חשיפת תפקידם של אזורים נפרדים במוח העכברוש בוויסות הביוץ באמצעות אי-פעילות הפיכה על ידי מיקרו-גניזמים של טטרודוטוקסין

Carlos-Camilo Silva; Montserrat Bolaños-Hurtado; Cinthia Juárez-Tapia; Angélica Flores; Isabel Arrieta-Cruz; María-Esther Cruz; Roberto Domínguez

doi:10.3791/61493

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Summary

פרוטוקול זה מתאר את בנייתה של מערכת מיקרו-הפעלה בעלות נמוכה, את ההשתלה הסטריאוטקסית שלה לתוך מבנים עמוקים במוח ואת ההליך למיקרו-נג'קציה מתוזמנות של טטרודוטוקסין בחולדות ערות וחסרות מעצורים. המטרה היא לחשוף את ההשתתפות של מבנים היפותלמיים ברגולציה של הביוץ על ידי עיכוב הפעילות העצבית שלהם.

Abstract

גישות ניסיוניות רבות שימשו לחקר תפקיד המוח בוויסות הביוץ. דוגמאות כוללות את הנגע ואת חירשות של קבוצות עצביות, שהן שתי שיטות פולשניות שפוגעות לצמיתות בשלמות אזור היעד. שיטות אלה מלוות בהשפעות בטחונות שיכולות להשפיע על ניתוח מנגנוני רגולציה חריפים וטמפורליים. ההשתלה הסטריאוטקסית של קנולות מדריך המכוונות לאזורי מוח ספציפיים, ואחריה תקופת התאוששות, מאפשרת לחוקרים למיקרו-זרם תרופות שונות לאחר היעלמות ההשפעות הבלתי רצויות של הניתוח. Tetrodotoxin שימש כדי לקבוע את התפקידים של מספר אזורי מוח בתהליכים פיזיולוגיים מגוונים כי זה מעכב באופן חולף את פוטנציאל הפעולה תלוי נתרן, ובכך חוסם את כל הפעילות העצבית באזור היעד. פרוטוקול זה משלב שיטה זו עם אסטרטגיות להערכת מחזור estrous וביוץ כדי לחשוף את התפקיד של אזורי מוח נפרדים בוויסות הביוץ בזמנים מסוימים של כל שלב נתון של מחזור אסטרוס. חולדות ערות וחסרות מעצורים (Rattus norvegicus) שימשו כדי למנוע את השפעות החסימה כי הרדמה והורמוני מתח להפעיל על הביוץ. פרוטוקול זה יכול להיות מותאם בקלות למינים אחרים, מטרות המוח וסוכנים פרמקולוגיים ללמוד תהליכים פיזיולוגיים שונים. שיפורים עתידיים בשיטה זו כוללים את העיצוב של מערכת microinjection באמצעות נימים זכוכית בקוטר קטן במקום קנולות מדריך. זה יפחית את כמות הרקמה שניזוקה במהלך ההשתלה ויפחית את התפשטות התרופות המושרות מחוץ לאזור היעד.

Introduction

הביוץ הוא התהליך שבו ביציות בוגרות אחת או יותר משתחררות מהשחלות אחת ל-estral/מחזור החודשי. מכיוון שכל מיני היונקים תלויים בייצור הגמטים להתרבות, להבנת המנגנונים המסדירים את הביוץ יש השפעה עצומה בתחומים החל מביו-רפואה, תעשיית בעלי החיים ותחזוקת מינים בסכנת הכחדה. הביוץ מוסדר על ידי ציר ההיפותלמוס-יותרת המוח-השחלות, אשר כרוך במספר אזורים היפותלמיים ואקסטרה-ההיפותלמיים, הגונדוטרופים בבלוטת יותרת המוח העורפית והתקה ותאי הגרנולוזה, יחד עם הביצים, יוצרים את זקיקי השחלות בתוך השחלות¹.

זקיקי השחלות לגדול, לפתח ובסופו של דבר לביוץ בתגובה הפרשת טוניק פאזי של ההורמון מגרה זקיק ואת ההורמון נוהם, שני גונדוטרופינים מופרש על ידי gonadotropes. התבנית של הפרשת גונדוטרופין היא מרכזית להתפתחות זקיקית נכונה וביוץ והוא מוסדר על ידי הורמון משחרר גונדוטרופין (GnRH)^1,². נוירופפטיד זה מסונתז על ידי נוירונים הפזורים ברחבי הדיאנספלון הבזלי ולאחר מכן מופרש לערם השער המקשר את ההיפותלמוס ואת בלוטת יותרת המוח הצפונית. הפעילות הפרשתית של נוירוני GnRH מווסת על ידי קלט סינפטי הנובע ממבנים מוחיים מגוונים. מבנים אלה מעבירים מידע על מצב הסביבה החיצונית והפנימית של האורגניזם כולל זמינות המזון, אורך הפוטופריודה וריכוז ההורמונים בדם. במובן זה, הם מעצבים את דפוס הרבייה של כל מין ואת התפקידים הספציפיים של מבנים כאלה חייב להיקבע על מנת להבין כראוי את המנגנונים השולטים בביוץ. כדוגמה, הוכח כי התנודתיות ברמות אסטרדיול במהלך מחזור אסטרוס מסדירה את הפרשת GnRH; עם זאת, GnRH-נוירונים אינו מבטא את isoform קולטן אסטרדיול הדרוש כדי לזהות שינויים כאלה. שתי אוכלוסיות של נוירונים המבטאים קולטנים אלה ממוקמים באזור periventricular rostral של החדר השלישי ובגרעין arcuate, בהתאמה, וסינפסות ייצוב עם נוירונים GnRH. יש ראיות להציע כי נוירונים אלה לפרש את הריכוז של אסטרדיול ולאחר מכן לעורר את הפעילות של GnRH-נוירונים על ידי שחרור kisspeptin, משרן חזק של הפרשת GnRH³.

ניסויים הכוללים נגעים תרמיים או כימיים, כמו גם חירשות מכנית, אפשרו לחוקרים לקבוע את מעורבותם של מספר מבני מוח בוויסות הביוץ⁴^,⁵^,^6,⁷^,^8,⁹^,¹⁰^,¹¹^,¹² . ניסויים אלה, עם זאת, יש את החיסרון של להיות פולשני וטראומטי, הדורש כמה ימים של התאוששות לפני הערכת ההשפעות של הטיפול, לעכב את הניתוח של ההשפעות החריפות של הטיפול. בנוסף, הם משפיעים לצמיתות על האזורים הממוקדים ומשבשים תהליכים פיזיולוגיים אחרים בטווח הארוך. בשל בעיות אלה, התוצאות של ניסויים אלה מוסתרות בדרך כלל על ידי מנגנוני פיצוי הומיאוסטטיים בגוף החיה וחילוץ מידע מדויק על הדינמיקה הרגולטורית הזמנית שבה האזור מעורב הוא די קשה.

