JoVE Logo
저자
연락처

로그인

JoVE 비디오를 활용하시려면 도서관을 통한 기관 구독이 필요합니다. 전체 비디오를 보시려면 로그인하거나 무료 트라이얼을 시작하세요.

기사 소개

  • 요약
  • 초록
  • 서문
  • 프로토콜
  • 결과
  • 토론
  • 공개
  • 감사의 말
  • 자료
  • 참고문헌
  • 재인쇄 및 허가

요약

이 프로토콜은 저비용 미세 주입 시스템의 건설, 깊은 뇌 구조로의 입체 이식 및 깨어 있고 억제되지 않은 쥐에서 테트로독신의 시간 제한 된 미세 주입 절차를 설명합니다. 목표는 그들의 신경 활동을 억제 하 여 배란의 규칙에 시상 하 체 구조의 참여를 공개 하는 것입니다.

초록

많은 실험적인 접근은 배란의 규칙에 있는 두뇌의 역할을 공부하기 위해 이용되었습니다. 예를 들면 영구적으로 표적 영역의 무결성을 손상시키는 침략적인 방법인 신경 단의 병변 그리고 청각 장애를 포함합니다. 이러한 방법은 급성 및 측두성 규제 메커니즘의 분석에 영향을 줄 수 있는 부수적인 효과를 수반합니다. 특정 뇌 영역을 겨냥한 가이드 카누라의 입체 이식은 회복 기간이 뒤따르며, 연구자들은 수술의 원치 않는 효과가 사라진 후 다른 약물을 마이크로주입할 수 있게 합니다. Tetrodotoxin은 과도하게 나트륨 의존적인 행동 잠재력을 억제하기 때문에 다양한 생리 적 과정에 있는 몇몇 두뇌 영역의 역할을 결정하기 위하여 이용되었습니다, 따라서 표적 지구에 있는 모든 신경 활동을 차단하. 이 프로토콜은 에스트라스트 주기및 배란의 평가를 위한 전략과 이 방법을 결합하여 에스트라스트라스 사이클의 특정 단계에서 배란의 특정 시간에 배란의 조절에 있는 이산 뇌 영역의 역할을 드러냅니다. 깨어 있고 억제되지 않은 쥐(Rattus norvegicus)는마취제와 스트레스 호르몬이 배란에 미치는 차단 효과를 피하기 위해 사용되었습니다. 이 프로토콜은 다른 종, 뇌 표적 및 약리학 제에 쉽게 적응하여 다른 생리 적 과정을 연구 할 수 있습니다. 이 방법의 향후 개선사항은 가이드 캐뉼라 대신 작은 직경의 유리 모세 혈관을 사용하여 미세 주입 시스템의 설계를 포함한다. 이것은 이식 도중 손상된 조직의 양을 감소시키고 표적 지역 외부에 주입된 약의 퍼짐을 감소시다.

서문

배란은 하나 이상의 성숙한 난모세포가 모든 estral/생리 주기마다 난소에서 방출되는 과정입니다. 모든 포유류 종은 번식하는 gametes의 생산에 의존하기 때문에 배란을 조절하는 메커니즘에 대한 이해는 생물 의학, 가축 산업 및 멸종 위기에 처한 종의 유지 에 이르기까지 지역에 큰 영향을 미칩니다. 배란은 시상 하 부-뇌 하 수 체-난소 축에 의해 조절, 여러 시상 하 부 및 여분의 시상 소 방 영역을 포함 하는, 전방 뇌 하 수 체및 과립 세포에 염소 로프, 난소 와 함께, 난소 여포를 형성1.

난소 여포성장, 개발 및 결국 모낭 자극 호르몬과 황 체 호르몬의 강장제 및 단계적 분비에 대 한 응답으로 배란, 염소 트로핀에 의해 분 비. 생식선 분비의 패턴은 적절한 여포 발달 및 배란에 중추적인 이며 생식샘도트로핀 방출 호르몬 (GnRH)1,2에의해 조절된다. 이 신경 펩티드는 기저 부신론 전체에 흩어져 뉴런에 의해 합성 된 다음 시상 하부와 전방 뇌하수체를 연결하는 포털 혈관으로 분비됩니다. GnRH-뉴런의 분비 활동은 다양한 뇌 구조에서 발생하는 시냅스 입력에 의해 차례로 변조됩니다. 이러한 구조는 식품의 가용성, 광기간의 길이 및 혈액 내 호르몬의 농도를 포함하는 유기체의 외부 및 내부 환경상태에 대한 정보를 전달한다. 이러한 의미에서, 그(것)들은 각 종의 생식 패턴을 형성하고 그 같은 구조물의 특정 역할은 배란을 지배하는 기계장치를 제대로 이해하기 위하여 결정되어야 합니다. 예를 들어, 에스트라스트사이클 동안 에스트라디올 수준의 변동이 GnRH의 분비를 조절하는 것으로 나타났습니다. 그러나, GnRH-뉴런은 이러한 변화를 검출하는 데 필요한 에스트라디올 수용체 동소형을 발현하지 않는다. 이 수용체를 표현하는 뉴런의 2개의 인구는 제 3 심실의 장영 동맥 영역과 아크추아테 핵에 각각, 그리고 GnRH-뉴런을 가진 stablish 시냅스에 있습니다. 이러한 뉴런이 estradiol의 농도를 해석한 다음 GnRH 분비3의 강력한 인덕터인 키스펩틴을 방출하여 GnRH-뉴런의 활동을 자극한다는 증거가있다.

인체 공학 적 또는 화학 병변뿐만 아니라 기계적 청각 장애인을 포함하는 실험은연구자가 배란4,5,6,7,8,9,10,11,12의 조절에 여러 뇌 구조의 참여를 결정할수있었습니다. . 그러나 이러한 실험은 치료의 효과를 평가하기 전에 며칠간의 회복을 요구하여 치료의 급성 효과 분석을 방해하는 침습적이고 외상적인 단점이 있습니다. 추가적으로, 그(것)들은 영구적으로 표적으로 한 지역에 영향을 미치고 장기적으로 그밖 생리적인 프로세스를 중단합니다. 이러한 문제로 인해, 이러한 실험의 결과는 일반적으로 동물의 신체의 정근성 보상 메커니즘에 의해 가려지고 해당 영역이 관련된 시간적 조절 역학에 대한 정확한 정보를 추출하는 것은 다소 어렵습니다.

