Desvendando o papel das áreas discretas do cérebro de rato na regulação da ovulação através da inativação reversível por microinjeções de tetrodotoxinas

Resumo

Este protocolo descreve a construção de um sistema de microinjeção de baixo custo, sua implantação estereotaxa em estruturas cerebrais profundas e o procedimento para microinjeções cronometradas de tetrodotoxina em ratos acordados e desenfreados. O objetivo é revelar a participação de estruturas hipotalâmicas na regulação da ovulação inibindo sua atividade neural.

Resumo

Muitas abordagens experimentais têm sido usadas para estudar o papel do cérebro na regulação da ovulação. Exemplos incluem a lesão e a desafeção de grupos neuronais, que são métodos invasivos que prejudicam permanentemente a integridade da área alvo. Esses métodos são acompanhados de efeitos colaterais que podem afetar a análise de mecanismos regulatórios agudos e temporais. A implantação estereotipada de cânulas-guia destinadas a regiões cerebrais específicas, seguidas de um período de recuperação, permite aos pesquisadores microinjetar diferentes drogas após o desaparecimento dos efeitos indesejados da cirurgia. A tetrodotoxina tem sido usada para determinar os papéis de várias áreas cerebrais em diversos processos fisiológicos, pois inibe transitoriamente os potenciais de ação dependentes de sódio, bloqueando assim toda a atividade neural na região alvo. Este protocolo combina este método com estratégias para a avaliação do ciclo estrous e da ovulação para revelar o papel de regiões cerebrais discretas na regulação da ovulação em determinados momentos de qualquer estágio do ciclo estrous. Ratos acordados e desenfreados(Rattus norvegicus) foram usados para evitar os efeitos de bloqueio que os anestésicos e os hormônios do estresse exercem sobre a ovulação. Este protocolo pode ser facilmente adaptado a outras espécies, alvos cerebrais e agentes farmacológicos para estudar diferentes processos fisiológicos. Melhorias futuras neste método incluem o projeto de um sistema de microinjeção usando capilares de vidro de pequeno diâmetro em vez de cânulas-guia. Isso reduzirá a quantidade de tecido danificado durante a implantação e diminuirá a disseminação das drogas infundidas fora da área alvo.

Introdução

A ovulação é o processo pelo qual um ou mais oócitos maduros são liberados dos ovários uma vez que cada ciclo estral/menstrual. Como todas as espécies de mamíferos dependem da produção de gametas para procriar, a compreensão dos mecanismos que regulam a ovulação tem um enorme impacto em áreas que vão da biomedicina, da pecuária e da manutenção de espécies ameaçadas de extinção. A ovulação é regulada pelo eixo hipotalâmico-pituitário-ovariano, que envolve várias áreas hipotalâmicas e extra-hipotalâmicas, os gonadotropes na hipófise anterior e as células trómia e granulosa que, juntamente com os oócitos, formam os folículos ovarianos dentro dos ovários¹.

Os folículos ovarianos crescem, desenvolvem-se e eventualmente ovulam em resposta à secreção tônica e afásica do hormônio estimulante do folículo e do hormônio luteinizador, os dois gonadotropinas secretados pelos gonadotropos. O padrão de secreção de gonadotropina é fundamental para o desenvolvimento folicular adequado e a ovulação e é regulado pelo hormônio liberador de gonadotropina (GnRH)^1,2. Este neuropeptídeo é sintetizado por neurônios espalhados pelo diencephalon basal e, em seguida, secretado para a vasculatura portal que liga o hipotálamo e a hipófise anterior. A atividade secreta dos neurônios GnRH é, por sua vez, modulada pela entrada sináptica decorrente de diversas estruturas cerebrais. Essas estruturas transmitem informações sobre o estado do ambiente externo e interno do organismo, incluindo a disponibilidade de alimentos, o comprimento do fotoperíodo e a concentração de hormônios no sangue. Nesse sentido, eles moldam o padrão reprodutivo de cada espécie e os papéis específicos dessas estruturas devem ser determinados para compreender adequadamente os mecanismos que regem a ovulação. Como exemplo, foi demonstrado que a flutuação nos níveis de estradiol durante o ciclo estrous regula a secreção do GnRH; no entanto, os neurônios GnRH não expressam a isoforme do receptor estradiol necessário para detectar tais alterações. Duas populações de neurônios expressando esses receptores estão localizadas na região periventricular rostral do terceiro ventrículo e no núcleo arcuato, respectivamente, e sinapses stablish com neurônios GnRH. Há evidências que sugerem que esses neurônios interpretam a concentração de estradiol e, em seguida, estimulam a atividade de neurônios GnRH liberando kisspepíntina, um potente indutor da secreção GnRH³.