המיקרו-נסיגה של תרופות שמשבשות באופן חולף את פעילותם של נוירונים באמצעות קנולס מדריך היא חלופה מתאימה העולה על החסרונות שהוזכרו לעיל. הקנולות יכולות להיות ממוקמות בכל אזור במוח על ידי ניתוח סטריאוטקסי, המאפשר לחוקר להתחיל את הטיפול התרופתי לאחר שההשפעות המבלבלות של הניתוח נעלמות. המיקרו-הזדקנות המתוזמנות של התרופות מאפשרת לחוקרים לבחון השערות לגבי תרומת האזור לשלב מסוים של התהליך וניתן לבצען בבעלי חיים ערים מרוסנים או חופשיים. מגוון רחב של תרופות כולל הרדמה מקומית, אגוניסטים, אנטגוניסטים, אגוניסטים הפוכים ורעלים ביולוגיים כגון tetrodotoxin (TTX) ניתן microinjected לתוך אזור עניין בזמנים ספציפיים.

TTX הוא רעלן ביולוגי מסונתז על ידי חיידקים החיים בגוף של דגי הנפוחיות, כמו גם בעלי חוליות אחרים חסרי חוליות. TTX משתיק פעילות עצבית באמצעות המצור הסלקטיבי והחולף של ערוצי נתרן, אשר גורם לעיכוב של פוטנציאל פעולה תלוי נתרן. בנוכחות TTX, תאים חווים שינוי בשלב ההפחתה ולכן אינם נרגשים אך נשארים בחיים. אפקט החסימה של TTX מוסבר על ידי ההרכב המולקולרי שלה: קבוצת guanidinium הוא מסוגל לעבור דרך ההיבט החוץ תאי של ערוץ נתרן, אבל שאר המולקולה לא יכול לעבור בשל גודלו, ולכן הוא תקוע וחוסם את ערוץ¹³^,¹⁴^,¹⁵^,¹⁶^,¹⁷ . מנגנון הפעולה של TTX אפשר את השימוש בו ככלי ללמוד את מערכת העצבים הן במבחנה והן ב- vivo. הזרקה תוך מוחית של רעלן זה שימשה כדי לחקור את התפקיד של אזורי מוח נפרדים במספר תהליכים כמו שימור זיכרון¹⁸, שינה וגירוי¹⁹, זיהוי מקום²⁰, ניווט מרחבי²¹, שימוש בסמים²², thermoregulation²³, התפתחות של סכיזופרניה²⁴, התנהגות מינית²⁵ ורגולציה של הביוץ²⁶ בין היתר. בפרוטוקול זה אנו מתארים את ההשפעות על הביוץ של חוסר הפעילות החולפת של גרעינים היפותלמיים על ידי מיקרו-בייג'ן TTX בחולדות ערות וחסרות מעצורים.

Protocol

הליכים הנוגעים לבעלי חיים אושרו על ידי ועדת האתיקה של הפקולטה של הפקולטה לסוסות סרגוס סרגוסה, UNAM. מוסד זה פועל בהתאם לחוקים המקסיקניים לטיפול בבעלי חיים, נורמה רשמית: NOM-062-ZOO-1999, אשר מסכים עם הנחיות בינלאומיות.

1. בניית קנולס דו-צדדיות

לחלץ את פיר נירוסטה מהרכזת של שתי מחטים hypodermic 23 G באמצעות פינצטה לחץ ולאחר מכן להסיר כל דבק שנותר באמצעות להב אזמל.
צייר קו 15 מ"מ מלבד הקצה הקהה של הפירים עם סמן קבוע בסדר. השתמש פינצטה חיתוך כדי להסיר את הקצוות משופעים.
החזק את מקטעי 15 מ"מ עם hemostats בסדר ולחץ עליהם בניצב עם דיסק מנותק מחובר לכלי מסתובב עד 14 מ"מ קטעים של צינורות מתקבלים. צעד זה נעשה על מנת לחסל את החלק החנוק של הפירים, יצירת קצוות פתוחים ובוטים. לבסוף, הכנס מחט 30 G דרך המקטעים כדי לחסל כל חסימה פנימית.
לקבוע את המרחק בין המבנים של עניין בחצי הכדור השמאלי והיומי של המוח בעזרת אטלס המוח²⁷. השתמש בחימר עובש כדי לחבר את שני מקטעי 14 מ"מ לשקופית מיקרוסקופ ולהבטיח ששניהם נמצאים באותה רמה אופקית. התבונן דרך מיקרומטר עיני (10x) ולהתאים את המקטעים עם פינצטה עדינה עד המרחק הרצוי מתקבל.
מערבבים ממרח הלחמה עם 10% חומצה הידרוכלורית בפרופורציה של 2:1 ומוסיפים טיפה של התערובת 2 מ"מ מתחת לקצה הקהה של המקטעים. הלחמה שני מקטעים עם נקודה אחת באמצעות ברזל הלחמה חוט הלחמה בקוטר 0.5 מ"מ. ודא כי ההלחמה אינה חוסמת את לומן של המקטעים.
צור תמיכה כדי לחבר את הצינורית למחזיק סטריאוטקסי על ידי חיתוך קטע 10 מ"מ של חוט נירוסטה גמיש 0.3 מ"מ. השתמש חימר עובש למקם 2 מ"מ של החוט במגע עם נקודת הלחמה הקודמת ואת השאר שוכב מעל הקצה קהה של קנולס. הלחמיץ את החוט לקנולס.
לנקות את פני השטח של קנולה עם 70% אתנול כדי להסיר את עודף של הדבק הלחמה. לשטוף את הפנים של קנולות עם מים סטריליים כדי להסיר חלקיקים מתכתיים. חזור על תהליך זה עד שלא ניתן יהיה לזהות חלקיקים מתחת למיקרוסקופ בהגדלה של פי 10.

2. בניית אומתים וכובעים

כדי לבנות את obturators לחתוך שני קטעים 16 מ"מ של חוט רך נירוסטה עגול (0.35 מ"מ של קוטר). החזק צינורית דו-צדדית עם hemostats, מאונך לספסל מעבדה, ולהכניס אחד מקטעים אלה לתוך כל צינורית עד שהם מגיעים לספסל. לכופף את השריד בזווית של 90°.
עבור המכסים לחתוך שני מקטעים 2 מ"מ של צינורות סיליקון (קוטר פנימי = 0.76 מ"מ) ולהחיל טיפה של דבק סיליקון באחד הקצוות של כל קטע. אל תתנו לדבק להיכנס לצינורות. תן להתייבש לפחות 24 שעות.