가이드 캐뉼라를 통해 뉴런의 활동을 일시적으로 방해하는 약물의 미세 분사는 위에서 언급한 단점을 능가하는 적합한 대안입니다. 캐뉼라는 스테레오탁스 수술로 뇌 부위에 배치될 수 있으며, 수술의 혼란스러운 효과가 사라진 후 연구자가 약물 치료를 시작할 수 있게 합니다. 약물의 시간 제한 된 미세 주입 은 연구원이 과정의 특정 단계에 지역의 기여에 관한 가설을 테스트 할 수 있으며 깨어 억제 또는 자유로운 이동 동물에서 수행 할 수 있습니다. 국소 마취제, 작용제, 길항제, 역 작용제 및 테트로도톡신(TTX)과 같은 생물학적 독소를 포함한 다양한 약물은 특정 시간에 관심 영역으로 마이크로 주입될 수 있다.

TTX는 복어의 몸에 사는 박테리아뿐만 아니라 다른 척추동물및 무척추동물에 의해 합성된 생물학적 독소입니다. TTX는 나트륨 채널의 선택적이고 일시적인 봉쇄를 통해 신경 활동을 침묵시키고, 이로 인해 나트륨 의존적 작용 잠재력이 억제됩니다. TTX의 존재에서, 세포는 탈극화 단계에서 변경을 경험하고 따라서 흥분하지 않고 살아 남아 있다. TTX의 차단 효과는 분자 조성에 의해 설명된다 : guanidinium 그룹은 나트륨 채널의 세포 외 측면을 통과 할 수 있지만, 분자의 나머지 는 크기로 인해 통과 할 수 없습니다, 그래서 붙어 채널13,14,15,16,17 . TTX의 작용 메커니즘은 체외와 생체 내 신경계를 연구하는 도구로 사용할 수 있었습니다. 이 독소의 인트레이스테렐 주사는 메모리 보존18,수면 및 각성19,장소 인식20,공간 탐색21,약물 남용22,온도 조절23,정신 분열증24의개발, 성적 행동25 및 배란26의 조절과 같은 여러 과정에서 이산 뇌 영역의 역할을 연구하는 데 사용되었습니다. 다른 사람의 사이에서. 이 프로토콜에서 우리는 깨어 있고 억제되지 않은 쥐에 TTX 미세 주입에 의한 시상 하 핵의 일시적인 불활성화의 배란에 미치는 영향을 설명합니다.

프로토콜

동물 관련 절차는 UNAM, 학부 드 Estudios 수페리어 사라고사의 윤리위원회에 의해 승인되었다. 이 기관은 동물 취급에 대한 멕시코 규칙에 따라 엄격하게 운영, 공식 규범: NOM-062-ZOO-1999, 이는 국제 지침에 동의.

1. 양자 간 캐뉼라 건설

  1. 압력 핀셋을 사용하여 23G 피하 바늘 2개의 허브에서 스테인레스 스틸 샤프트를 추출한 다음 메스 블레이드를 사용하여 남은 접착제를 제거합니다.
  2. 미세한 영구 마커로 샤프트의 무딘 끝과 는 15mm 떨어져 선을 그립니다. 절단 핀셋을 사용하여 경부 된 끝을 제거합니다.
  3. 15mm 세그먼트를 미세한 hemostats로 잡고 14mm 세그먼트의 튜브를 얻을 때까지 회전 공구에 연결된 컷오프 디스크로 수직으로 누릅니다. 이 단계는 샤프트의 폐색 부분을 제거하여 개방적이고 무딘 끝을 만들기 위해 수행됩니다. 마지막으로 세그먼트를 통해 30 G 바늘을 삽입하여 내부 방해를 제거합니다.
  4. 뇌아틀라스(27)의도움으로 뇌의 좌우 반구에 대한 관심 구조 사이의 거리를 결정한다. 미끄럼틀 점토를 사용하여 두 개의 14mm 세그먼트를 현미경 슬라이드에 부착하고 둘 다 동일한 수평 수준에 있는지 확인합니다. 안구 마이크로미터(10x)를 통해 관찰하고 원하는 거리가 얻어지도록 미세핀셋으로 세그먼트를 조정합니다.
  5. 솔더 페이스트를 10% 염산과 혼합하여 2:1 비율로 혼합하고 세그먼트의 무딘 끝 아래에 2mm의 혼합물을 추가합니다. 납땜 철과 0.5mm 직경 솔더 와이어를 사용하여 단일 포인트로 두 세그먼트를 솔더. 솔더가 세그먼트의 루멘을 방해하지 않도록 합니다.
  6. 탄력있는 0.3mm 스테인레스 스틸 와이어의 10mm 세그먼트를 절단하여 입체 홀더에 캐뉼라를 부착하는 지원을 만듭니다. 납땜 점과 접촉 와이어의 2mm를 배치하고 나머지는 캐뉼라의 무딘 끝 위에 누워 있는 납땜 점토를 사용합니다. 카누라에 와이어를 납땜.
  7. 납땜 페이스트를 초과하여 제거하기 위해 70% 에탄올로 캐뉼라의 표면을 청소합니다. 캔누라의 내부를 멸균물로 씻어 금속 입자를 제거합니다. 10배배율로 현미경으로 입자를 검출할 수 없을 때까지 이 과정을 반복한다.

2. 강수기 및 모자 의 건설

  1. 포튜레이터를 제작하기 위해 둥근 스테인리스 스틸 소프트 와이어(직경 0.35mm)의 2개의 16mm 세그먼트를 절단합니다. 간편 캐뉼라를 실험실 벤치에 수직으로 잡고 벤치에 닿을 때까지 각 캐뉼라에 이러한 세그먼트 중 하나를 삽입합니다. 남은 잔해를 90° 각도로 구부립니다.
  2. 캡의 경우 실리콘 튜브의 2mm 세그먼트(내부 직경=0.76mm)를 잘라내고 각 세그먼트의 끝 중 하나에 실리콘 접착제 한 방울을 적용합니다. 접착제가 튜브에 들어가지 못하게 하십시오. 적어도 24 시간 동안 건조하십시오.

3. 마이크로 인젝터 의 건설

  1. 30G 피하 바늘을 사용하여 샤프트를 만드는 단계 1.1을 반복하십시오.
  2. 샤프트의 무딘 끝과 는 별개로 18.5mm 선을 그리고 절단 핀셋으로 베벨 끝의 잔재를 제거합니다.
  3. 1.1을 23G 바늘로 반복하여 무딘 끝에서 시작하여 6mm 길이의 두 개의 세그먼트를 절단하여 어댑터를 구축합니다.
  4. 4mm 어댑터 2개를 얻을 때까지 컷오프 디스크에 수직으로 눌러 6mm 세그먼트의 폐색 부분을 제거합니다. 내부 장애물을 제거합니다.
  5. 30G 세그먼트의 베브레드 끝을 어댑터에 삽입합니다. 스테레오현미경을 통해 세그먼트와 어댑터의 끝이 동일한 수준에 있는지 확인합니다. 면봉을 사용하여 말단 관절에 시아노아크라일트 접착제를 바르고 15 분 동안 건조하십시오.
  6. 테플론 튜빙 커넥터 2개를 70% 에탄올에 5분간 담근 다음 어댑터를 통해 마이크로인젝터에 부착합니다. 커넥터의 직경이 적어도 24시간 동안 줄어들 때까지 기다린 다음 커넥터의 손상을 피하기 위해 저온 방법으로 마이크로인젝터를 살균합니다(에틸렌 산화물 살균이 권장됩니다).