Experimentos envolvendo lesões hemicas ou químicas, bem como a desafetração mecânica, permitiram aos pesquisadores determinar o envolvimento de várias estruturas cerebrais na regulação da ovulação^{4,5,6,7,8,9,10,11,12} . Esses experimentos, no entanto, têm a desvantagem de serem invasivos e traumáticos, exigindo vários dias de recuperação antes de avaliar os efeitos do tratamento, impedindo a análise dos efeitos agudos do tratamento. Além disso, afetam permanentemente as áreas alvo e interrompem outros processos fisiológicos a longo prazo. Devido a esses problemas, os resultados desses experimentos são geralmente obscurecidos pelos mecanismos compensatórios homeostáticos no corpo do animal e extrair informações precisas sobre a dinâmica regulatória temporal em que a área está envolvida é bastante difícil.

A microinjeção de drogas que interrompem transitóriamente a atividade dos neurônios através de cânulas guia é uma alternativa adequada que supera as desvantagens mencionadas acima. As cânulas podem ser colocadas em qualquer região cerebral por uma cirurgia estereotaxa, permitindo que o pesquisador inicie o tratamento medicamentoso após os efeitos confusos da cirurgia desaparecerem. A microinjeção cronometrada dos medicamentos permite que os pesquisadores testem hipóteses sobre a contribuição da região para uma determinada etapa do processo e podem ser realizadas em animais acordados ou em movimento livre. Uma variedade de drogas, incluindo anestésicos locais, agonistas, antagonistas, agonistas inversos e toxinas biológicas como a tetrodotoxina (TTX) podem ser microinjetadas na região de interesse em momentos específicos.

TTX é uma toxina biológica sintetizada por bactérias que vivem no corpo do baiacu, bem como outros vertebrados e invertebrados. O TTX silencia a atividade neural através do bloqueio seletivo e transitório dos canais de sódio, o que resulta na inibição dos potenciais de ação dependentes do sódio. Na presença do TTX, as células experimentam uma alteração na fase de despolarização e, portanto, não são excitáveis, mas permanecem vivas. O efeito de bloqueio do TTX é explicado por sua composição molecular: um grupo de guanidinium é capaz de passar pelo aspecto extracelular do canal de sódio, mas o resto da molécula não pode passar devido ao seu tamanho, por isso fica preso e bloqueia o canal^{13,14,15,16,17} . O mecanismo de ação do TTX permitiu seu uso como ferramenta para estudar o sistema nervoso tanto in vitro quanto in vivo. A injeção intracerebral dessa toxina tem sido usada para estudar o papel de áreas cerebrais discretas em diversos processos como retenção de memória¹⁸, sono e excitação^19,reconhecimento do local^20,navegação espacial^21,abuso de drogas^22,termoregulação^23,desenvolvimento da esquizofrenia²⁴, comportamento sexual²⁵ e regulação da ovulação²⁶ entre outros. Neste protocolo descrevemos os efeitos na ovulação da inativação transitória de núcleos hipotalâmicos por microinjeção TTX em ratos acordados e desenfreados.

Protocolo

Os procedimentos envolvendo animais foram aprovados pelo Comitê de Ética da Lei de Estudios Superiores Zaragoza, unam. Esta instituição opera em estrita conformidade com as regras mexicanas para o manejo de animais, Norma Oficial: NOM-062-ZOO-1999, que concorda com as diretrizes internacionais.

1. Construção de cânulas bilaterais

1. Extrair o eixo de aço inoxidável do cubo de duas agulhas hipodérmicas de 23 G usando pinças de pressão e, em seguida, remover qualquer cola restante usando uma lâmina de bisturi.
2. Desenhe uma linha de 15 mm além da extremidade cega dos eixos com um marcador permanente fino. Use pinças de corte para remover as extremidades chanfradas.
3. Segure os segmentos de 15 mm com hemostatas finos e pressione-os perpendicularmente com um disco de corte anexado a uma ferramenta rotatória até que sejam obtidos segmentos de tubos de 14 mm. Esta etapa é feita para eliminar a porção ocluída dos eixos, criando extremidades abertas e contundentes. Por fim, insira uma agulha de 30 G através dos segmentos para eliminar qualquer obstrução interna.
4. Determine a distância entre as estruturas de interesse nos hemisférios esquerdo e direito do cérebro com o auxílio de um atlas cerebral²⁷. Use argila de molde para fixar os dois segmentos de 14 mm a um slide de microscópio e garantir que ambos estejam no mesmo nível horizontal. Observe através de um micrômetro ocular (10x) e ajuste os segmentos com pinças finas até que a distância desejada seja obtida.
5. Misture a pasta de solda com 10% de ácido clorídrico em uma proporção de 2:1 e adicione uma gota da mistura 2 mm abaixo da extremidade contundente dos segmentos. Soldar ambos os segmentos com um único ponto usando um ferro de solda e fio de solda de 0,5 mm de diâmetro. Certifique-se de que a solda não obstrua o lúmen dos segmentos.
6. Crie um suporte para anexar a cânula ao suporte estereotaxic cortando um segmento de aço inoxidável resiliente de 0,3 mm. Use argila de molde para colocar 2 mm do fio em contato com o ponto de solda anterior e o resto deitado acima da extremidade cega das cânulas. Solde o fio para as cânulas.
7. Limpe a superfície das cânulas com 70% de etanol para remover o excesso da pasta de solda. Lave o interior das cânulas com água estéril para remover partículas metálicas. Repita este processo até que nenhuma partícula possa ser detectada sob o microscópio a uma ampliação de 10x.