3. בניית מיקרו-מנג'רים

חזור על שלב 1.1, באמצעות 30 G מחטים hypodermic במקום כדי ליצור את פירים.
צייר קו 18.5 מ"מ מלבד הקצה הקהה של הפירים ולהסיר את שריד הקצוות משופעים עם פינצטה חיתוך.
חזור על שלב 1.1 עם מחט יחיד 23 G לבניית מתאמים על ידי חיתוך שני מקטעים באורך 6 מ"מ החל מהקצה הקהה.
לחסל את החלקים החסומים של קטעי 6 מ"מ על ידי לחיצה עליהם בניצב נגד הדיסק לחתוך עד שני מתאמי 4 מ"מ מתקבלים. לחסל כל חסימה פנימית.
הוסף את הקצה משופע של מקטעי 30 G לתוך המתאמים. הסתכל דרך סטריאומיקוסקופ כדי להבטיח שהסוף של שניהם, מקטעים ומתאמים, נמצאים באותה רמה. יש למרוח דבק ציאנואקרילט על המפרק הדיסטלי בעזרת צמר גפן ולייבש במשך 15 דקות.
השרו שני מחברי צינורות טפלון ב-70% אתנול למשך 5 דקות ואז חברו אותם למיקרו-מזרקים דרך המתאמים. המתן עד שקוטר המחברים יתכווץ לפחות 24 שעות ולאחר מכן עקר את המיקרו-נג'ר בשיטת טמפרטורה נמוכה כדי למנוע נזק למחברים (מומלץ לעקר את תחמוצת האתילן).

4. תחזוקת בעלי חיים והכפשות בנרתיק

השתמש בחולדות ברדס נקבה בוגרת מחזורית(Rattus norvegicus, זן CIIZ-V) במשקל בין 230 ל 260 גרם. בית החולדות בקבוצות של ארבעה בכלובי פוליפרופילן סטנדרטיים בחדר עם פוטופריוד 14: 10 בהיר-כהה. הגדר את הטמפרטורה והלחות ב 22 ± 2 °C (50 °F) ו ב 40%, בהתאמה. ספקו מזון ומים עד ליביטום.
קח מריחות בנרתיק כל יום בין השעות 10:00-12:00.
1. לחטא לולאה בקטריולוגית שונה עם קוטר פנימי של 1 מ"מ באמצעות מנורת אלכוהול ולקרר אותו עם מים סטריליים. החזק את החולדה עם אחיזה מאובטחת והכנס 5 מ"מ של הלולאה הבקטריולוגית לתוך הנרתיק, נוגע בקירות הפנימיים שלה. הסר את הלולאה הבקטריולוגית. אם תצליח, טיפה מעוננת תיראה בקצה. הנח ירידה זו על שקופית מיקרוסקופ.
2. חזור על תהליך זה עבור כל חולדה מעקר וקירור הלולאה בין כל בעל חיים.
3. לאחר הטיפות להתייבש, כתם עם המטוקסילין-אאוזין להתבונן בדגימות תחת מיקרוסקופ ב 10x.
4. קבעו את שיעור הלוקוציטים, תאי הגרעין האפיתל והתאים הקראטיניים על כל מריחה וסיווגו לפי הקריטריונים של שלבי מחזור אסטרוס שדווחו באיור 1, אשר מסכים עם הספרות^{הקודמת 28}^,²⁹.

5. השתלה סטריאוטקסית של הקנולות

הערה: בצע את ההשתלה של הקנולות לאחר ניתוח סטריאוטקסי אספטי רגיל וציות לנורמות מוסדיות.