4. 동물 유지 보수 및 질 얼룩

  1. 230~260그램의 무게의 순환성 성인 여성 후드쥐(라투스 노르베기쿠스,CIIZ-V 균주)를 사용하십시오. 14:10 광-어두운 포토기간이 있는 방에 표준 폴리프로필렌 케이지에 4마리의 그룹으로 쥐를 보관하십시오. 온도와 습도를 각각 22 ± 2°C와 40%로 설정합니다. 음식과 물 광고 리비툼을제공합니다.
  2. 매일 10:00~12:00h 사이에 질 얼룩을 섭취하십시오.
    1. 알코올 램프를 사용하여 내지름 1mm로 수정 된 세균 루프를 살균하고 멸균 물로 식힙니다. 쥐를 안전한 그립으로 잡고 5mm의 세균 성 루프를 질에 도입하여 내부 벽을 만지습니다. 세균 루프를 제거합니다. 성공하면 끝에 흐린 방울이 보입니다. 현미경 슬라이드에이 드롭을 놓습니다.
    2. 각 쥐를 살균하고 각 동물 사이의 루프를 냉각에 대해이 과정을 반복합니다.
    3. 방울이 건조 한 후, 헤마톡시린 -eosin로 얼룩과 10 x에서 현미경으로 샘플을 관찰.
    4. 백혈구, 상피 핵 세포 및 각질화된 세포의 비율을 각 도면에 결정하고 이전문헌(28,29)에동의하는 도 1에보고된 에스트라스트 사이클 단계의 기준에 따라 분류한다.

5. 칸누라의 스테레오탁스 이식

참고 : 정기적 인 무균 스테레오 탁스 수술 및 제도적 규범준수에 따라 캐뉼러의 이식을 수행하십시오.