2. Construção de obturadores e tampas

1. Para construir os obturadores corte dois segmentos de 16 mm de fio macio de aço inoxidável redondo (0,35 mm de diâmetro). Segure uma cânula bilateral com hemostats, perpendicular a um banco de laboratório, e insira um desses segmentos em cada cânula até chegar ao banco. Dobre o remanescente em um ângulo de 90°.
2. Para as tampas corte dois segmentos de 2 mm de tubos de silicone (diâmetro interno=0,76 mm) e aplique uma gota de cola de silício em uma das extremidades de cada segmento. Não deixe a cola entrar na tubulação. Deixe secar por pelo menos 24 horas.

3. Construção de microinjetores

1. Repita o passo 1.1, usando agulhas hipodérmicas de 30 G para criar os eixos.
2. Desenhe uma linha de 18,5 mm além da extremidade cega dos eixos e remova o remanescente das extremidades chanfradas com pinças de corte.
3. Repita o passo 1.1 com uma única agulha de 23 G para construir adaptadores cortando dois segmentos de 6 mm de comprimento a partir da extremidade contundente.
4. Elimine as porções ocluídas dos segmentos de 6 mm pressionando-as perpendicularmente contra o disco de corte até que dois adaptadores de 4 mm sejam obtidos. Elimine qualquer obstrução interna.
5. Insira a extremidade chanfrada dos segmentos de 30 G nos adaptadores. Olhe através de um estereómico para garantir que o fim de ambos, segmentos e adaptadores, estejam no mesmo nível. Aplique cola de cianoacrilato na articulação distal usando um cotonete e deixe secar por 15 minutos.
6. Mergulhe dois conectores de tubos de Teflon em 70% de etanol por 5 minutos e, em seguida, conecte-os aos microinjetores através dos adaptadores. Aguarde até que o diâmetro dos conectores diminua por pelo menos 24 horas e, em seguida, esterilize o microinjetor com um método de baixa temperatura para evitar danos aos conectores (recomenda-se a esterilização de óxido de etileno).

4. Manutenção animal e manchas vaginais

1. Use ratos cíclicos adultos encapuzados(Rattus norvegicus, CEPA CIIZ-V) pesando entre 230 e 260 gramas. Abriga os ratos em grupos de quatro em gaiolas padrão de polipropileno em uma sala com um fotoperíodo claro-escuro 14:10. A temperatura e a umidade em 22 ± 2 °C e em 40%, respectivamente. Fornecer comida e água ad libitum.
2. Faça manchas vaginais todos os dias entre 10:00 e 12:00 h.
   1. Esterilize um laço bacteriológico modificado com um diâmetro interno de 1 mm usando uma lâmpada de álcool e esfrie-a com água estéril. Segure o rato com uma aderência segura e introduza 5 mm do laço bacteriológico na vagina, tocando suas paredes internas. Remova o laço bacteriológico. Se for bem sucedida, uma queda nebulosa será vista na ponta. Coloque essa gota em um slide de microscópio.
   2. Repita este processo para cada rato esterilizando e resfriando o laço entre cada animal.
   3. Após as gotas secar, manche com hematoxilina-eosina e observe as amostras sob um microscópio em 10x.
   4. Determinar a proporção de leucócitos, células nucleadas epiteliais e células queratinizadas em cada mancha e classificá-la de acordo com os critérios dos estágios de ciclo estrous relatados na Figura 1, que concorda com a literatura anterior^28,29.

5. Implantação estereotíxica das cânulas

NOTA: Realizar a implantação das cânulas após uma cirurgia estereotaxa asséptica regular e cumprindo normas institucionais.