לפני הניתוח
1. לחטא מכשירים כירורגיים, קנולות, ברגים כירורגיים, obturators, גזה וצמר גפן עץ 24 שעות לפני הניתוח באמצעות autoclave קיטור. לחטא את קצות המכשירים המתכתיים בין ניתוחים רצופים על ידי ניקוי אותם עם 10% מי חמצן ואחריו מים ולאחר מכן למקם אותם מעקר חרוזים חם.
2. הכן את אזורי העבודה ואת המכשיר הסטריאוטקסי לפני הסרת החיה מהכיתה. הכן את החיה לניתוח באזור הממוקם רחוק ככל האפשר משולחן הניתוח כדי למנוע זיהום במהלך ההליך.
3. לנקות את אזורי ההכנה והניתוח עם 70% אתנול ואחריו יישום של פתרון 10% כלוריד במשך עשר דקות. נקו את הבסיס, המסגרת והמניפולטורים של המכשיר הסטריאוטקסי עם 70% אתנול ועקרו את קצות מוטות האוזניים באמצעות מחטא חרוזים חם וקררו אותם באוויר לפני הניתוח.
4. בצע את הניתוח לובש חלוק מעבדה ייעודי, מסכת פנים, מצנפת ראש, שרוולים כירורגיים, כיסויי נעליים וכפפות כירורגיות. בקשו מהעוזר להכין את בעלי החיים לניתוח ולבדוק את מצבם הכללי במהלך ההליך.
5. חבר את הצינורית למחזיק הסטריאוטקסי. בקשו מהעוזר להביא את החיה הראשונה המופעלת לחדר. חולדות נבחרות ב diestrus לניתוח, שכן תצפיות מהמעבדה שלנו מצביעות על כך שבעלי חיים אלה לשחזר מחזורי estrous נאות מהר יותר מאשר חולדות פעלו בשלבים אחרים, כנראה בגלל התגובה לשינויים מתח יחד עם מחזור estrous.
6. שקול את החיה, ולעורר הרדמה עם 4% איזופלוראן ב 100% חמצן בתוך תא אינדוקציה לחולדות המחוברות לאידוי איזופלוראן. כדי למנוע הדגשת בעלי החיים, לא למלא מראש את החדר. אשר מישור כירורגי של הרדמה על ידי בדיקת התפשטות האישון ואובדן הכאב כפי שנמדד על ידי בדיקות צביטת הזנב והאוזן לאחר שתבחין באובדן רפלקס ההצדקה.
  1. להרגיז את החולדה על ידי הזרקה תוך-קרקעית של תערובת של קטמין (100 מ"ג/ק"ג) וקסילאצין (10 מ"ג/ק"ג) אם אידוי איזופלוראן אינו זמין.
7. הסר את החולדה מתא האינדוקציה ולהשתמש חרוט האף בשולחן ההכנה כדי לשמור על ההשפעות של הרדמה עם 2.5% איזופלוראן ב 100% חמצן. לקצץ את השיער של הקרקפת עם קוצץ ולהסיר שיער רפוי עם רולר מוך. הזריק מינון תת עורי לפני הניתוח של 2 מ"ג/ק"ג של Meloxicam ו 5 מ"ג/ק"ג של Enrofloxacin כמו נוגד דלקתיות/משכך ים ואנטיביוטיקה, בהתאמה.
  1. יש למרוח דמעות מלאכותיות של היפרומלס על כל עין כדי למנוע ייבוש במהלך הניתוח.
8. הר את החיה בכלי הסטריאוטקסי מעל כרית חימום באמצעות מוטות אוזניים שאינם מקרע ומסכת הרדמה. התאימו את מהדק האף כדי להבטיח שראש החיה שטוח. בצע קרצוף כירורגי באזור המגולח לסירוגין בין פובידון-יוד עם סבון ו 70% אתנול פעם אחת ולאחר מכן באמצעות פוידון-יוד ו 70% אתנול פעמיים. הכנס מדחום רקטלי כדי לתעד את הטמפרטורה של החיה במהלך ההליך ולאחר מכן לכסות אותו עם שדה כירורגי סטרילי.
במהלך הניתוח
1. השתמש באזמל כדי לבצע חתך 2 ס"מ בעור ובשריר באמצע האזור המגולח. הסר את periosteum מהגולגולת באמצעות צמר גפן מצופה 2% מי חמצן כדי לחשוף ברגמה או lambda, ציוני הדרך שישמשו לחישוב קואורדינטות היעד. יבש את הגולגולת עם אוויר להדמיה טובה יותר של ציון הדרך.
2. השתמש במניפולציטורים של המכשיר הסטריאוטקסי כדי להזיז את הצינורית למיקום ישירות מעל ציון הדרך של בחירה. רשום את הקואורדינטות הקדמיות-אחוריות ואת הקואורדינטות המהודל-לרוחב מהמכשיר הסטריאוטקסי והשתמש בהן כדי לחשב את הקואורדינטות של אזור היעד על פי אטלס המוח²⁷.
3. הגדר את הקואורדינטות המחושבות במכשיר הסטריאוטקסי והצב את קצה הצינורית על פני הגולגולת. רשום את קואורדינטת הגחון-גחון-גחון והשתמש בה כדי לחשב את העומק לאזור היעד.
4. הסר את זרועו של המניפולטור על ידי הסרתו מהמסגרת. השתמש בר שיניים המחובר לכלי סיבוב במהירות של 15,000 סל"ד כדי להטביע חותם במקום שבו תבוצע הגולגולת. ואז להשתמש בר לעשות שלושה חורים, יצירת משולש שווה צלעות סביב הסימן. אסור החורים האלה לנקב את הגולגולת. הכנס את הברגים הכירורגיים לתוך החורים, להבטיח כי הם ממוקמים בחוזקה.
5. הפוך את הגולגולת רחבה מספיק כדי להתאים את המרחק בין אזורי היעד בכל חצי כדור הארץ. זה צריך להיות קטן ככל האפשר קוטר אבל גדול מספיק כדי לאפשר את הנמכת הצינורית מבלי לגעת בגבולות הגולגולת, שכן זה ישנה את המסלול. בצע את הגולגולת בהדרגה, החלת הלחץ הנמוך ביותר האפשרי. גולגולת המכרסם היא רק כמה מילימטרים עובי וזה מרכזי כדי לשמור על שלמות הרקמות מתחת.
6. ברגע dura mater גלוי, להשתמש מחט סטרילי 21 G עם הקצה מעוקל בזווית של 90 ° כדי להסיר שבבים של העצם ולעשות חתך הקדמי-אחורי בקרום החם. השתמש Wirtshafter ועמיתיו³⁰ טכניקה כדי למנוע נזק לסינוס קשת מעולה אם אזור היעד ממוקם קרוב לקו האמצע.
  1. מניחים את המחזיק עם הצינורית במסגרת והשתמשו במניפולציה-גחון-גחון כדי להגיע לקואורדינטת הגחון. בדוק כי המחט אינה נוגעת בגבולות בעת הירידה ולהגדיל את הקוטר של גולגולת במידת הצורך.
    הערה: חשוב כי קצה המדריך קנולס מכוון לאזור הנע בין 0.5 ל 2.0 מ"מ מעל אזור העניין. זאת בשל התגובה הדלקתית של המוח בתגובה להכנסת גופים זרים ולהרס הרקמה. זה קריטי במיוחד אם אזור העניין קטן ויש לחשב מראש את מרחק העבודה אמפירית.
7. יש למרוח מלט דנטלי כדי לחבר את הצינורית לגולגולת ולתת לה להתייבש. ודא כי מלט השיניים אינו מכסה את הקצה הבוטה של הצינורית שכן זה יחסום אותו באופן בלתי הפיך. חכה עד שהמלט יתמצה לחלוטין.
8. הכנס את החסימות כדי למנוע חסימות נוספות כדי להבטיח טפיחה במהלך המחקר. שים על כובע הסיליקון כדי למנוע זיהום.
לאחר הניתוח
1. החלף נוזלים אבודים על ידי הזרקה תוך-פריטונית של 1.0 מ"ל של תמיסת מלח סטרילית בטמפרטורה פיזיולוגית. מניחים את החיה בכלוב התאוששות עם תמיכה תרמית עד שהיא מתאוששת מהרדמה. בדוק את הטמפרטורה ואת האח / קצב הנשימה של החיה מעת לעת. אפקטים איזופלוריין להימשך כמה דקות לאחר הפרעה של שטף הגז בעוד אפקטים קטמין/קסילסילאזין נמשך 40-50 דקות.
2. לספק זריקות לאחר הניתוח של תרופות אנטיביוטיות, משכך משכך ואנטי דלקתיות (באותם מינונים ומסלולים כאמור) עבור 48-72 שעות ולבדוק מקרוב את בעלי החיים על בסיס יומי עבור שאר הניסוי. דווח על כל סימן לכאב, מתח או ירידה במשקל לשירותי וטרינר או לחבר מיומן במעבדה. אין לבצע כל מניפולציה אחרת לחולדות בתקופה זו.
3. התחל לקחת מריחות בנרתיק לאחר הטיפול לאחר הניתוח ולהמשיך לעשות את זה עד החיה מראה שלושה מחזורים אסטרוס רצופים של ארבעה ימים.
  הערה: צנתרים וריד הצוואר כרוניים ניתן להשתיל בניתוח, המאפשר לחוקר לקחת דגימות דם סדרתיות כדי לנתח את הפרשת הורמונים כגון אסטרדיול, פרוגסטרון, טסטוסטרון, הורמון מחלמן, הורמון מגרה זקיק קורטיקוסטרון. אנו ממליצים להציב קטטר כזה ברגע שבעל החיים מתאושש מניתוח המוח, שכן זה ישפר את שיעור ההישרדות תוך הימנעות סתימה של הקטטר שעלול לנבוע מזמן התאוששות ממושך.