  1. 수술 전
    1. 외과 기기, 캐뉼라, 수술 나사, 강수기, 거즈 및 나무 면 봉면 면봉 24 h증기 autoclave를 사용하여 수술 전에 살균하십시오. 10%의 과산화수소로 세척한 다음 물을 세척한 다음 뜨거운 비드 멸균기에 넣은 다음 연속 수술 사이에 금속 기기의 팁을 살균합니다.
    2. 집에서 동물을 제거하기 전에 작업 영역과 스테레오 탁스 악기를 준비합니다. 수술 중 오염을 피하기 위해 수술 테이블에서 가능한 한 멀리 위치한 지역에서 수술을 위해 동물을 준비하십시오.
    3. 준비 및 수술 부위를 70%에탄올로 청소한 다음 10% 염화물 용액을 10분 동안 적용합니다. 스테레오탁틱 기기의 기본, 프레임 및 조작기를 70% 에탄올로 청소하고 수술 전에 뜨거운 비드 소독기를 사용하여 이어바의 팁을 소독합니다.
    4. 전용 실험실 코트, 얼굴 마스크, 머리 보닛, 수술 소매, 신발 커버 및 수술 장갑을 착용하고 수술을 수행합니다. 보조에게 수술을 위해 동물을 준비하고 시술 중에 일반 상태를 확인하도록 요청하십시오.
    5. 입체 홀더에 캐뉼라를 부착합니다. 조수에게 첫 번째 동물을 방으로 데려오라고 요청하십시오. 우리의 실험실에서 관찰이 동물이 다른 단계에서 작동 쥐보다 더 빨리 적절한 강도 주기를 복구 하는 것을 나타내기 때문에 수술에 대 한 diestrus에서 쥐를 선택, 아마 에스트라스 주기와 함께 스트레스 변화에 대 한 응답 때문에.
    6. 동물의 무게를 측정하고, 이소플루란 기화기에 연결된 쥐를 위한 유도 챔버 내부의 100% 산소에서 4% 이소플루란으로 마취를 유도한다. 동물을 스트레스를 피하려면 챔버를 미리 채우지 마십시오. 오른쪽 반사의 손실을 관찰 한 후 꼬리와 귀 핀치 테스트에 의해 측정 된 동공 팽창 및 통증의 손실을 확인하여 마취의 수술 평면을 확인합니다.
      1. 이소플루란 기화기를 사용할 수없는 경우 케타민 (100 mg /kg) 및 자일라진 (10 mg / kg)의 혼합물의 내회음 주입에 의해 쥐를 마취한다.
    7. 유도 챔버에서 쥐를 제거하고 준비 테이블에 코 콘을 사용하여 100 % 산소에서 2.5 %의 이소플루란으로 마취의 효과를 유지합니다. 두피의 머리카락을 클리퍼로 다듬고 보풀 롤러로 느슨한 머리카락을 제거합니다. 멜록시캄 2 mg/kg의 수술 전 피하 복용량을 주입 하 고 5 mg/kg Enrofloxacin의 비 스테로이드 성 항 염증/진통제 및 항생제로, 각각.
      1. 수술 중 탈수를 피하기 위해 각 눈에 hypromellose 인공 눈물을 적용하십시오.
    8. 비 파열 이어 바와 마취 마스크를 사용하여 온난화 패드 위에 스테레오 탁스 도구에 동물을 마운트합니다. 코 클램프를 조정하여 동물의 머리가 평평하도록 합니다. 면도 부위에 비누를 곁들인 포비단 요오드와 70% 에탄올을 한 번 번 수행한 다음 포비본 요오드와 70% 에탄올을 두 번 사용합니다. 직장 온도계를 삽입하여 시술 중에 동물의 온도를 기록한 다음 멸균 수술장으로 덮습니다.
  2. 수술 중
    1. 메스를 사용하여 면도 부위 중간에 피부와 근육에 2cm 절개를 합니다. 과산화수소 2%로 코팅된 면봉을 사용하여 두개골에서 골라온을 제거하여 대상 좌표를 계산하는 데 사용될 랜드마크인 브레그마 또는 람다를 드러냅니다. 랜드마크의 더 나은 시각화를 위해 공기로 두개골을 건조시하십시오.
    2. 입체 악기의 조작기를 사용하여 캐뉼라를 선택한 랜드마크 바로 위에 있는 위치로 이동합니다. 스테레오탁스 기기에서 전방 후방 및 내측 측좌를 등록하고 이를 사용하여 뇌아틀라스(27)에따라 대상 영역의 좌표를 계산한다.
    3. 계산된 좌표를 스테레오탁악기에 넣고 두개골 표면에 캐뉼라 끝을 놓습니다. 등복부 좌표를 등록하고 이를 사용하여 대상 영역에 대한 깊이를 계산합니다.
    4. 프레임에서 나사를 풀면 조작기의 팔을 제거합니다. 15,000 rpm의 속도로 회전 공구에 부착 된 치과 버를 사용하여 두개골 절제술이 수행되는 장소에서 마크를 만듭니다. 그런 다음 버를 사용하여 세 개의 구멍을 만들어 마크 주위에 동등한 삼각형을 형성합니다. 이 구멍은 두개골을 관통해서는 안됩니다. 수술 나사를 구멍에 삽입하여 단단히 배치되도록 합니다.
    5. 각 반구의 대상 영역 사이의 거리를 수용할 수 있을 만큼 두개골 절제술을 충분히 넓게 만듭니다. 그것은 가능한 한 직경이 작아야하지만 두개골의 테두리를 건드리지 않고 캐뉼라의 하강을 허용 할 만큼 충분히 큰해야합니다, 이 궤적을 수정하기 때문에. 가능한 가장 낮은 압력을 가하여 두개골 절제술을 점진적으로 수행합니다. 설치류 두개골은 두께가 몇 밀리미터에 불과하며 아래 조직의 무결성을 유지하는 데 중추적인 역할을 합니다.
    6. 두라 마터가 보이면 90° 각도로 구부러진 팁이 있는 멸균 21 G 바늘을 사용하여 뼈의 파편을 제거하고 수막에서 전방 후방절단을 합니다. Wirtshafter 및동료(30) 기술을 사용하여 대상 영역이 중간선 에 가까운 경우 우수한 처상 부비동에 손상을 피하십시오.
      1. 홀더를 프레임에 캐뉼라로 놓고 등복부 조작기를 사용하여 복부 좌표에 도달합니다. 바늘이 내림차순동안 테두리를 만지지 않는지 확인하고 필요한 경우 두개골 절제술의 직경을 증가시면 됩니다.
        참고: 가이드 카누아의 팁은 관심 지역보다 0.5~2.0mm 에 이르는 지역을 대상으로 하는 것이 중요합니다. 이것은 이물질의 도입과 조직의 파괴에 대한 응답으로 뇌의 염증 반응 때문입니다. 이는 관심 영역이 작고 작업 거리를 사전에 경험적으로 계산해야 하는 경우 특히 중요합니다.
    7. 두개골에 캐뉼라를 부착하고 건조하게 치과 시멘트를 적용합니다. 치과 시멘트가 돌이킬 수 없는 방해가 되기 때문에 캐뉼라의 무딘 끝을 덮지 않도록 하십시오. 시멘트가 완전히 고화될 때까지 기다립니다.
    8. 추가 장애물을 방지하고 연구 기간 동안 육아를 보장하기 위해 강수기를 삽입합니다. 오염을 방지하기 위해 실리콘 캡을 착용하십시오.
  3. 수술 후
    1. 생리온도에서 멸균식염용액 1.0mL의 복막 주사로 손실된 유체를 교체한다. 동물을 마취에서 회복할 때까지 열 지지장치로 복구 케이지에 놓습니다. 동물의 온도와 난로/호흡 속도를 주기적으로 확인합니다. 이소플루란 효과는 가스 플럭스를 중단한 후 몇 분 동안 지속되며 케타민/자일라진 효과는 40-50분 동안 지속됩니다.
    2. 항생제의 수술 후 주사를 제공, 진통제 및 항 염증 약물 (전에 언급 된 동일한 복용량및 경로에서) 48-72 h에 대 한 하 고 밀접 하 게 실험의 나머지 부분에 대 한 매일 동물을 검사. 수의사 서비스 또는 실험실의 숙련된 회원에게 통증, 스트레스 또는 체중 감소의 징후를 보고합니다. 이 기간 동안 쥐에 대한 다른 조작을 수행하지 마십시오.
    3. 수술 후 치료 후 질 얼룩을 복용 시작하고 동물이 4 일의 3 연속 에스트라스트 주기를 보여 때까지 그것을 계속.
      참고: 만성 경정맥 카테터는 외과적으로 이식될 수 있으며, 연구원이 에스트라디올, 프로게스테론, 테스토스테론, 호르몬, 황체 자극 호르몬, 여포 자극 호르몬 및 코티코스테론과 같은 호르몬의 분비를 분석하기 위해 연쇄 혈액 샘플을 채취할 수 있습니다. 우리는 동물이 뇌 수술에서 회복되면 카테터를 배치하는 것이 좋습니다, 이것은 또한 연장 된 회복 시간에서 발생할 수있는 카테터의 막힘을 피하는 동안 생존율을 향상시킬 수 있기 때문에.

6. 테트로도독신 처리 및 솔루션 준비

주의: TTX는 알려진 가장 독성 물질 중 하나입니다. 그것은 골격 근육과 신경 조직에 작용. 접촉에 의한 중독은 가능성은 없지만 어떤 열린 상처는 신체에 접종을위한 잠재적 인 경로입니다. TTX와 함께 작업 할 때 주요 관심사는 독소와 접촉한 날카로운 악기와 입, 눈 및 점막에 도달 할 수있는 에어로졸의 생성과 피부의 펑크입니다. 용량에 따라, TTX 흡입 하는 경우 치명적일 수 있습니다., 삼킨 또는 피부에 의해 접종. 그것은 눈의 강한 자극을 일으킬 것입니다. LD50은 구강 및 정맥 투여에 의해 마우스에서 테스트되었으며 각각 334 μg/kg 및 7.3 μg/kg입니다. 현재 항독소는 없습니다.

참고: 비활성화 물질은 0.25 N NaOH 또는 10% 표백제 용액의 유무에 관계없이 1.0% NaOCl입니다. 완전한 불활성화는 30분 노출 후에 발생합니다. TTX는 오토클레이빙또는 500°F 이하의 온도에서 건조 열 살균에 의해 10% 이하의 농도로 파생된 모든 염화물에 의해 완전히 비활성화될 수 없습니다. TTX와 관련된 모든 절차는 니틀 장갑, 전용 실험실 코트, 안전 안경, 일회용 얼굴 마스크, 폐쇄 신발 및 전체 길이 바지의 내부 및 외부 쌍을 착용 하는 두 지식이 있는 개인에 의해 수행 되어야 합니다.