1. Antes da cirurgia
   1. Esterilizar instrumentos cirúrgicos, cânulas, parafusos cirúrgicos, obturadores, gaze e cotonetes de algodão de madeira 24 horas antes da cirurgia usando uma autoclave a vapor. Esterilize as pontas dos instrumentos metálicos entre cirurgias consecutivas limpando-as com peróxido de hidrogênio de 10%, seguido de água e, em seguida, coloque-os em um esterilizador de contas quentes.
   2. Prepare as áreas de trabalho e o instrumento estereotaxico antes de retirar o animal da sala de aula. Prepare o animal para cirurgia em uma área que está localizada o mais longe possível da mesa de cirurgia para evitar contaminação durante o procedimento.
   3. Limpe as áreas de preparação e cirurgia com 70% de etanol seguido de aplicação de uma solução de cloreto de 10% por dez minutos. Limpe a base, a armação e os manipuladores do instrumento estereotax com 70% de etanol e esterilize as pontas das barras de ouvido usando um esterilizador de contas quentes e esfrie-as antes da cirurgia.
   4. Realizar a cirurgia usando um jaleco dedicado, máscara facial, capô da cabeça, mangas cirúrgicas, capas de sapato e luvas cirúrgicas. Peça ao assistente para preparar os animais para a cirurgia e verificar seu estado geral durante o procedimento.
   5. Coloque a cânula no suporte estereotaxista. Peça ao assistente para trazer o primeiro animal a ser operado para a sala. Selecione ratos em diestrus para cirurgia, uma vez que observações do nosso laboratório indicam que esses animais recuperam ciclos estrous adequados mais rápido do que ratos operados em outros estágios, provavelmente porque a resposta ao estresse muda junto com o ciclo estrous.
   6. Pesar o animal, e induzir anestesia com 4% de isoflurane em 100% oxigênio dentro de uma câmara de indução para ratos ligados a um vaporizador de isoflurane. Para evitar estressar os animais, não preenchia a câmara. Confirme um plano cirúrgico de anestesia verificando a dilatação da pupila e a perda de dor medida pelos testes de pinça da cauda e ouvido após observar a perda do reflexo de direito.
      1. Anestesiar o rato por uma injeção intraperitoneal de uma mistura de cetamina (100 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg) se um vaporizador de isoflurano não estiver disponível.
   7. Retire o rato da câmara de indução e use um cone de nariz na mesa de preparação para manter os efeitos da anestesia com 2,5% de isoflurano em 100% de oxigênio. Corte o cabelo do couro cabeludo com cortadores e remova os cabelos soltos com um rolo de fiapos. Injete uma dose subcutânea pré-operatória de 2 mg/kg de Meloxicam e 5 mg/kg de Enrofloxacina como anti-inflamatório/analgésico não esteroide e antibiótico, respectivamente.
      1. Aplique lágrimas artificiais de hispromellose em cada olho para evitar a proficação durante a cirurgia.
   8. Monte o animal no instrumento estereotaxico acima de uma almofada de aquecimento usando barras de ouvido não-ruptura e uma máscara de anestesia. Ajuste o grampo do nariz para garantir que a cabeça do animal esteja plana. Realize um esfoliante cirúrgico na área raspada alternando entre povidone-iodo com sabão e 70% de etanol uma vez e, em seguida, usando povidone-iodo e 70% etanol duas vezes. Insira um termômetro retal para registrar a temperatura do animal durante o procedimento e, em seguida, cubra-o com um campo cirúrgico estéril.
2. Durante a cirurgia
   1. Use um bisturi para fazer uma incisão de 2 cm na pele e no músculo no meio da área raspada. Remova o periosteum do crânio usando um cotonete revestido com peróxido de hidrogênio de 2% para revelar bregma ou lambda, os marcos que serão usados para calcular as coordenadas alvo. Seque o crânio com ar para uma melhor visualização do marco.
   2. Use os manipuladores do instrumento estereotaxic para mover a cânula para uma posição diretamente acima do marco de escolha. Registre as coordenadas anterior-posterior e medial-lateral do instrumento estereotaxic e use-as para calcular as coordenadas da área alvo de acordo com o atlas cerebral²⁷.