6. טיפול והכנת פתרונות טטרודוטוקסין

זהירות: TTX הוא אחד החומרים הרעילים ביותר הידועים. הוא פועל על שרירי השלד ורקמת העצבים. שיכרון על ידי מגע אינו סביר אבל כל פצע פתוח הוא מסלול פוטנציאלי לחיסון לתוך הגוף. החששות העיקריים בעת עבודה עם TTX הם ניקוב העור עם מכשירים חדים שהיו במגע עם הרעלן ואת הדור של אירוסולים שעלולים להגיע לפה, לעיניים וריריות. בהתאם למינון, TTX עשוי להיות קטלני אם נשאף, נבלע או מחוסן על ידי העור. זה יגרום לגירוי חזק של העיניים. ה- LD50 נבדק בעכברים על ידי מתן אוראלי ותוך ורידי והוא 334 מיקרוגרם/ק"ג ו-7.3 מיקרוגרם/ק"ג, בהתאמה. אין אנטיטוקסין זמין בשלב זה.

הערה: חומר לא פעילים הוא 1.0% NaOCl עם או בלי 0.25 N NaOH, או פתרון אקונומיקה 10%. אי-הפעלה מלאה מתרחשת לאחר חשיפה של 30 דקות. TTX לא יכול להיות מומת לחלוטין על ידי כלוריד נגזר בריכוז מתחת 10%, על ידי autoclaving ולא על ידי עיקור חום יבש בטמפרטורה נמוכה מ 500 °F. כל ההליכים הקשורים TTX חייב להתבצע על ידי שני אנשים בקיאים לובשים זוגות פנימיים וחיציניים של כפפות ניטריל, חלוק מעבדה ייעודי, משקפי בטיחות, מסכת פנים חד פעמית, נעליים סגורות ומכנסיים באורך מלא.

הכנת פתרון המניה
1. מניחים כרית ספוגה בחומר ההמתה במכסה המנוע כדי למנוע זיהום במקרה של דליפה. ודא כי מכסה המנוע האדים עובד כראוי לפני תחילת. הכן כלי קיבול עם הפתרון המשפיל כדי להיפטר טיפים פיפטה.
2. TTX סטרילי Resuspend אבקת ליופילית ציטוט על פי הוראות היצרן על ידי טיטרציה זהירה ואיטית מאוד עם נוזל השדרתי מלאכותי סטרילי, שטיפה במורד הקירות של המשחקון בתהליך. הימנע היווצרות של קצף ותרסיס. בצע טכניקה אספטית כדי למנוע זיהום של פתרון TTX מאז זה יהיה מוזרק לתוך המוח של בעלי חיים חיים. השתמש מזרק עם מחט במקום micropipette אם בקבוקוני TTX שלך יש קרום חיצוני כדי למנוע היווצרות תרסיס.
3. Aliquot פתרון המלאי לתוך צינורות מיקרו סטריליים. הפוך aliquots קטן ככל האפשר מאז הקפאה / הפשרה מחזורים עשויים לשנות את היציבות של המולקולות. אין למלא יותר ממחצית הצינורות כי מים גדל נפח כאשר קפוא, אשר יכול להוביל לפתיחת המכסה וזיהום של הצינור ודגימות אחרות המאוחסנות במיכל.
4. לטהר את החלק החיצוני של הצינורות ואת המשטחים שבהם TTX שימש עם החומר המנטרל. לאחסן את הצינורות ב -20 °C בקופסת מיקויים בתוך מיכל משני.
דילול תמיסה של המניה לריכוז עבודה
1. הכן פתרונות מדוללים טריים ביום שבו הם ישמשו מכיוון שפתרונות מדוללים פחות יציבים. מניחים משטח ספוג בחומר ההמתה במכסה המנוע של האדים ומתלה צינור מיקרו עליו. הכן כלי קיבול עם הפתרון המשפיל כדי להיפטר טיפים פיפטה.
2. Pipette פתרון המלאי בתחתית microtube סטרילי ולאחר מכן להוסיף את הכמות המחושבת של נוזל השדרתי מלאכותי כדי להשיג ריכוז של 10 ננוגרם / μL. כפי שתואר להשעות מחדש של אבקת TTX, לבצע טיטציה זהירה ואיטית מאוד, שטיפה במורד קירות של המשחקון והימנעות היווצרות של קצף ותרסיס.
3. אם דגימות שהיו על המקפיא ישמשו למיקרו-ינון, יש לאפשר להן להתפלות בטמפרטורת החדר לפחות שעה אחת לפני הניסוי.

7. מיקרו-נסיגה של פתרונות TTX או רכב לחולדות הנעות בחופשיות

הגדר את משאבת microinjection עם קצב עירוי וזמן ההזרקה הכולל על פי הניסוי. חשב פרמטרים אלה מראש בהתחשב בנפח הכבוש על ידי מבנה היעד וכמות הפתרון שיש להזריק. לניסוי זה להזריק 200 nL של פתרון בקצב של 50 nL לדקה עבור זמן עירוי כולל של 4 דקות.
מלא שני מזרקי 10 μL המילטון במים מזוקקים סטריליים, הכנס חתיכת צינורות טפלון סטריליים לתוך מחבר הצינורות של כל מיקרו-מזרק, והבטיח כי אורך הצינורות אינו מגביל את תנועת החולדה (צינורות יכולים להיות מעוקרים באמצעות תחמוצת אתילן).
מניחים משטח ספוג בחומר ההמתי ובמרבע 2 ס"מ על 2 ס"מ של סרט פרפין מעליו. Pipette כמות מספקת של TTX כדי למלא את המחט של המזרק ו 1 ס"מ של צינורות מעל הסרט. ספג את טיפת TTX על ידי ביטול עדין של הבוכנה. הר את המזרקים במשאבת microinjection ולהשתמש בפקדים שלה כדי לתפעל את הבוכנה עד טיפה של TTX ניתן לראות בקצה של כל microinjector. יש להשליך את הטיפות לתוך הכרית הספוגה בחומר לא פעילים.
בחר את החולדות שימיקרו-ינוחו. השתמש רק חולדות שהראו לפחות שלושה מחזורים רצופים לאחר הניתוח. שקול את שלב המחזור שלהם ואת השעה של היום. הן הזמן והן השלב תלויים בהשערה הספציפית שתבדקו, לניסוי זה 14:00 שעות של בלטו שנבחרו מאז אותות טרום הביוץ העצבניים השולטים בהפרשת GnRH פאזית מתרחשים ברגע זה. להעביר אותם לחדר שבו הזריקה תתבצע בתוך כלובי הדיור שלהם כדי למנוע מצוקה.
החזק את החולדה עם אחיזה מוצקה, להסיר את הכובע ואת obturators מן הקנולות, להכניס את microinjectors לתוך קנולס המדריך ולהחזיר את החיה לכלוב.
הפעל את המשאבה והמתן עד שהמיקרו-ינון יסתיים. התבונן בבעלי החיים בתקופה זו על מנת לזהות ניתוק אפשרי של microinjectors וכדי למנוע את פיתול של צינורות טפלון.
השאירו את microinjectors במקום במשך שתי דקות נוספות כדי למנוע reflux של הפתרון. הסר אותם, לנקות את פני השטח של השתל עם פתרון חיטוי iodopovidone, הימנעות זרימתו בתוך קנולות המדריך. הכנס obturators סטרילי, לשים על הכובע ולהחזיר את החיה לחדר המושבה. שים לב החיה מעת לעת כדי לזהות תופעות לוואי אפשריות של התרופה.
הפעל את המשאבה עם אותם פרמטרים כמו במהלך microinjection ולבדוק זרימה נכונה כדי להבטיח כי patency של המערכת נשמר במהלך ההליך.
לחץ על הבוכנה כדי לגרש את TTX / הרכב מתוך microinjector עד בועת האוויר מגיע לקצה המחט. הזכר את TTX במיקרו-טיוב שלו. מלא את המזרק במים מזוקקים והשתמש בו כדי לנקות את פנים הצינורות. להשליך את המים לתוך החומר המנטרל ולחזור על תהליך זה לפחות שלוש פעמים. נקה את החלק החיצוני של מזרקים, צינורות ומיקרו-מזרקים עם בד ספוג בחומר המנטרל.

