entfernt kneifen, und verwenden Sie dann eine weitere 23 G-Nadel in der dominanten Hand, um einen 1-mm-Schnitt im mittleren Bereich der Ampulle zu machen. Die Kumulus-Eizell-Komplexe ragen als Tropfen viskoser Flüssigkeit aus dem Schnitt heraus (Abbildung 2D). Verwenden Sie die Nadel in der dominanten Hand, um den Tropfen sanft und langsam weit vom Eileiter zu ziehen. Drücken Sie den Rest der Ampulle, um sicherzustellen, dass keine Eizellen im Inneren verbleiben. Extrahieren Sie die Eizellen so schnell wie möglich aus den Eileitern, da die Austrocknung des Eileiters die Eizellen im Inneren irreversibel einfängt.
  5. Entfernen Sie den Eileiter vom Objektträger und warten Sie, bis der Flüssigkeitstropfen, der die Eizellen enthält, trocknet. Färben Sie die Probe mit Hämatoxylin-Eosin. Verwenden Sie das Montagemedium zum Abdecken. Beobachten Sie unter dem Mikroskop (10x), um die Anzahl der Eizellen zu bestimmen, die von jedem Eierstock abgeworfen werden.
    HINWEIS: Opfer durch Herzperfusion werden in diesem Protokoll nicht durchgeführt, da die Eizellen in den Eileitern eingeschlossen wären und daher histologische Methoden zur Beurteilung des Eisprungs erforderlich wären. Wenn der Benutzer durchlässig sein muss, um andere Gewebe zu analysieren, können zuerst die Eierstöcke entfernt und die absteigenden Arterien mit dicken Hämostaten unter der Leber eingeklemmt werden, um das Austreten von Fixiermitteln zu vermeiden.
  6. Entfernen Sie die Haut des Kopfes und tauchen Sie den Schädel in einen Glasbehälter mit einer 10% igen Formalinlösung. Lassen Sie die Fixierung des Kopfes für mindestens zehn Tage vor dem Entfernen der Kanüle zu, um eine Verzerrung des Gewebes zu vermeiden. Um die Kanüle zu entfernen, verwenden Sie eine Schere, um alle Muskeln in der Region des Schädels, die sie umgibt, zu lösen. Schneiden Sie zwischen den Nasen- und Frontalknochen mit Knochentrimmern und entfernen Sie dann den Okzipitalknochen. Setzen Sie die Spitze der Trimmer in das Foramen magnum ein und schneiden Sie durch die sagittalen Kämme, die den Rest des Nasenbeins erreichen.
  7. Die isolierte Region der Schädelspitze muss die Frontal- und Parietalknochen enthalten. Entfernen Sie die implantierte Kanüle, die an der Oberseite des Schädels befestigt ist, indem Sie sie langsam senkrecht zum Kopf nach oben ziehen. Schneiden Sie jeden angebrachten Teil der Hirnhäute mit einer feinen Irisschere ab, um eine Verformung des Gehirns zu vermeiden.
  8. Machen Sie einen vorderen-hinteren Schnitt an den Hirnhäuten und legen Sie sie beiseite, um das Gehirn von der Schädelbasis zu entfernen. Setzen Sie eine stumpfe Pinzette unter die Riechkolben ein und ziehen Sie das Gehirn vorsichtig nach oben, bis die Sehnerven sichtbar sind. Schneiden Sie die Nerven mit einer feinen Irisschere ab und ziehen Sie das Gehirn heraus. Bewahren Sie das Gehirn in fixierender Lösung.
  9. Erhalten Sie 50 μm dicke Abschnitte des Gehirns mit einem Vibratom, montieren Sie sie in poly-L-Lysin-beschichteten Objektträgern (0,1% in destilliertem Wasser) und färben Sie sie mit der Nissl-Technik. Beobachten Sie die Objektträger unter dem Mikroskop (10x), um die Endposition der Kanülen (Abbildung 2A-2C) und die Ausbreitung des Farbstoffs mit Hilfe eines Rattenhirnatlas27zu bestimmen.

Ergebnisse

Das oben beschriebene Protokoll wurde getestet, indem die Wirkungen eines einzelnen TTX oder Vehikels (künstliche Zerebrospinalflüssigkeit; ACSF) Mikroinjektion in einen von zwei verschiedenen Kernen, von denen bekannt ist, dass sie an der Regulation des Eisprungs bei der Ratte beteiligt sind: dem suprachiasmatischen und dem arkuaten Kern. Der suprachiasmatische Kern wurde gewählt, da er den zentralen circadianen Herzschrittmacher bei Säugetieren enthält. Es ist an der Regulierung zyklischer Ereignisse als Sekretion...

Diskussion

Dieser Artikel beschreibt eine Methode, um eine diskrete Region im Gehirn von wachen und hemmungslosen Ratten zu einem bestimmten Zeitpunkt vorübergehend zu inaktivieren. Eine einfache Methode, um ihren Östrogenzyklus zu verfolgen und den Eisprung zu beurteilen, wird ebenfalls angeboten. Dieses Protokoll ermöglicht eine einfache Analyse des Beitrags bestimmter Gehirnregionen zu den Mechanismen, die den Eisprung antreiben, indem das Eisprungergebnis von TTX-behandelten Tieren mit dem von fahrzeugbehandelten Tieren verg...

Offenlegungen

Die Autoren haben in Bezug auf diesen Artikel nichts zu verraten.

Danksagungen

Wir danken Raymond Sanchez von der University of Washington für seine wertvolle Hilfe bei der Manuskriptbearbeitung und M.Sc. Georgina Cortés und M.Sc. Cintia Javier für ihre technische Unterstützung bei der Standardisierung dieser Technik. Wir danken auch den Mitgliedern der Veterinärdienste der Facultad de Estudios Superiores Zaragoza: MVZ. Adriana Altamirano, MVZ. Roman Hernández und MVZ. Dolores-Elizabeth Guzmán für die hervorragende Pflege und Pflege von Versuchstieren. Die in diesem Protokoll beschriebenen Experimente wurden durch die DGAPA-PAPIIT-Zuschussnummer: IN216015 und durch die CONACyT-Zuschussnummer: 236908 an Roberto Domínguez unterstützt. Carlos-Camilo Silva ist Doktorand der Programa de Doctorado en Ciencias Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM) und wird vom Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (Förderkennzeichen: 294555) unterstützt.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
10 μL Hamilton syringesHamilton80314
21 G x 1" stainless steel hypdermic needleBD305165
23 G x 1" stainless steel hypdermic needleBD305145
30 G x 1/2" stainless steel hypdermic needleBD305106
Artificial cerebrospinal fluidBASiMD-2400
Bone trimerFine Science Tools16152-12
Burr for micro drillFine Science Tools19007-05
ClipperWahl
Cut-off discDremelSM5010
Cutting tweezersTruper17367
Cyanocrylate glueKola lokaK-1
Dental cementNic Tone
EnrofloxasinSenosiain
EosinSigmaE4009
EstereoscopeZeiss
Extra fine Bonn scissorsFine Science Tools14084-08
Face maskLanceta HG60036
Graefe ForcepsFine Science Tools11050-10
HematoxilinSigmaH3136
HemostatsFine Science Tools13008-12
Hot bead sterilizerFine Science Tools18000-45
Hydrochloric acidSigma320331
Hypromelose artificial tearsSophia Labs8950015
IsofluranePisa Agropecuaria
MeloxicamAranda1183
Microinjection pumpKD Scientific788380
MonomerNic Tone
MototoolDremel3000
Nitrile glovesLanceta HG69028
Non-Rupture Ear BarsDavid Kopf Instruments855
Poly-L lysineSigmaP4707
Povidone-iodineDermo Dine
Povidone-iodine with soapGermisin espuma
Pressure tweezersTruper17371
Rat anesthesia maskDavid Kopf InstrumentsModel 906
Saline solutionPISA
ScalpelFine Science Tools10004-13
Scalpel bladeFine Science Tools10015-00
Sodium pentobarbitalPisa Agropecuaria
Standard electrode holderDavid Kopf Instruments1770
Stainless steel wireAmerican Orthodontic856-612
Stereotaxic apparatusDavid Kopf InstrumentsModel 900LS
Surgical SissorsFine Science Tools14001-12
Teflon connectorsBasiMD-1510
Teflon tubingBasiMF-5164
TetrodotoxinAlomone labsT-500
VaporizerKent scientificVetFlo

Referenzen

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