   3. Coloque as coordenadas calculadas no instrumento estereotaxista e coloque a ponta da cânula na superfície do crânio. Registre a coordenada dorsal-ventral e use-a para calcular a profundidade da área alvo.
   4. Remova o braço do manipulador desparafusando-o da armação. Use uma rebarba dentária presa a uma ferramenta rotativa a uma velocidade de 15.000 rpm para deixar uma marca no local onde será realizada a craniotomia. Em seguida, use a rebarba para fazer três buracos, formando um triângulo equilátero ao redor da marca. Estes buracos não devem perfurar o crânio. Insira os parafusos cirúrgicos nos orifícios, garantindo que estejam bem colocados.
   5. Faça a craniotomia larga o suficiente para acomodar a distância entre as áreas alvo em cada hemisfério. Deve ser o menor de diâmetro possível, mas grande o suficiente para permitir o abaixamento da cânula sem tocar nas bordas do crânio, uma vez que isso modificará a trajetória. Realize a craniotomia gradualmente, aplicando a menor pressão possível. O crânio do roedor tem apenas alguns milímetros de espessura e é fundamental preservar a integridade dos tecidos abaixo.
   6. Uma vez visível a dura-mater, use uma agulha estéril de 21 G com a ponta curvada em um ângulo de 90° para remover lascas de osso e fazer um corte anterior-posterior nas meninges. Use Wirtshafter e colegas³⁰ técnica para evitar danos ao seio sagital superior se a área alvo estiver localizada perto da linha média.
      1. Coloque o suporte com a cânula na moldura e use o manipulador dorsal-ventral para alcançar a coordenada ventral. Verifique se a agulha não toca nas bordas enquanto desce e aumenta o diâmetro da craniotomia, se necessário.
         NOTA: É importante que a ponta das cânulas-guia tenha como alvo uma região que varia de 0,5 a 2,0 mm acima da região de interesse. Isso se deve à reação inflamatória do cérebro em resposta à introdução de corpos estranhos e à destruição do tecido. Isso é especialmente crítico se a região de interesse for pequena e a distância de trabalho deve ser calculada empiricamente com antecedência.
   7. Aplique cimento dentário para prender a cânula ao crânio e deixe secar. Certifique-se de que o cimento dental não cubra a extremidade contundente da cânula, pois isso irá obstruí-lo irreversivelmente. Espere até o cimento se solidificar completamente.
   8. Insira os obturadores para evitar maiores obstruções e para garantir a patência durante o estudo. Coloque a tampa de silicone para evitar contaminação.
3. Após a cirurgia
   1. Substitua os fluidos perdidos por uma injeção intraperitoneal de 1,0 mL de solução salina estéril a uma temperatura fisiológica. Coloque o animal em uma gaiola de recuperação com suporte térmico até que ele se recupere da anestesia. Verifique a temperatura e a frequência cardíaca/respiratória do animal periodicamente. Os efeitos isoflurane duram alguns minutos após a interrupção do fluxo de gás, enquanto os efeitos cetamina/xilazina duram 40-50 min.
   2. Fornecer injeções pós-operatórias dos antibióticos, analgésicos e anti-inflamatórios (nas mesmas doses e rotas indicadas antes) por 48-72 h e inspecionar os animais diariamente para o resto do experimento. Denuncie qualquer sinal de dor, estresse ou perda de peso para os serviços veterinários ou para um membro treinado do laboratório. Não realize qualquer outra manipulação para os ratos durante este período.
   3. Comece a tomar manchas vaginais após o tratamento pós-operatório e continue fazendo isso até que o animal mostre três ciclos estrous consecutivos de quatro dias.
      NOTA: Cateteres de jugular crônicos podem ser implantados cirurgicamente, permitindo que o pesquisador pegue amostras de sangue em série para analisar a secreção de hormônios como estradiol, progesterona, testosterona, hormônio luteinizador, hormônio estimulante do folículo e corticosterona. Recomendamos colocar esse cateter assim que o animal se recuperar da cirurgia cerebral, uma vez que isso melhorará a taxa de sobrevivência, evitando também entupimento do cateter que pode resultar de um longo tempo de recuperação.

6. Manuseio de tetrodotoxinas e preparação de soluções

ATENÇÃO: O TTX é uma das substâncias mais tóxicas conhecidas. Atua em músculos esqueléticos e tecido nervoso. Intoxicação por contato é improvável, mas qualquer ferida aberta é um caminho potencial para a inoculação no corpo. As principais preocupações ao trabalhar com TTX são a punção da pele com instrumentos afiados que estiveram em contato com a toxina e a geração de aerossóis que podem atingir a boca, olhos e membranas mucosas. Dependendo da dose, o TTX pode ser letal se inalado, engolido ou inoculado pela pele. Causará forte irritação dos olhos. O LD50 foi testado em camundongos por administração oral e intravenosa e é de 334 μg/kg e 7,3 μg/kg, respectivamente. Não há antitoxina disponível no momento.

NOTA: A substância inativante é um NaOCl de 1,0% com ou sem 0,25 N NaOH, ou uma solução de alvejante de 10%. A inativação completa ocorre após 30 min de exposição. O TTX não pode ser completamente inativado por qualquer derivado de cloreto em uma concentração abaixo de 10%, por autoclaving nem por esterilização de calor seco a uma temperatura inferior a 500 °F. Todos os procedimentos envolvendo TTX devem ser realizados por dois indivíduos experientes usando pares internos e externos de luvas de nitrito, jaleco dedicado, óculos de segurança, máscara facial descartável, sapatos fechados e calças de comprimento integral.

1. Preparação da solução de estoque
   1. Coloque uma almofada encharcada com a substância inativante no capô da fumaça para evitar contaminação em caso de derramamento. Certifique-se de que o capô da fumaça está funcionando corretamente antes de começar. Prepare um recipiente com a solução de inativação para descartar pontas de pipeta.
   2. Resuspend TTX citrate lyophilized em pó de acordo com as instruções do fabricante por uma titulação extremamente cuidadosa e lenta com fluido cerebrospinal artificial estéril, enxaguando as paredes do frasco no processo. Evite a formação de espuma e aerossol. Siga uma técnica asséptica para evitar a contaminação da solução TTX, pois ela será injetada no cérebro de animais vivos. Use uma seringa com uma agulha em vez de uma micropipette se seus frascos TTX tiverem uma membrana externa para evitar a formação de aerossol.
   3. Alíquotar a solução de estoque em micro tubos estéreis. Faça alíquotas o mais pequenas possível, uma vez que ciclos de congelamento/descongelamento podem alterar a estabilidade das moléculas. Não encha mais da metade dos tubos porque a água aumenta em volume quando congelado, o que pode levar à abertura da tampa e contaminação do tubo e outras amostras armazenadas no recipiente.
   4. Descontaminar o exterior dos tubos e as superfícies onde o TTX foi usado com a substância inativante. Armazene os tubos a -20 °C em uma caixa de frasco dentro de um recipiente secundário.
2. Diluir a solução de estoque para uma concentração de trabalho
   1. Prepare soluções recém-diluídas no dia em que serão usadas, uma vez que as soluções diluídas são menos estáveis. Coloque uma almofada encharcada com a substância inativante no capô da fumaça e um micro tubo-rack em cima dele. Prepare um recipiente com a solução de inativação para descartar pontas de pipeta.
   2. Pipetar a solução de estoque na parte inferior de um microtubo estéril e, em seguida, adicionar a quantidade calculada de fluido cerebrospinal artificial para alcançar uma concentração de 10 ng/μL. Como descrito para a re-suspensão do pó TTX, realize uma titulação extremamente cuidadosa e lenta, enxaguando as paredes do frasco e evitando a formação de espuma e aerossol.
   3. Se as amostras que estiveram no congelador serão usadas para microinjeção, devem ser permitidas a equilíbrio à temperatura ambiente por pelo menos uma hora antes do experimento.

7. Microinjeção de soluções TTX ou veículos em ratos em movimento livre

1. Configure a bomba de microinjeção com a taxa de infusão e tempo total de injeção de acordo com o experimento. Calcule esses parâmetros com antecedência considerando o volume ocupado pela estrutura alvo e a quantidade de solução a ser injetada. Para este experimento, injete 200 nL de solução a uma taxa de 50 nL por minuto por um tempo total de infusão de 4 minutos.
2. Encha duas seringas Hamilton de 10 μL com água destilada estéril, insira um pedaço de tubo estéril de Teflon no conector de tubo de cada microinjetor, garantindo que o comprimento da tubulação não restrinja o movimento do rato (a tubulação pode ser esterilizada usando óxido de etileno).
3. Coloque uma almofada encharcada com a substância inativante e um filme de 2 cm x 2 cm quadrados de parafina acima dele. Pipeta uma quantidade suficiente de TTX para encher a agulha do injetor e 1 cm da tubulação acima do filme. Absorva a gota TTX retraindo suavemente o êmbolo. Monte as seringas na bomba de microinjeção e use seus controles para manipular o êmbolo até que uma gota de TTX possa ser vista na ponta de cada microinjetor. Descarte as gotas na almofada encharcada com substância inativante.
4. Selecione os ratos que serão microinjetados. Use apenas ratos que apresentaram pelo menos três ciclos consecutivos após a cirurgia. Considere seu estágio do ciclo e a hora do dia. Tanto o tempo quanto o estágio dependem da hipótese específica que você vai testar, para este experimento 14:00 horas de proestrus selecionado, uma vez que os sinais pré-iovulatórios nervosos que regem a secreção gnrh phasic ocorrem neste momento. Transporte-os para a sala onde a injeção ocorrerá dentro de suas próprias gaiolas de habitação para evitar problemas.
5. Segure o rato com uma aderência firme, remova a tampa e os obturadores das cânulas, insira os microinjetores nas cânulas guia e devolva o animal para a gaiola.
6. Ligue a bomba e espere até que a microinjeição termine. Observe o animal durante esse período, a fim de detectar um possível descolamento dos microinjetores e evitar a torção dos tubos de Teflon.
7. Deixe os microinjetores no lugar por dois minutos adicionais para evitar o refluxo da solução. Remova-os, limpe a superfície do implante com solução antisséptica de iodopovidona, evitando seu fluxo dentro das cânulas-guia. Insira obturadores estéreis, coloque a tampa e devolva o animal para a sala da colônia. Observe o animal periodicamente para detectar quaisquer possíveis efeitos colaterais da droga.
8. Ligue a bomba com os mesmos parâmetros da microinjeção e verifique se há um fluxo correto para garantir que a patência do sistema seja retida durante o procedimento.
9. Pressione o êmbolo para expulsar o TTX/veículo do microinjetor até que a bolha de ar atinja a ponta da agulha. Lembre-se do TTX em seu microtubo. Encha a seringa com água destilada e use-a para limpar o interior dos tubos. Descarte a água na substância inativante e repita esse processo pelo menos três vezes. Limpe o exterior das seringas, tubos e microinjetores com um pano encharcado na substância inativante.

8. Eutanásia e processamento de tecidos

1. No dia das estrus previstas ou vaginalmente confirmadas, injete no rato uma overdose intraperitoneal de pentobarbital de sódio (75 mg/kg). Verifique se há perda de consciência e injete 200 nL de uma solução azul de metileno de 0,5% através das cânulas guia, conforme descrito nas etapas 7,1 a 7,9. Verifique se há sinais de dor usando o teste de beliscão do dedo do pé ou da cauda e, se nenhum for detectado, decapite o rato usando uma guilhotina de roedor.
2. Use uma tesoura para abrir a cavidade abdominal e encontrar os ovários. Use uma tesoura de íris fina para dissecar cada ovário, cortando na junção utero-tubal com o auxílio de uma lupa. Evite danificar o oviduto porque isso resultará na perda de oócitos.
3. Coloque os ovários sob um estereómico e use uma lâmina de barbear para remover todo o tecido adiposo sem danificar o órgão. Remova o oviduto de cada ovário cortando com o lâmina de barbear o mais longe possível da região da ampola. Monte cada oviduto em um slide diferente e cubra com uma gota de água. Armazene os ovários em um frasco contendo a solução de Bouin.
4. Seque suavemente os ovidutos com uma toalha de papel absorvente e procure a ampola sob o estereóscópio. Com a mão não dominante, segure o oviduto no lugar, beliscando longe da ampola com uma agulha de 23 G, em seguida, use outra agulha de 23 G na mão dominante para fazer uma incisão de 1 mm na região média da ampola. Os complexos cumulus-oócitos se projetarão da incisão como uma gota de fluido viscoso(Figura 2D). Use a agulha na mão dominante para puxar suavemente e lentamente a gota longe do oviduto. Pressione o remanescente da ampola para garantir que não restem oócitos dentro. Extrair os oócitos dos ovidutos o mais rápido possível, pois a dessecação do oviduto irá prender irreversivelmente os oócitos dentro.
5. Remova o oviduto do slide e espere até que a gota de fluido contendo os oócitos secar. Manche a amostra com hematoxilina-eosina. Use meio de montagem para cobrir o deslizamento. Observe sob o microscópio (10x) para determinar o número de oócitos derramados por cada ovário.
   NOTA: O sacrifício por perfusão cardíaca não é realizado neste protocolo, uma vez que os oócitos ficariam presos nos ovidutos e, portanto, métodos histológicos seriam necessários para avaliar a ovulação. Se o usuário tiver que perfundir para analisar outros tecidos, os ovários podem ser removidos primeiro e as artérias descendentes presas com hemostatas grossas abaixo do fígado para evitar o vazamento de fixação.
6. Remova a pele da cabeça e submerse o crânio em um recipiente de vidro com uma solução de 10% de formalina. Permita a fixação da cabeça por pelo menos dez dias antes de remover a cânula para evitar distorções do tecido. Para remover a cânula, use uma tesoura para desprender todos os músculos da região do crânio que a circunda. Corte entre os ossos nasais e frontais com aparadores ósseos e, em seguida, remova o osso occipital. Insira a ponta dos aparadores no foie magnum e comece a cortar através das cristas sagidas atingindo o remanescente do osso nasal.
7. A região isolada da parte superior do crânio deve conter os ossos frontal e parietal. Remova a cânula implantada presa ao topo do crânio puxando-a lentamente para cima perpendicularmente para a cabeça. Corte qualquer porção anexada das meninges com uma tesoura de íris fina para evitar a deformação do cérebro.
8. Faça um corte anterior-posterior nas meninges e coloque-as de lado para remover o cérebro da base do crânio. Insira pinças sem corte abaixo das lâmpadas olfativas e puxe suavemente o cérebro até que os nervos ópticos estejam visíveis. Corte os nervos com uma tesoura de íris fina e puxe o cérebro. Preserve o cérebro em solução fixa.
9. Obtenha seções de 50 μm de espessura do cérebro usando um vibratome, monte-as em lâminas revestidas de poli-L-lysina (0,1% em água destilada) e manche com a técnica nissl. Observe os slides sob o microscópio (10x) para determinar a posição final das cânulas (Figura 2A-2C) e a propagação do corante com o auxílio de um atlas cerebral de rato²⁷.

Resultados

O protocolo descrito acima foi testado avaliando os efeitos de um único TTX ou veículo (fluido cerebrospinal artificial; ACSF) microinjeção em um dos dois núcleos diferentes conhecidos por estarem envolvidos na regulação da ovulação no rato: o supraciasmático e o núcleo arcuato. O núcleo supraciasmático foi escolhido por conter o marca-passo circadiano central em mamíferos. Está envolvida na regulação de eventos cíclicos como secreção de gonadotropinas. O núcleo arcuato foi escolhido porque contém u...

Discussão

Este artigo descreve um método para inativar transitoriamente, a qualquer momento, uma região discreta no cérebro de ratos acordados e sem restrições. Um método simples para rastrear seu ciclo estrous e avaliar a ovulação também é fornecido. Este protocolo permite uma análise direta da contribuição de regiões cerebrais específicas aos mecanismos que impulsionam a ovulação, comparando o desfecho ovulatório de animais tratados com TTX com os tratados com veículos. Com exceção do instrumento estereotaxi...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 μL Hamilton syringes	Hamilton	80314
21 G x 1" stainless steel hypdermic needle	BD	305165
23 G x 1" stainless steel hypdermic needle	BD	305145
30 G x 1/2" stainless steel hypdermic needle	BD	305106
Artificial cerebrospinal fluid	BASi	MD-2400
Bone trimer	Fine Science Tools	16152-12
Burr for micro drill	Fine Science Tools	19007-05
Clipper	Wahl
Cut-off disc	Dremel	SM5010
Cutting tweezers	Truper	17367
Cyanocrylate glue	Kola loka	K-1
Dental cement	Nic Tone
Enrofloxasin	Senosiain
Eosin	Sigma	E4009
Estereoscope	Zeiss
Extra fine Bonn scissors	Fine Science Tools	14084-08
Face mask	Lanceta HG	60036
Graefe Forceps	Fine Science Tools	11050-10
Hematoxilin	Sigma	H3136
Hemostats	Fine Science Tools	13008-12
Hot bead sterilizer	Fine Science Tools	18000-45
Hydrochloric acid	Sigma	320331
Hypromelose artificial tears	Sophia Labs	8950015
Isoflurane	Pisa Agropecuaria
Meloxicam	Aranda	1183
Microinjection pump	KD Scientific	788380
Monomer	Nic Tone
Mototool	Dremel	3000
Nitrile gloves	Lanceta HG	69028
Non-Rupture Ear Bars	David Kopf Instruments	855
Poly-L lysine	Sigma	P4707
Povidone-iodine	Dermo Dine
Povidone-iodine with soap	Germisin espuma
Pressure tweezers	Truper	17371
Rat anesthesia mask	David Kopf Instruments	Model 906
Saline solution	PISA
Scalpel	Fine Science Tools	10004-13
Scalpel blade	Fine Science Tools	10015-00
Sodium pentobarbital	Pisa Agropecuaria
Standard electrode holder	David Kopf Instruments	1770
Stainless steel wire	American Orthodontic	856-612
Stereotaxic apparatus	David Kopf Instruments	Model 900LS
Surgical Sissors	Fine Science Tools	14001-12
Teflon connectors	Basi	MD-1510
Teflon tubing	Basi	MF-5164
Tetrodotoxin	Alomone labs	T-500
Vaporizer	Kent scientific	VetFlo