8. המתת חסד ועיבוד רקמות

ביום של אסטרוס צפוי או מאושר בנרתיק, להזריק את החולדה עם מנת יתר תוך-פריטונאלית של נתרן פנטוברביטל (75 מ"ג/ קילוגרם). בדוק אם יש אובדן הכרה והזרק 200 nL של פתרון כחול מתילן 0.5% באמצעות קנולס המדריך כמתואר בשלבים 7.1 עד 7.9. בדוק אם סימני כאב באמצעות הבוהן או בדיקת צביטת הזנב, ואם אף אחד לא זוהה, לערוף את ראש החולדה באמצעות גיליוטינה מכרסם.
השתמש במספריים כדי לפתוח את חלל הבטן ולמצוא את השחלות. השתמש במספריים קשתית עדינה כדי לנתח כל שחלה, חיתוך בצומת הרחם-tubal בעזרת זכוכית מגדלת. הימנע מפגיעה oviduct כי זה יגרום לאובדן ביוצים.
שים את השחלות תחת סטריאומיקרוסקופ והשתמש בסכין גילוח כדי להסיר את כל רקמת השומן מבלי לפגוע באיבר. הסר את oviduct מכל שחלה על ידי חיתוך עם סכין גילוח רחוק ככל האפשר מאזור ampulla. הר כל oviduct על שקופית אחרת לכסות עם טיפת מים. יש לאחסן את השחלות בוויאליה המכילה את הפתרון של בואן.
יבשו בעדינות את האובידוקט במגבת נייר סופגת וחפשו את האמפולה מתחת לסטריאומיקרוסקופ. עם היד הלא דומיננטית, להחזיק את oviduct במקום על ידי צביטה רחוק מן ampulla עם מחט 23 G, ולאחר מכן להשתמש מחט 23 G נוסף ביד הדומיננטית לעשות 1 מ"מ סינגוך באזור האמצעי של האמפולה. מתחמי הקומולוס-ביוציטים יבלטו מהחתכים כטיפה של נוזלצמיג (איור 2D). השתמש במחט ביד הדומיננטית כדי למשוך בעדינות ולאט לאט את הטיפה רחוק מה- oviduct. לחץ על שריד האמפולה כדי להבטיח שלא יישארו בוציטים בפנים. לחלץ את oocytes מן oviducts מהר ככל האפשר כמו ייבוש של oviduct יהיה ללכוד באופן בלתי הפיך את oocytes בפנים.
הסר את oviduct מן השקופית ולחכות עד טיפת הנוזל המכיל את oocytes מתייבש. כתים את הדגימה עם המטוקסילין-אאוזין. השתמש בינוני הרכבה כדי כיסוי. שים לב מתחת למיקרוסקופ (10x) כדי לקבוע את מספר הביציות שנ לשפוך על ידי כל שחלה.
הערה: הקרבה על ידי זלוף לב אינה מבוצעת בפרוטוקול זה שכן הביציות יהיו לכודות באובידוקטים ולכן יהיה צורך בשיטות היסתולוגיות כדי להעריך ביוץ. אם המשתמש חייב לעיין כדי לנתח רקמות אחרות, השחלות ניתן להסיר הראשון ואת העורקים היורדים מהודק עם hemostats עבה מתחת לכבד כדי למנוע דליפה של קיבוע.
הסר את העור של הראש ולהטביע את הגולגולת במיכל זכוכית עם פתרון פורמלין 10%. אפשר קיבוע של הראש לפחות עשרה ימים לפני הסרת הצינורית כדי למנוע עיוות של הרקמה. כדי להסיר את הצינורית, להשתמש במספריים כדי לנתק את כל השרירים באזור הגולגולת המקיפה אותו. חותכים בין עצמות האף והחזית עם גוזמי העצם ואז מסירים את העצם העורפית. מכניסים את קצה הגוזמים למגנום פורם ומתחילים לחתוך דרך פסגות הקשת המגיעות לשריר עצם האף.
האזור המבודד של החלק העליון של הגולגולת חייב להכיל את העצמות הקדמיות והקודקודיות. הסר את הצינורית המושתלת המחוברת לחלק העליון של הגולגולת על ידי משיכה איטית למעלה בניצב לראש. חותכים כל חלק מצורף של קרום המוח עם מספריים קשתית עדינים כדי למנוע עיוות של המוח.
הפוך חתך הקדמי-אחורי על קרום המוח ולשים אותם בצד כדי להסיר את המוח מבסיס הגולגולת. הכנס פינצטה קהה מתחת לנורות הריח ומשוך בעדינות את המוח עד שעצבי הראייה נראים. חותכים את העצבים עם מספריים קשתית עדינים ולשלוף את המוח. לשמר את המוח בפתרון קבוע.
להשיג 50 מיקרומטר חלקים בעובי של המוח באמצעות ויברטום, להרכיב אותם שקופיות מצופות פולי-L-ליצין (0.1% במים מזוקקים) וכתם עם טכניקת Nissl. התבונן בשקופיות מתחת למיקרוסקופ (10x) כדי לקבוע את המיקום הסופי של הקנולות (איור 2A-2C) ואת התפשטות הצבע בעזרת אטלס מוח חולדה²⁷.

תוצאות

הפרוטוקול שתואר לעיל נבדק על ידי הערכת ההשפעות של TTX יחיד או רכב (נוזל השדרתי מלאכותי; ACSF) מיקרו-ג'ק-קציה לאחד משני גרעינים שונים הידועים כמעורבים בוויסות הביוץ בחולדה: הסופרכיאסמטי וגרעין הארקואט. הגרעין הדו-על-פראציאזמטי נבחר מכיוון שהוא מכיל את קוצב הלב הביולוגי המרכזי ביונקים. הוא מעור?...