  1. 주식 솔루션의 준비
    1. 유출 시 오염을 방지하기 위해 연기 후드에 비활성화 물질에 담근 패드를 놓습니다. 연기 후드가 시작하기 전에 제대로 작동하는지 확인하십시오. 파이펫 팁을 폐기하기 위해 비활성화 된 솔루션으로 리셉터클을 준비하십시오.
    2. 멸균 인공 뇌척수액을 사용하여 매우 신중하고 느린 적정에 의해 제조업체 지침에 따라 멸균 TTX 구연산 용액을 재중단하여 그 과정에서 유리병의 벽을 헹구십시오. 폼과 에어로졸의 형성을 피하십시오. 그것은 살아있는 동물의 두뇌에 주입 될 것이기 때문에 TTX 솔루션의 오염을 피하기 위해 무균 기술을 따르십시오. TTX 바이알에 에어로졸 형성을 방지하기 위해 외부 멤브레인이 있는 경우 마이크로파이펫 대신 바늘로 주사기를 사용하십시오.
    3. 살균 마이크로 튜브에 스톡 솔루션을 알리쿼트. 동결/해동 주기가 분자의 안정성을 변화시킬 수 있기 때문에 알리쿼트를 가능한 한 작게 만듭니다. 동결 시 물이 증가하여 튜브의 절반 이상을 채우지 마십시오.
    4. TTX가 비활성화 된 물질과 함께 사용 된 튜브와 표면의 외관을 오염 제거합니다. 이차 용기 안에 유리병 상자에 -20 °C의 튜브를 저장합니다.
  2. 재고 용액을 작업 농도로 희석
    1. 희석 된 솔루션이 덜 안정적이기 때문에 사용 될 날에 갓 희석 된 솔루션을 준비하십시오. 연기 후드에 비활성화 물질에 담근 패드와 그 위에 마이크로 튜브 랙을 놓습니다. 파이펫 팁을 폐기하기 위해 비활성화 된 솔루션으로 리셉터클을 준비하십시오.
    2. 멸균 마이크로튜브의 바닥에 스톡 용액을 피펫한 다음 10 ng/μL의 농도를 달성하기 위해 인공 뇌척수액의 계산된 양을 추가합니다. TTX 분말의 재중단에 대해 설명된 바와 같이, 매우 신중하고 느린 적정을 수행하여 바이알의 벽을 헹구고 폼과 에어로졸의 형성을 피합니다.
    3. 냉동실에 있던 시료가 미세 주입을 위해 사용될 경우, 실험 전에 적어도 한 시간 동안 실온에서 평형화할 수 있어야 합니다.

7. TTX 또는 차량 솔루션을 자유롭게 움직이는 쥐에 미세 주입

  1. 실험에 따라 주입 속도와 총 주입 시간으로 미세 주입 펌프를 구성한다. 대상 구조에 의해 점유되는 부피와 주입할 용액의 양을 고려하여 이러한 매개변수를 미리 계산합니다. 이 실험을 위해 분당 50nL의 속도로 200nL의 용액을 총 주입 시간 4분 동안 주입한다.
  2. 멸균 증류수로 10μL 해밀턴 주사기 2개를 채우고, 각 마이크로인젝터의 튜브 커넥터에 멸균 테플론 튜브 를 삽입하여 튜브 길이가 쥐의 움직임을 제한하지 않도록 합니다(에틸렌 옥사이드를 사용하여 튜브를 살균할 수 있음).
  3. 비활성화 물질에 담근 패드와 파라핀 필름의 2cm x 2cm 정사각형을 위에 놓습니다. 파이펫은 인젝터의 바늘과 필름 위의 튜브 1cm를 채우기 에 충분한 양의 TTX를 채웁니다. 플런저를 부드럽게 철회하여 TTX 드롭을 흡수합니다. 마이크로 오분 펌프에 주사기를 장착하고 각 마이크로 인젝터의 끝에서 TTX 한 방울을 볼 수있을 때까지 플런저를 조작하기 위해 컨트롤을 사용합니다. 비활성화 물질에 젖은 패드에 방울을 버리십시오.
  4. 마이크로 주입 될 쥐를 선택합니다. 수술 후 적어도 3 주기 연속 주기를 보여 쥐만 사용. 주기의 그들의 단계와 하루의 시간을 고려. 시간과 단계 는 모두 당신이 테스트 할 특정 가설에 따라 달라집니다, 이 실험에 대한 14:00 phasic GnRH 분비를 지배하는 신경 preovulatory 신호가이 순간에 발생하기 때문에 선택 된 proestrus의 시간. 주사가 자신의 주택 케이지 내부에서 일어나는 방으로 운반하여 고통을 피하십시오.
  5. 쥐를 단단한 그립으로 잡고, 캐뉼라에서 캡과 강수기를 제거하고, 가이드 캐뉼러에 마이크로인젝터를 삽입하고 동물을 케이지로 돌려놓습니다.
  6. 펌프를 켜고 미세 주입이 끝날 때까지 기다립니다. 이 기간 동안 동물을 관찰하여 마이크로인젝터의 분리 가능성을 감지하고 테플론 튜브의 비틀림을 피하십시오.
  7. 용액의 역류를 피하기 위해 2 분 동안 마이크로 인젝터를 제자리에 둡니다. 그들을 제거하고, iodopovidone 살균 용액으로 임플란트의 표면을 청소하여 가이드 캐뉼라 내부의 흐름을 피하십시오. 멸균 강수기를 삽입하고 모자를 씌워 동물을 식민지 방으로 되돌려 놓습니다. 동물의 가능한 부작용을 감지 하기 위해 주기적으로 동물을 관찰.
  8. 미세 주입 중과 동일한 매개 변수로 펌프를 켜고 올바른 흐름을 확인하여 프로시저 중에 시스템의 패혈성이 유지되었는지 확인합니다.
  9. 플런저를 눌러 기포가 바늘 끝에 도달할 때까지 TTX/차량을 마이크로인젝터에서 추방합니다. 마이크로튜브에서 TTX를 회수합니다. 증류수로 주사기를 채우고 튜브 내부를 청소하는 데 사용합니다. 비활성화 물질에 물을 버리고 적어도 세 번이 과정을 반복합니다. 주사기, 튜브 및 마이크로 인젝터의 외부를 비활성화 물질에 담근 천으로 청소하십시오.

8. 안락사 및 조직 처리

  1. 예측 또는 질확인 에스트루스의 날에, 나트륨 pentobarbital의 내과다복용으로 쥐를 주입 (75 mg/kg). 의식 상실을 확인하고 7.1~ 7.9단계에 설명된 바와 같이 가이드 카누라를 통해 0.5% 메틸렌 블루 용액의 200nL을 주입한다. 발가락 또는 꼬리 핀치 테스트를 사용하여 통증 징후를 확인하고, 아무 것도 발견되지 않으면 설치류 기요틴을 사용하여 쥐를 참수하십시오.
  2. 가위를 사용하여 복강을 열고 난소를 찾으십시오. 미세한 홍채 가위를 사용하여 각 난소를 해부하고 돋보기를 사용하여 자궁 관 접합부에서 절단합니다. 이로 인해 난모세포의 손실이 발생하기 때문에 난소를 손상시키지 마십시오.
  3. 난소를 스테레오현미경 아래에 넣고 면도날을 사용하여 장기를 손상시키지 않고 모든 지방 조직을 제거합니다. 암풀라 지역에서 가능한 한 면도날로 절단하여 각 난소에서 oviduct를 제거합니다. 각 배금을 다른 슬라이드에 장착하고 물 한 방울로 덮습니다. 부인의 용액이 들어 있는 바이알에 난소를 보관합니다.
  4. 흡수성 종이 타월로 oviducts를 부드럽게 말리고 스테레오 현미경 아래 암풀라를 검색하십시오. 비 지배적 인 손으로, 23 G 바늘로 암풀라에서 멀리 꼬집어 장소에 oviduct를 잡고, 다음 암풀라의 중간 영역에서 1mm 절개를 만들기 위해 지배적 인 손에 또 다른 23 G 바늘을 사용합니다. 적분-난낭 복합체는 점성유체(도 2D)의한 방울로 절개로부터 돌출됩니다. 지배적 인 손에 바늘을 사용하여 oviduct에서 멀리 떨어진 방울을 부드럽게 천천히 당깁니다. 암풀라의 잔해를 눌러 난모세포가 내부에 남지 않도록 하십시오. oviducts의 탈수로 가능한 한 빨리 oviducts에서 난모를 추출하면 돌이킬 수없는 내부 의 난모세포가 트랩됩니다.
  5. 슬라이드에서 oviduct를 제거하고 난모세포가 함유 된 액체의 방울이 건조 될 때까지 기다립니다. 헤마톡시린-에오신으로 샘플을 얼룩지게 합니다. 마운팅 매체를 사용하여 덮개 슬립을 사용하십시오. 현미경 (10x)에서 관찰하여 각 난소에 의해 흘린 난모세포의 수를 결정하십시오.
    참고: 난루가 배란에 갇히기 때문에 심장 관류에 의한 희생은 이 프로토콜에서 수행되지 않으므로 배란을 평가하기 위해 조직학적 방법이 필요합니다. 사용자가 다른 조직을 분석하기 위해 perfuseuse해야하는 경우 난소를 먼저 제거하고 고정의 누출을 피하기 위해 간 아래 두꺼운 hemostats로 고정 된 내림차순 동맥.
  6. 머리의 피부를 제거하고 10 % 포르말린 용액으로 유리 용기에 두개골을 담급. 조직의 왜곡을 피하기 위해 캐뉼라를 제거하기 전에 적어도 10 일 동안 머리를 고정할 수 있습니다. 캐뉼라를 제거하려면 가위를 사용하여 두개골 을 둘러싸고있는 두개골 부위의 모든 근육을 분리하십시오. 뼈 트리머로 비강과 정면 뼈 사이를 잘라낸 다음 후두뼈를 제거합니다. 트리머의 끝을 포멘 매그넘에 삽입하고 비강 뼈의 잔해에 도달하는 처질 문장을 절단시작합니다.
  7. 두개골 꼭대기의 고립 된 영역은 정면 과 정수리 뼈를 포함해야합니다. 두개골 상단에 부착된 이식된 캐뉼라를 천천히 머리에 수직으로 당겨 제거합니다. 두뇌의 변형을 피하기 위하여 미세한 홍채 가위로 수막의 어떤 붙어 있는 부분을 잘라.
  8. 전방 후방을 수막에 잘라 두개골의 기지에서 뇌를 제거하기 위해 옆으로 넣어. 후각 전구 아래에 무딘 핀셋을 삽입하고 시신경이 보일 때까지 뇌를 부드럽게 당깁니다. 미세 홍채 가위로 신경을 자르고 뇌를 꺼냅니다. 고정 솔루션에서 뇌를 보존하십시오.
  9. 진동을 사용하여 뇌의 50 μm 두께 의 부분을 얻고, 폴리 L-리신 코팅 슬라이드 (증류수0.1 %)에 장착하고 Nissl 기술로 얼룩을 장착하십시오. 현미경(10x) 하에서 슬라이드를 관찰하여 카누라(도2A-2C)의최종 위치와 쥐 뇌 아틀라스(27)의도움으로 염료의 확산을 결정한다.

결과

전술한 프로토콜은 단일 TTX 또는 차량(인공 뇌척수액)의 효과를 평가하여 테스트되었다. ACSF) 쥐의 배란 조절에 관여하는 것으로 알려진 두 가지 다른 핵 중 하나로의 미세 주입: 수막과 아크추아테 핵. 이 포유류의 중앙 circadian 심박동기를 포함하기 때문에 수막 핵이 선택되었습니다. 그것은 생식선 호르몬의 분비로 순환 이벤트의 규칙에 관여. 아크아테 핵은 estradiol 수용체를 표현하는 뉴런의 인...

토론

이 문서에서는 깨어 있고 억제되지 않은 쥐의 뇌의 이산 영역인 일시적인 비활성화 방법을 설명합니다. 그들의 estrous 주기를 추적하고 배란을 평가하는 간단한 방법도 제공됩니다. 이 프로토콜은 TTX 처리된 동물의 배란 결과를 차량 처리된 동물의 배란 결과를 비교하여 배란을 유도하는 메커니즘에 특정 뇌 영역의 기여도를 간단하게 분석할 수 있게 합니다. 신경과학 실험실에서 흔히 볼 수 있는 ...

공개

저자는이 문서에 비해 공개 할 것이 없습니다.

감사의 말

우리는 원고 편집에 그의 귀중한 도움에 대한 워싱턴 대학의 레이몬드 산체스에 감사하고 M.Sc. 조지나 코르테스와 M.Sc. Cintia Javier이 기술의 표준화에 대한 기술 적 지원에 대한. 우리는 또한 Facultad 드 Estudios 슈페리어 사라고사에서 수의사 서비스의 구성원에게 감사드립니다: MVZ. 아드리아나 알타미라노, MVZ. 로마 에르난데스와 MVZ. 돌로레스-엘리자베스 구즈만은 실험동물의 우수한 유지 보수와 관리를 위해 서식합니다. 이 프로토콜에 설명된 실험은 DGAPA-PAPIIT 교부금 번호인 IN216015및 CONACyT 교부금 번호: 로베르토 도밍게스에 236908 지원되었습니다. 카를로스 카밀로 실바는 Programa de Doctorado en Ciencias Biomédicas, 유니버시다드 나시오날 오토노마 데 멕시코 (UNAM)의 박사 과정 학생이며 콘세조 나시오날 드 시엔시아 y Tecnología (그랜트 번호 : 294555)의 지원을 받고 있습니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
10 μL Hamilton syringesHamilton80314
21 G x 1" stainless steel hypdermic needleBD305165
23 G x 1" stainless steel hypdermic needleBD305145
30 G x 1/2" stainless steel hypdermic needleBD305106
Artificial cerebrospinal fluidBASiMD-2400
Bone trimerFine Science Tools16152-12
Burr for micro drillFine Science Tools19007-05
ClipperWahl
Cut-off discDremelSM5010
Cutting tweezersTruper17367
Cyanocrylate glueKola lokaK-1
Dental cementNic Tone
EnrofloxasinSenosiain
EosinSigmaE4009
EstereoscopeZeiss
Extra fine Bonn scissorsFine Science Tools14084-08
Face maskLanceta HG60036
Graefe ForcepsFine Science Tools11050-10
HematoxilinSigmaH3136
HemostatsFine Science Tools13008-12
Hot bead sterilizerFine Science Tools18000-45
Hydrochloric acidSigma320331
Hypromelose artificial tearsSophia Labs8950015
IsofluranePisa Agropecuaria
MeloxicamAranda1183
Microinjection pumpKD Scientific788380
MonomerNic Tone
MototoolDremel3000
Nitrile glovesLanceta HG69028
Non-Rupture Ear BarsDavid Kopf Instruments855
Poly-L lysineSigmaP4707
Povidone-iodineDermo Dine
Povidone-iodine with soapGermisin espuma
Pressure tweezersTruper17371
Rat anesthesia maskDavid Kopf InstrumentsModel 906
Saline solutionPISA
ScalpelFine Science Tools10004-13
Scalpel bladeFine Science Tools10015-00
Sodium pentobarbitalPisa Agropecuaria
Standard electrode holderDavid Kopf Instruments1770
Stainless steel wireAmerican Orthodontic856-612
Stereotaxic apparatusDavid Kopf InstrumentsModel 900LS
Surgical SissorsFine Science Tools14001-12
Teflon connectorsBasiMD-1510
Teflon tubingBasiMF-5164
TetrodotoxinAlomone labsT-500
VaporizerKent scientificVetFlo

참고문헌

  1. Herbison, A. E. Control of puberty onset and fertility by gonadotropin-releasing hormone neurons. Nature Reviews Endocrinology. 12 (8), 452-466 (2016).
  2. Fink, G., Conn, M., Freeman, E. Neuroendocrine Regulation of Pituitary Function. Neuroendocrinology in Physiology and Medicine. , 107-133 (2000).
  3. Herbison, A. E. The Gonadotropin-Releasing Hormone Pulse Generator. Endocrinology. 159 (11), 3723-3736 (2018).
  4. Morello, H., Taleisnik, S. Changes of the release of luteinizing hormone (LH) on the day of proestrus after lesions or stimulation of the raphe nuclei in rats. Brain Research. 360 (1-2), 311-317 (1985).
  5. Slusher, M. A., Critchlow, V. Effect of Midbrain Lesions on Ovulation and Adrenal Response to Stress in Female Rats. Experimental Biology and Medicine. 101 (3), 497-499 (1959).
  6. Sawyer, C. H., Haun, C. K., Hilliard, J., Radford, H. M., Kanematsu, S. Further Evidence for the Identity of Hypothalamic Areas Controlling Ovulation and Lactation in the Rabbit. Endocrinology. 73 (3), 338-344 (1963).
  7. Schiavi, R., Jutisz, M., Sakiz, E., Guillemin, R. Stimulation of Ovulation by Purified LH-Releasing Factor (LRF) in Animals Rendered Anovulatory by Hypothalamic Lesion. Experimental Biology and Medicine. 114 (2), 426-429 (1963).
  8. Bagga, N., Chhina, G. S., Mohan Kumar, V., Singh, B. Cholinergic activation of medial preoptic area by amygdala for ovulation in rat. Physiology & Behavior. 32 (1), 45-48 (1984).
  9. Barraclough, C. A., Yrarrazaval, S., Hatton, R. A Possible Hypothalamic Site of Action of Progesterone in the Facilitation of Ovulation in the Rat. Endocrinology. 75 (6), 838-845 (1964).
  10. Critchlow, V. Blockade of ovulation in the rat by mesencephalic lesions 1, 2. Endocrinology. 63 (5), 596-610 (1958).
  11. Terasawa, E., Wiegand, S. J. Effects of Hypothalamic Deafferentation on Ovulation and Estrous Cyclicity in the Female Guinea Pig. Neuroendocrinology. 26 (4), 229-248 (1978).
  12. Halász, B., Köves, K., Molnár, J. Neural control of ovulation. Human Reproduction. 3 (1), 33-37 (1988).
  13. Narahashi, T. Pharmacology of tetrodotoxin. Journal of Toxicology: Toxin Reviews. 20 (1), 67-84 (2001).
  14. Narahashi, T., Moore, J. W., Scott, W. Tetrodotoxin blockage of sodium conductance increase in lobster giant axons. The Journal of General Physiology. 47 (5), 965-974 (1964).
  15. Narahashi, T., Deguchi, T., Urakawa, N., Ohkubo, Y. Stabilization and rectification of muscle fiber membrane by tetrodotoxin. American Journal of Physiology-Legacy Content. 198 (5), 934-938 (1960).
  16. Narahashi, T. Chemicals as tools in the study of excitable membranes. Physiological Reviews. 54 (4), 813-889 (1974).
  17. Ritchie, J. M., Rogart, R. B. The binding of saxitoxin and tetrodotoxin to excitable tissue. Reviews of Physiology, Biochemistry and Pharmacology. 79 (1), 1-50 (1977).
  18. Bermudez-Rattoni, F., Introini-Collison, I. B., McGaugh, J. L. Reversible inactivation of the insular cortex by tetrodotoxin produces retrograde and anterograde amnesia for inhibitory avoidance and spatial learning. Proceedings of the National Academy of Sciences. 88 (12), 5379-5382 (1991).
  19. Tang, X., Yang, L., Liu, X., Sanford, L. D. Influence of Tetrodotoxin Inactivation of the Central Nucleus of the Amygdala on Sleep and Arousal. Sleep. 28 (8), 923-930 (2005).
  20. Klement, D., Pašt’alková, E., Fenton, A. A. Tetrodotoxin infusions into the dorsal hippocampus block non-locomotor place recognition. Hippocampus. 15 (4), 460-471 (2005).
  21. Conejo, N. M., Cimadevilla, J. M., González-Pardo, H., Méndez-Couz, M., Arias, J. L. Hippocampal Inactivation with TTX Impairs Long-Term Spatial Memory Retrieval and Modifies Brain Metabolic Activity. PLoS ONE. 8 (5), 64749 (2013).
  22. Grimm, J., Ronald, E. Dissociation of Primary and Secondary Reward-Relevant Limbic Nuclei in an Animal Model of Relapse. Neuropsychopharmacology. 22 (5), 473-479 (2000).
  23. Hasegawa, H., et al. Inhibition of the preoptic area and anterior hypothalamus by tetrodotoxin alters thermoregulatory functions in exercising rats. Journal of Applied Physiology. 98 (4), 1458-1462 (2005).
  24. Meyer, F., Louilot, A. Early Prefrontal Functional Blockade in Rats Results in Schizophrenia-Related Anomalies in Behavior and Dopamine. Neuropsychopharmacology. 37 (10), 2233-2243 (2012).
  25. Rothfeld, J. M., Harlan, R. E., Shivers, B. D. Reversible disruption of lordosis via midbrain infusions of procaine and tetrodotoxin. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 25 (4), 857-863 (1986).
  26. Silva, C., Cortés, G. D., Javier, C. Y., Flores, A., Domínguez, R. A neural circadian signal essential for ovulation is generated in the suprachiasmatic nucleus during each stage of the estrous cycle. Experimental Physiology. , (2019).
  27. Paxinos, G., Watson, C. . The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates (7th Ed). , (2014).
  28. Cora, M. C., Kooistra, L., Travlos, G. Vaginal Cytology of the Laboratory Rat and Mouse. Toxicologic Pathology. 43 (6), 776-793 (2015).
  29. Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. Mouse Estrous Cycle Identification Tool and Images. PLoS ONE. 7 (4), 35538 (2012).
  30. Wirtshafter, D., Asin, K., Kent, E. W. Simple technique for midline stereotaxic surgery in the rat. Physiology & Behavior. 23 (1), 409-410 (1979).
  31. Kozai, T. D., Jaquins-Gerstl, A. S., Vazquez, A. L., Michael, A. C., Cui, X. T. Brain tissue responses to neural implants impact signal sensitivity and intervention strategies. ACS Chemical Neuroscience. 6 (1), 48-67 (2015).
  32. Kazim, S. F., Enam, S. A., Shamim, M. S. Possible detrimental effects of neurosurgical irrigation fluids on neural tissue: An evidence based analysis of various irrigants used in contemporary neurosurgical practice. International Journal of Surgery. 8 (8), 586-590 (2010).
  33. Miyajima, M., et al. Role of cerebrospinal fluid as perfusate in neuroendoscopic surgery: A basic investigation. Acta Neurochirurgica. 113, 103-107 (2012).
  34. Mori, K., et al. Potential risk of artificial cerebrospinal fluid solution without magnesium ion for cerebral irrigation and perfusion in neurosurgical practice. Neurologia Medico-Chirurgica. 53 (9), 596-600 (2013).
  35. Oka, K., Yamamoto, M., Nonaka, T., Tomonaga, M. The significance of artificial cerebrospinal fluid as perfusate and endoneurosurgery. Neurosurgery. 38 (4), (1996).
  36. James, T. A., Starr, M. S. Effects of the rate and volume of injection on the pharmacological response elicited by intraingral microapplication of drugs in the rat. Journal of Pharmacological Methods. 1 (3), 197-202 (1978).
  37. Freund, N., Manns, M., Rose, J. A method for the evaluation of intracranial tetrodotoxin injections. Journal of Neuroscience Methods. 186 (1), 25-28 (2010).
  38. Zhuravin, I. A., Bures, J. Extent of the tetrodotoxin induced blockade examined by pupillary paralysis elicited by intracerebral injection of the drug. Experimental Brain Research. 83 (3), 687-690 (1991).
  39. Myers, R. Injection of solutions into cerebral tissue: relation between volume and diffusion. Physiology and Behavior. 1 (2), 171-174 (1966).
  40. Gonzalez-Perez, O., Guerrero-Cazares, H., Quiñones-Hinojosa, A. Targeting of deep brain structures with microinjections for delivery of drugs, viral vectors, or cell transplants. Journal of Visualized Experiments. (46), e2082 (2010).
  41. McCluskey, L., Campbell, S., Anthony, D., Allan, S. M. Inflammatory responses in the rat brain in response to different methods of intra-cerebral administration. J Neuroimmunol. 194 (1-2), 27-33 (2008).
  42. Cunningham, M. G., O'Connor, R. P., Wong, S. E. Construction and implantation of a microinfusion system for sustained delivery of neuroactive agents. Journal of VisualizedExperiments. (13), e716 (2008).
  43. Akinori, A., Masamichi, S., Hiroshi, T. A new device for microinjection of drugs into the lower brain stem of conscious rats: Studies on site of action of morphine. Journal of Pharmacological Methods. 2 (4), 371-378 (1979).
  44. Malpeli, J. G. Reversible inactivation of subcortical sites by drug injection. Journal of Neuroscience Methods. 86 (2), 119-128 (1999).
  45. Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. Optogenetics in neural systems. Neuron. 71 (1), 9-34 (2011).
  46. de Sousa, A. F., et al. Optogenetic reactivation of memory ensembles in the retrosplenial cortex induces systems consolidation. Proceedings of the Natural Academy of Sciences. 116 (17), 8576-8581 (2019).
  47. Beppu, K., et al. Optogenetic countering of glial acidosis suppresses glial glutamate release and ischemic brain damage. Neuron. 81 (2), 314-320 (2014).

재인쇄 및 허가

JoVE'article의 텍스트 или 그림을 다시 사용하시려면 허가 살펴보기

허가 살펴보기

더 많은 기사 탐색

163

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

개인 정보 보호

이용 약관

정책

연락처

사서에게 추천하기

JoVE 뉴스레터

연구

교육

저자

사서

JoVE 소개

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. 판권 소유