Discussion

מאמר זה מתאר שיטה לנטרל באופן חולף, בכל זמן נתון, אזור נפרד במוחם של חולדות ערות וחסרות מעצורים. שיטה פשוטה כדי לעקוב אחר מחזור estrous שלהם ולהעריך ביוץ מסופק גם. פרוטוקול זה מאפשר ניתוח פשוט של תרומתם של אזורי מוח ספציפיים למנגנונים המניעים ביוץ על ידי השוואת התוצאה הביוץ של בעלי חיים שטופלו ...

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף ביחס למאמר זה.

Acknowledgements

אנו מודים לריימונד סנצ'ז מאוניברסיטת וושינגטון על עזרתו היקרה בעריכת כתבי יד M.Sc ג'ורג'ינה קורטס M.Sc סינציה חוויאר על תמיכתם הטכנית בתקינה של טכניקה זו. אנו מודים גם לחברי שירותי הווטרינר בפקולטה דה אסטודיוס סופריור סרגוסה: MVZ. אדריאנה אלטאמירנו, MVZ. רומן הרננדז ו-MVZ. דולורס-אליזבת גוזמן לתחזוקה וטיפול מצוין בבעלי חיים ניסיוניים. הניסויים המתוארים בפרוטוקול זה נתמכו על ידי מספר מענק DGAPA-PAPIIT: IN216015 ועל ידי מספר מענק CONACyT: 236908 לרוברטו דומינז. קרלוס-קמילו סילבה הוא דוקטורנט מתוכנית דה דוקטורדו en Ciencias Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM) ונתמך על ידי הקונז'ו הלאומי דה סינסיה y Tecnología (מספר גרנט: 294555).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 μL Hamilton syringes	Hamilton	80314
21 G x 1" stainless steel hypdermic needle	BD	305165
23 G x 1" stainless steel hypdermic needle	BD	305145
30 G x 1/2" stainless steel hypdermic needle	BD	305106
Artificial cerebrospinal fluid	BASi	MD-2400
Bone trimer	Fine Science Tools	16152-12
Burr for micro drill	Fine Science Tools	19007-05
Clipper	Wahl
Cut-off disc	Dremel	SM5010
Cutting tweezers	Truper	17367
Cyanocrylate glue	Kola loka	K-1
Dental cement	Nic Tone
Enrofloxasin	Senosiain
Eosin	Sigma	E4009
Estereoscope	Zeiss
Extra fine Bonn scissors	Fine Science Tools	14084-08
Face mask	Lanceta HG	60036
Graefe Forceps	Fine Science Tools	11050-10
Hematoxilin	Sigma	H3136
Hemostats	Fine Science Tools	13008-12
Hot bead sterilizer	Fine Science Tools	18000-45
Hydrochloric acid	Sigma	320331
Hypromelose artificial tears	Sophia Labs	8950015
Isoflurane	Pisa Agropecuaria
Meloxicam	Aranda	1183
Microinjection pump	KD Scientific	788380
Monomer	Nic Tone
Mototool	Dremel	3000
Nitrile gloves	Lanceta HG	69028
Non-Rupture Ear Bars	David Kopf Instruments	855
Poly-L lysine	Sigma	P4707
Povidone-iodine	Dermo Dine
Povidone-iodine with soap	Germisin espuma
Pressure tweezers	Truper	17371
Rat anesthesia mask	David Kopf Instruments	Model 906
Saline solution	PISA
Scalpel	Fine Science Tools	10004-13
Scalpel blade	Fine Science Tools	10015-00
Sodium pentobarbital	Pisa Agropecuaria
Standard electrode holder	David Kopf Instruments	1770
Stainless steel wire	American Orthodontic	856-612
Stereotaxic apparatus	David Kopf Instruments	Model 900LS
Surgical Sissors	Fine Science Tools	14001-12
Teflon connectors	Basi	MD-1510
Teflon tubing	Basi	MF-5164
Tetrodotoxin	Alomone labs	T-500
Vaporizer	Kent scientific	VetFlo

References

Herbison, A. E. Control of puberty onset and fertility by gonadotropin-releasing hormone neurons. Nature Reviews Endocrinology. 12 (8), 452-466 (2016).
Fink, G., Conn, M., Freeman, E. Neuroendocrine Regulation of Pituitary Function. Neuroendocrinology in Physiology and Medicine. , 107-133 (2000).
Herbison, A. E. The Gonadotropin-Releasing Hormone Pulse Generator. Endocrinology. 159 (11), 3723-3736 (2018).
Morello, H., Taleisnik, S. Changes of the release of luteinizing hormone (LH) on the day of proestrus after lesions or stimulation of the raphe nuclei in rats. Brain Research. 360 (1-2), 311-317 (1985).
Slusher, M. A., Critchlow, V. Effect of Midbrain Lesions on Ovulation and Adrenal Response to Stress in Female Rats. Experimental Biology and Medicine. 101 (3), 497-499 (1959).
Sawyer, C. H., Haun, C. K., Hilliard, J., Radford, H. M., Kanematsu, S. Further Evidence for the Identity of Hypothalamic Areas Controlling Ovulation and Lactation in the Rabbit. Endocrinology. 73 (3), 338-344 (1963).
Schiavi, R., Jutisz, M., Sakiz, E., Guillemin, R. Stimulation of Ovulation by Purified LH-Releasing Factor (LRF) in Animals Rendered Anovulatory by Hypothalamic Lesion. Experimental Biology and Medicine. 114 (2), 426-429 (1963).
Bagga, N., Chhina, G. S., Mohan Kumar, V., Singh, B. Cholinergic activation of medial preoptic area by amygdala for ovulation in rat. Physiology & Behavior. 32 (1), 45-48 (1984).
Barraclough, C. A., Yrarrazaval, S., Hatton, R. A Possible Hypothalamic Site of Action of Progesterone in the Facilitation of Ovulation in the Rat. Endocrinology. 75 (6), 838-845 (1964).
Critchlow, V. Blockade of ovulation in the rat by mesencephalic lesions 1, 2. Endocrinology. 63 (5), 596-610 (1958).
Terasawa, E., Wiegand, S. J. Effects of Hypothalamic Deafferentation on Ovulation and Estrous Cyclicity in the Female Guinea Pig. Neuroendocrinology. 26 (4), 229-248 (1978).
Halász, B., Köves, K., Molnár, J. Neural control of ovulation. Human Reproduction. 3 (1), 33-37 (1988).
Narahashi, T. Pharmacology of tetrodotoxin. Journal of Toxicology: Toxin Reviews. 20 (1), 67-84 (2001).
Narahashi, T., Moore, J. W., Scott, W. Tetrodotoxin blockage of sodium conductance increase in lobster giant axons. The Journal of General Physiology. 47 (5), 965-974 (1964).
Narahashi, T., Deguchi, T., Urakawa, N., Ohkubo, Y. Stabilization and rectification of muscle fiber membrane by tetrodotoxin. American Journal of Physiology-Legacy Content. 198 (5), 934-938 (1960).
Narahashi, T. Chemicals as tools in the study of excitable membranes. Physiological Reviews. 54 (4), 813-889 (1974).
Ritchie, J. M., Rogart, R. B. The binding of saxitoxin and tetrodotoxin to excitable tissue. Reviews of Physiology, Biochemistry and Pharmacology. 79 (1), 1-50 (1977).
Bermudez-Rattoni, F., Introini-Collison, I. B., McGaugh, J. L. Reversible inactivation of the insular cortex by tetrodotoxin produces retrograde and anterograde amnesia for inhibitory avoidance and spatial learning. Proceedings of the National Academy of Sciences. 88 (12), 5379-5382 (1991).
Tang, X., Yang, L., Liu, X., Sanford, L. D. Influence of Tetrodotoxin Inactivation of the Central Nucleus of the Amygdala on Sleep and Arousal. Sleep. 28 (8), 923-930 (2005).
Klement, D., Pašt’alková, E., Fenton, A. A. Tetrodotoxin infusions into the dorsal hippocampus block non-locomotor place recognition. Hippocampus. 15 (4), 460-471 (2005).
Conejo, N. M., Cimadevilla, J. M., González-Pardo, H., Méndez-Couz, M., Arias, J. L. Hippocampal Inactivation with TTX Impairs Long-Term Spatial Memory Retrieval and Modifies Brain Metabolic Activity. PLoS ONE. 8 (5), 64749 (2013).
Grimm, J., Ronald, E. Dissociation of Primary and Secondary Reward-Relevant Limbic Nuclei in an Animal Model of Relapse. Neuropsychopharmacology. 22 (5), 473-479 (2000).
Hasegawa, H., et al. Inhibition of the preoptic area and anterior hypothalamus by tetrodotoxin alters thermoregulatory functions in exercising rats. Journal of Applied Physiology. 98 (4), 1458-1462 (2005).
Meyer, F., Louilot, A. Early Prefrontal Functional Blockade in Rats Results in Schizophrenia-Related Anomalies in Behavior and Dopamine. Neuropsychopharmacology. 37 (10), 2233-2243 (2012).
Rothfeld, J. M., Harlan, R. E., Shivers, B. D. Reversible disruption of lordosis via midbrain infusions of procaine and tetrodotoxin. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 25 (4), 857-863 (1986).
Silva, C., Cortés, G. D., Javier, C. Y., Flores, A., Domínguez, R. A neural circadian signal essential for ovulation is generated in the suprachiasmatic nucleus during each stage of the estrous cycle. Experimental Physiology. , (2019).
Paxinos, G., Watson, C. . The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates (7th Ed). , (2014).
Cora, M. C., Kooistra, L., Travlos, G. Vaginal Cytology of the Laboratory Rat and Mouse. Toxicologic Pathology. 43 (6), 776-793 (2015).
Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. Mouse Estrous Cycle Identification Tool and Images. PLoS ONE. 7 (4), 35538 (2012).
Wirtshafter, D., Asin, K., Kent, E. W. Simple technique for midline stereotaxic surgery in the rat. Physiology & Behavior. 23 (1), 409-410 (1979).
Kozai, T. D., Jaquins-Gerstl, A. S., Vazquez, A. L., Michael, A. C., Cui, X. T. Brain tissue responses to neural implants impact signal sensitivity and intervention strategies. ACS Chemical Neuroscience. 6 (1), 48-67 (2015).
Kazim, S. F., Enam, S. A., Shamim, M. S. Possible detrimental effects of neurosurgical irrigation fluids on neural tissue: An evidence based analysis of various irrigants used in contemporary neurosurgical practice. International Journal of Surgery. 8 (8), 586-590 (2010).
Miyajima, M., et al. Role of cerebrospinal fluid as perfusate in neuroendoscopic surgery: A basic investigation. Acta Neurochirurgica. 113, 103-107 (2012).
Mori, K., et al. Potential risk of artificial cerebrospinal fluid solution without magnesium ion for cerebral irrigation and perfusion in neurosurgical practice. Neurologia Medico-Chirurgica. 53 (9), 596-600 (2013).
Oka, K., Yamamoto, M., Nonaka, T., Tomonaga, M. The significance of artificial cerebrospinal fluid as perfusate and endoneurosurgery. Neurosurgery. 38 (4), (1996).
James, T. A., Starr, M. S. Effects of the rate and volume of injection on the pharmacological response elicited by intraingral microapplication of drugs in the rat. Journal of Pharmacological Methods. 1 (3), 197-202 (1978).
Freund, N., Manns, M., Rose, J. A method for the evaluation of intracranial tetrodotoxin injections. Journal of Neuroscience Methods. 186 (1), 25-28 (2010).
Zhuravin, I. A., Bures, J. Extent of the tetrodotoxin induced blockade examined by pupillary paralysis elicited by intracerebral injection of the drug. Experimental Brain Research. 83 (3), 687-690 (1991).
Myers, R. Injection of solutions into cerebral tissue: relation between volume and diffusion. Physiology and Behavior. 1 (2), 171-174 (1966).
Gonzalez-Perez, O., Guerrero-Cazares, H., Quiñones-Hinojosa, A. Targeting of deep brain structures with microinjections for delivery of drugs, viral vectors, or cell transplants. Journal of Visualized Experiments. (46), e2082 (2010).
McCluskey, L., Campbell, S., Anthony, D., Allan, S. M. Inflammatory responses in the rat brain in response to different methods of intra-cerebral administration. J Neuroimmunol. 194 (1-2), 27-33 (2008).
Cunningham, M. G., O'Connor, R. P., Wong, S. E. Construction and implantation of a microinfusion system for sustained delivery of neuroactive agents. Journal of VisualizedExperiments. (13), e716 (2008).
Akinori, A., Masamichi, S., Hiroshi, T. A new device for microinjection of drugs into the lower brain stem of conscious rats: Studies on site of action of morphine. Journal of Pharmacological Methods. 2 (4), 371-378 (1979).
Malpeli, J. G. Reversible inactivation of subcortical sites by drug injection. Journal of Neuroscience Methods. 86 (2), 119-128 (1999).
Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. Optogenetics in neural systems. Neuron. 71 (1), 9-34 (2011).
de Sousa, A. F., et al. Optogenetic reactivation of memory ensembles in the retrosplenial cortex induces systems consolidation. Proceedings of the Natural Academy of Sciences. 116 (17), 8576-8581 (2019).
Beppu, K., et al. Optogenetic countering of glial acidosis suppresses glial glutamate release and ischemic brain damage. Neuron. 81 (2), 314-320 (2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

163

This article has been published

Video Coming Soon

Keep me updated: