Svelare il ruolo delle aree discrete del cervello del ratto nella regolazione dell'ovulazione attraverso l'inattivazione reversibile da microiniezioni di tetrodotossine

Riepilogo

Questo protocollo descrive la costruzione di un sistema di microiniezione a basso costo, il suo impianto stereotassico in strutture cerebrali profonde e la procedura per microiniezioni tempori di tetrodotossina in ratti svegli e sfrenati. L'obiettivo è quello di rivelare la partecipazione delle strutture ipotalamiche nella regolazione dell'ovulazione inibendo la loro attività neurale.

Abstract

Molti approcci sperimentali sono stati utilizzati per studiare il ruolo del cervello nella regolazione dell'ovulazione. Gli esempi includono la lesione e la deafferentazione dei gruppi neuronali, che sono entrambi metodi invasivi che compromettono in modo permanente l'integrità dell'area target. Questi metodi sono accompagnati da effetti collaterali che possono influenzare l'analisi dei meccanismi di regolazione acuta e temporale. L'impianto stereotassico di cannule guida mirate a specifiche regioni del cervello, seguito da un periodo di recupero, consente ai ricercatori di microiniettare diversi farmaci dopo la scomparsa degli effetti indesiderati dell'intervento chirurgico. La tetrodotossina è stata utilizzata per determinare i ruoli di diverse aree cerebrali in diversi processi fisiologici perché inibisce transitoriamente i potenziali d'azione dipendenti dal sodio, bloccando così tutta l'attività neurale nella regione bersaglio. Questo protocollo combina questo metodo con strategie per la valutazione del ciclo estrale e dell'ovulazione per rivelare il ruolo delle regioni cerebrali discrete nella regolazione dell'ovulazione in particolari momenti di un dato stadio del ciclo estrale. Ratti svegli e sfrenati (Rattus norvegicus) sono stati utilizzati per evitare gli effetti bloccanti che gli anestetici e gli ormoni dello stress esercitano sull'ovulazione. Questo protocollo può essere facilmente adattato ad altre specie, bersagli cerebrali e agenti farmacologici per studiare diversi processi fisiologici. I miglioramenti futuri a questo metodo includono la progettazione di un sistema di microiniezione che utilizza capillari di vetro di piccolo diametro invece di cannule guida. Ciò ridurrà la quantità di tessuto danneggiato durante l'impianto e diminuirà la diffusione dei farmaci infusi al di fuori dell'area target.

Introduzione

L'ovulazione è il processo attraverso il quale uno o più ovociti maturi vengono rilasciati dalle ovaie una volta ogni ciclo estrale / mestruale. Poiché tutte le specie di mammiferi dipendono dalla produzione di gameti per riprodursi, la comprensione dei meccanismi che regolano l'ovulazione ha un enorme impatto in aree che vanno dalla biomedicina, all'industria del bestiame e al mantenimento delle specie in via di estinzione. L'ovulazione è regolata dall'asse ipotalamo-ipofisi-ovaio, che coinvolge diverse aree ipotalamiche ed extra-ipotalamiche, i gonadotropi nell'ipofisi anteriore e le cellule theca e granulosa che, insieme agli ovociti, formano i follicoli ovarici all'interno delle ovaie¹.

I follicoli ovarici crescono, si sviluppano e infine ovulano in risposta alla secrezione tonica e fasica dell'ormone follicolo-stimolante e dell'ormone luteinizzante, le due gonadotropine secrete dai gonadotropi. Il modello di secrezione di gonadotropina è fondamentale per il corretto sviluppo follicolare e l'ovulazione ed è regolato dall'ormone di rilascio delle gonadotropine (GnRH)^1,2. Questo neuropeptide viene sintetizzato da neuroni sparsi in tutto il diencefalo basale e poi secreto alla vascolarizzazione portale che collega l'ipotalamo e l'ipofisi anteriore. L'attività secretoria dei neuroni GnRH è a sua volta modulata dall'input sinaptico derivante da diverse strutture cerebrali. Queste strutture trasmettono informazioni sullo stato dell'ambiente esterno e interno dell'organismo, compresa la disponibilità di cibo, la lunghezza del fotoperiodo e la concentrazione di ormoni nel sangue. In questo senso, modellano il modello riproduttivo di ciascuna specie e i ruoli specifici di tali strutture devono essere determinati al fine di comprendere correttamente i meccanismi che regolano l'ovulazione. Ad esempio, è stato dimostrato che la fluttuazione dei livelli di estradiolo durante il ciclo estrale regola la secrezione di GnRH; tuttavia, i neuroni GnRH non esprimono l'isoforma del recettore dell'estradiolo necessaria per rilevare tali cambiamenti. Due popolazioni di neuroni che esprimono questi recettori si trovano nella regione periventricolare rostrale del terzo ventricolo e nel nucleo arcuato, rispettivamente, e nelle sinapsi stabulanti con neuroni GnRH. Ci sono prove che suggeriscono che questi neuroni interpretano la concentrazione di estradiolo e quindi stimolano l'attività dei neuroni GnRH rilasciando kisspeptina, un potente induttore della secrezione di GnRH³.

Esperimenti che coinvolgono lesioni termiche o chimiche, così come la deafferentazione meccanica, hanno permesso ai ricercatori di determinare il coinvolgimento di diverse strutture cerebrali nella regolazione dell'ovulazione^{4,5,6,7,8,9,10,11,12} . Questi esperimenti, tuttavia, hanno lo svantaggio di essere invasivi e traumatici, richiedendo diversi giorni di recupero prima di valutare gli effetti del trattamento, ostacolando l'analisi degli effetti acuti del trattamento. Inoltre, influenzano in modo permanente le aree mirate e interrompono altri processi fisiologici a lungo termine. A causa di questi problemi, i risultati di questi esperimenti sono solitamente oscurati dai meccanismi compensativi omeostatici nel corpo dell'animale ed estrarre informazioni accurate sulle dinamiche regolatorie temporali in cui l'area è coinvolta è piuttosto difficile.

La microiniezione di farmaci che interrompono transitoriamente l'attività dei neuroni attraverso cannule guida è un'alternativa adatta che supera gli svantaggi sopra menzionati. Le cannule possono essere posizionate in qualsiasi regione del cervello da un intervento chirurgico stereotassico, consentendo al ricercatore di iniziare il trattamento farmacologico dopo che gli effetti confondenti dell'intervento chirurgico scompaiono. La microiniezione temportica dei farmaci consente ai ricercatori di testare ipotesi riguardanti il contributo della regione a una particolare fase del processo e può essere eseguita in animali svegli trattenuti o in movimento libero. Una varietà di farmaci tra cui anestetici locali, agonisti, antagonisti, agonisti inversi e tossine biologiche come la tetrodotossina (TTX) possono essere microiniettati nella regione di interesse in momenti specifici.

TTX è una tossina biologica sintetizzata da batteri che vivono nel corpo del pesce palla e di altri vertebrati e invertebrati. TTX silenzia l'attività neurale attraverso il blocco selettivo e transitorio dei canali del sodio, che si traduce nell'inibizione dei potenziali d'azione dipendenti dal sodio. In presenza di TTX, le cellule sperimentano un'alterazione nella fase di depolarizzazione e quindi non sono eccitabili ma rimangono vive. L'effetto bloccante del TTX è spiegato dalla sua composizione molecolare: un gruppo guanidinio è in grado di passare attraverso l'aspetto extracellulare del canale del sodio, ma il resto della molecola non può passare a causa delle sue dimensioni, quindi è bloccato e blocca il canale^{13,14,15,16,17} . Il meccanismo d'azione del TTX ne ha permesso l'utilizzo come strumento per studiare il sistema nervoso sia in vitro che in vivo. L'iniezione intracerebrale di questa tossina è stata utilizzata per studiare il ruolo delle aree cerebrali discrete in diversi processi come la ritenzione della memoria¹⁸, sonno ed eccitazione¹⁹, il riconoscimento del luogo²⁰, la navigazione spaziale²¹, l'abuso di droghe²², la termoregolazione²³, lo sviluppo della schizofrenia²⁴, il comportamento sessuale²⁵ e la regolazione dell'ovulazione²⁶ tra gli altri. In questo protocollo descriviamo gli effetti sull'ovulazione dell'inattivazione transitoria dei nuclei ipotalamici mediante microiniezione TTX in ratti svegli e sfrenati.

Protocollo

Le procedure che coinvolgono gli animali sono state approvate dal Comitato Etico della Facultad de Estudios Superiores Zaragoza, UNAM. Questa istituzione opera in stretta conformità con le regole messicane per la manipolazione degli animali, Norma ufficiale: NOM-062-ZOO-1999, che concorda con le linee guida internazionali.

1. Costruzione di cannule bilaterali

1. Estrarre l'albero in acciaio inossidabile dal mozzo di due aghi ipodermici da 23 G utilizzando una pinzetta a pressione e quindi rimuovere la colla rimanente utilizzando una lama di bisturi.
2. Disegna una linea a 15 mm di distanza dall'estremità smussata degli alberi con un sottile marcatore permanente. Utilizzare una pinzetta da taglio per rimuovere le estremità smussate.
3. Tenere i segmenti da 15 mm con ettostati fini e premerli perpendicolarmente con un disco di taglio attaccato a un utensile rotatorio fino a ottenere segmenti di tubi da 14 mm. Questo passaggio viene eseguito al fine di eliminare la parte occlusa degli alberi, creando estremità aperte e smussate. Infine, inserire un ago da 30 G attraverso i segmenti per eliminare qualsiasi ostruzione interna.
4. Determinare la distanza tra le strutture di interesse negli emisferi sinistro e destro del cervello con l'aiuto di un atlante cerebrale²⁷. Utilizzare l'argilla per modellare per fissare i due segmenti da 14 mm a un vetrino per microscopio e assicurarsi che entrambi siano allo stesso livello orizzontale. Osservare attraverso un micrometro oculare (10x) e regolare i segmenti con una pinzetta fine fino ad ottenere la distanza desiderata.
5. Mescolare la pasta saldante con il 10% di acido cloridrico in proporzione 2:1 e aggiungere una goccia della miscela 2 mm sotto l'estremità smussata dei segmenti. Saldare entrambi i segmenti con un unico punto utilizzando un saldatore e un filo di saldatura da 0,5 mm di diametro. Assicurarsi che la saldatura non ostruisca il lume dei segmenti.
6. Creare un supporto per fissare la cannula al supporto stereotassico tagliando un segmento di 10 mm di filo di acciaio inossidabile resiliente da 0,3 mm. Utilizzare l'argilla per modellare per posizionare 2 mm del filo a contatto con il punto di saldatura precedente e il resto posato sopra l'estremità smussata delle cannule. Saldare il filo alle cannule.
7. Pulire la superficie delle cannule con etanolo al 70% per rimuovere l'eccesso di pasta saldante. Lavare l'interno delle cannule con acqua sterile per rimuovere le particelle metalliche. Ripetere questo processo fino a quando non è possibile rilevare particelle al microscopio con un ingrandimento di 10x.

2. Costruzione di otturatori e tappi

1. Per costruire gli otturatori tagliare due segmenti da 16 mm di filo morbido rotondo in acciaio inossidabile (0,35 mm di diametro). Tenere una cannula bilaterale con emostati, perpendicolare a un banco da laboratorio, e inserire uno di questi segmenti in ciascuna cannula fino a raggiungere il banco. Piegare il resto con un angolo di 90°.
2. Per i tappi tagliare due segmenti da 2 mm di tubo di silicone (diametro interno = 0,76 mm) e applicare una goccia di colla siliconica su una delle estremità di ciascun segmento. Non lasciare che la colla entri nel tubo. Lasciare asciugare per almeno 24 ore.

3. Costruzione di microiniettori

1. Ripetere il passaggio 1.1, utilizzando invece aghi ipodermici da 30 G per creare gli alberi.
2. Disegna una linea a 18,5 mm di distanza dall'estremità smussata degli alberi e rimuovi il residuo delle estremità smussate con una pinzetta da taglio.
3. Ripetere il passaggio 1.1 con un singolo ago da 23 G per costruire adattatori tagliando due segmenti lunghi 6 mm a partire dall'estremità smussata.
4. Eliminare le porzioni occluse dei segmenti da 6 mm premendoli perpendicolarmente contro il disco di taglio fino ad ottenere due adattatori da 4 mm. Eliminare qualsiasi ostruzione interna.
5. Inserire l'estremità smussata dei segmenti 30 G negli adattatori. Guarda attraverso uno stereomicroscopio per assicurarti che la fine di entrambi, segmenti e adattatori, siano allo stesso livello. Applicare la colla cianoacrilata sull'articolazione distale usando un batuffolo di cotone e lasciare asciugare per 15 minuti.
6. Immergere due connettori per tubi in teflon al 70% di etanolo per 5 minuti e quindi collegarli ai microiniettori attraverso gli adattatori. Attendere che il diametro dei connettori si restringa per almeno 24 ore e quindi sterilizzare il microiniettore con un metodo a bassa temperatura per evitare danni ai connettori (si consiglia la sterilizzazione con ossido di etilene).

4. Manutenzione animale e strisci vaginali

1. Utilizzare ratti adulti adulti con cappuccio ciclici(Rattus norvegicus,ceppo CIIZ-V) di peso compreso tra 230 e 260 grammi. Ospita i ratti in gruppi di quattro in gabbie standard di polipropilene in una stanza con un fotoperiodo chiaro-scuro 14:10. Impostare la temperatura e l'umidità rispettivamente a 22 ± 2 °C e al 40%. Fornire cibo e acqua ad libitum.
2. Prendi strisci vaginali ogni giorno tra le 10:00 e le 12:00 h.
   1. Sterilizzare un anello batteriologico modificato con un diametro interno di 1 mm utilizzando una lampada ad alcool e raffreddarlo con acqua sterile. Tenere il ratto con una presa sicura e introdurre 5 mm del cappio batteriologico nella vagina, toccando le sue pareti interne. Rimuovere il cappio batteriologico. In caso di successo, si vedrà una goccia nuvolosa sulla punta. Posiziona questa goccia su un vetrino per microscopio.
   2. Ripeti questo processo per ogni ratto sterilizzando e raffreddando il ciclo tra ogni animale.
   3. Dopo che le gocce si sono asciugate, macchiate con ematossilina-eosina e osservate i campioni al microscopio a 10x.
   4. Determinare la proporzione di leucociti, cellule nucleate epiteliali e cellule cheratinizzate su ogni striscio e classificarla secondo i criteri delle fasi del ciclo estrale riportati nella Figura 1,che concorda con la precedente letteratura^28,29.

5. Impianto stereotassico delle cannule

NOTA: Eseguire l'impianto delle cannule a seguito di un regolare intervento chirurgico stereotassico asettico e nel rispetto delle norme istituzionali.

1. Prima dell'intervento chirurgico
   1. Sterilizzare strumenti chirurgici, cannule, viti chirurgiche, otturatori, garze e tamponi di cotone in legno 24 ore prima dell'intervento chirurgico utilizzando un'autoclave a vapore. Sterilizzare le punte degli strumenti metallici tra interventi chirurgici consecutivi pulendoli con perossido di idrogeno al 10% seguito da acqua e quindi metterli in uno sterilizzatore a perle calde.
   2. Preparare le aree di lavoro e lo strumento stereotassico prima di rimuovere l'animale dalla stanza di casa. Preparare l'animale per l'intervento chirurgico in un'area che si trova il più lontano possibile dal tavolo operatorio per evitare la contaminazione durante la procedura.
   3. Pulire le aree di preparazione e chirurgia con etanolo al 70% seguito da un'applicazione di una soluzione di cloruro al 10% per dieci minuti. Pulire la base, il telaio e i manipolatori dello strumento stereotassico con il 70% di etanolo e sterilizzare le punte delle barre auricolari utilizzando uno sterilizzatore a caldo e raffreddarle ad aria prima dell'intervento chirurgico.
   4. Esegui l'intervento indossando un cappotto da laboratorio dedicato, maschera facciale, cofano per la testa, maniche chirurgiche, copriscarpe e guanti chirurgici. Chiedi all'assistente di preparare gli animali per l'intervento chirurgico e controllare il loro stato generale durante la procedura.
   5. Attaccare la cannula al supporto stereotassico. Chiedi all'assistente di portare il primo animale da operare nella stanza. Selezionare i ratti in diestro per la chirurgia, poiché le osservazioni del nostro laboratorio indicano che questi animali recuperano cicli estrali adeguati più velocemente rispetto ai ratti operati in altre fasi, probabilmente perché la risposta allo stress cambia insieme al ciclo estrale.
   6. Pesare l'animale e indurre l'anestesia con il 4% di isoflurano in ossigeno al 100% all'interno di una camera di induzione per ratti collegata a un vaporizzatore isoflurano. Per evitare di stressare gli animali, non preriempire la camera. Confermare un piano chirurgico di anestesia controllando la dilatazione della pupilla e la perdita di dolore misurata dai test di pizzico della coda e dell'orecchio dopo aver osservato la perdita del riflesso di raddrizzamento.
      1. Anestetizzare il ratto mediante iniezione intraperitoneale di una miscela di ketamina (100 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg) se non è disponibile un vaporizzatore isoflurano.
   7. Rimuovere il ratto dalla camera di induzione e utilizzare un cono nasale nel tavolo di preparazione per mantenere gli effetti dell'anestesia con il 2,5% di isoflurano in ossigeno al 100%. Tagliare i capelli del cuoio capelluto con tagliacapelli e rimuovere i capelli sciolti con un rullo di pelucchi. Iniettare una dose sottocutanea preoperatoria di 2 mg/kg di Meloxicam e 5 mg/kg di Enrofloxacina rispettivamente come antinfiammatorio/analgesico e antibiotico non steroideo.
      1. Applicare lacrime artificiali ipromellose su ciascun occhio per evitare l'essiccazione durante l'intervento chirurgico.
   8. Montare l'animale nello strumento stereotassico sopra un cuscinetto riscaldante usando le orecchie senza rottura e una maschera di anestesia. Regola il morsetto del naso per assicurarti che la testa dell'animale sia piatta. Eseguire uno scrub chirurgico nella zona rasata alternando povidone-iodio con sapone e 70% di etanolo una volta e poi utilizzando povidone-iodio e 70% di etanolo due volte. Inserire un termometro rettale per registrare la temperatura dell'animale durante la procedura e quindi coprirlo con un campo chirurgico sterile.
2. Durante l'intervento chirurgico
   1. Usa un bisturi per fare un'incisione di 2 cm nella pelle e nel muscolo nel mezzo dell'area rasata. Rimuovere il periosteo dal cranio utilizzando un batuffolo di cotone rivestito con perossido di idrogeno al 2% per rivelare bregma o lambda, i punti di riferimento che verranno utilizzati per calcolare le coordinate target. Asciugare il cranio con aria per una migliore visualizzazione del punto di riferimento.
   2. Utilizzare i manipolatori dello strumento stereotassico per spostare la cannula in una posizione direttamente sopra il punto di riferimento scelto. Registrare le coordinate anteriore-posteriore e mediale-laterale dallo strumento stereotassico e utilizzarle per calcolare le coordinate dell'area target secondo l'atlante cerebrale²⁷.
   3. Impostare le coordinate calcolate nello strumento stereotassico e posizionare la punta della cannula sulla superficie del cranio. Registrare la coordinata dorsale-ventrale e utilizzarla per calcolare la profondità nell'area di destinazione.
   4. Rimuovere il braccio del manipolatore svitandolo dal telaio. Utilizzare una bava dentale attaccata a uno strumento rotatorio ad una velocità di 15.000 giri / min per lasciare un segno nel luogo in cui verrà eseguita la craniotomia. Quindi utilizzare la bava per fare tre fori, formando un triangolo equilatero attorno al segno. Questi fori non devono perforare il cranio. Inserire le viti chirurgiche nei fori, assicurandosi che siano posizionate saldamente.
   5. Rendere la craniotomia abbastanza ampia da adattarsi alla distanza tra le aree bersaglio in ciascun emisfero. Dovrebbe essere il più piccolo possibile di diametro ma abbastanza grande da consentire l'abbassamento della cannula senza toccare i bordi del cranio, poiché ciò modificherà la traiettoria. Eseguire la craniotomia gradualmente, applicando la pressione più bassa possibile. Il cranio del roditore ha uno spessore di pochi millimetri ed è fondamentale per preservare l'integrità dei tessuti sottostanti.
   6. Una volta che la dura madre è visibile, utilizzare un ago sterile da 21 G con la punta curva ad un angolo di 90° per rimuovere le schegge di osso e fare un taglio anteriore-posteriore nelle meningi. Utilizzare la tecnica Wirtshafter e colleghi³⁰ per evitare danni al seno sagittale superiore se l'area target si trova vicino alla linea mediana.
      1. Posizionare il supporto con la cannula nel telaio e utilizzare il manipolatore dorsale-ventrale per raggiungere la coordinata ventrale. Controllare che l'ago non tocchi i bordi durante la discesa e aumentare il diametro della craniotomia se necessario.
         NOTA: è importante che la punta delle cannule guida si concleda una regione che va da 0,5 a 2,0 mm sopra la regione di interesse. Ciò è dovuto alla reazione infiammatoria del cervello in risposta all'introduzione di corpi estranei e alla distruzione del tessuto. Ciò è particolarmente critico se la regione di interesse è piccola e la distanza di lavoro deve essere calcolata empiricamente in anticipo.
   7. Applicare il cemento dentale per attaccare la cannula al cranio e lasciarla asciugare. Assicurarsi che il cemento dentale non copra l'estremità smussata della cannula poiché ciò la ostruirà irreversibilmente. Attendere che il cemento si solidifichi completamente.
   8. Inserire gli otturatori per evitare ulteriori ostruzioni e per garantire la pervietà durante lo studio. Indossare il cappuccio in silicone per evitare contaminazioni.
3. Dopo l'intervento chirurgico
   1. Sostituire i liquidi persi con un'iniezione intraperitoneale di 1,0 ml di soluzione salina sterile a una temperatura fisiologica. Metti l'animale in una gabbia di recupero con supporto termico fino a quando non si riprende dall'anestesia. Controllare periodicamente la temperatura e la frequenza focolare/respiratoria dell'animale. Gli effetti dell'isoflurano durano per alcuni minuti dopo l'interruzione del flusso di gas mentre gli effetti di ketamina / xilazina durano per 40-50 minuti.
   2. Fornire iniezioni post-operatorie dei farmaci antibiotici, analgesici e antinfiammatori (alle stesse dosi e vie indicate in precedenza) per 48-72 ore e ispezionare attentamente gli animali su base giornaliera per il resto dell'esperimento. Segnala qualsiasi segno di dolore, stress o perdita di peso ai servizi veterinari o a un membro qualificato del laboratorio. Non eseguire altre manipolazioni ai ratti durante questo periodo.
   3. Inizia a prendere strisci vaginali dopo il trattamento post-operatorio e continua a farlo fino a quando l'animale mostra tre cicli estrali consecutivi di quattro giorni.
      NOTA: I cateteri giugulari cronici possono essere impiantati chirurgicamente, consentendo al ricercatore di prelevare campioni di sangue seriali per analizzare la secrezione di ormoni come estradiolo, progesterone, testosterone, ormone luteinizzante, ormone follicolo-stimolante e corticosterone. Si consiglia di posizionare un catetere di questo tipo una volta che l'animale si riprende dall'intervento chirurgico al cervello, poiché ciò migliorerà il tasso di sopravvivenza evitando anche l'intasamento del catetere che potrebbe derivare da un tempo di recupero prolungato.

6. Manipolazione della tetrodotossina e preparazione delle soluzioni

ATTENZIONE: TTX è una delle sostanze più tossiche conosciute. Agisce sui muscoli scheletrici e sul tessuto nervoso. L'intossicazione per contatto è improbabile, ma qualsiasi ferita aperta è un potenziale percorso per l'inoculazione nel corpo. Le principali preoccupazioni quando si lavora con TTX sono la puntura della pelle con strumenti affilati che sono stati a contatto con la tossina e la generazione di aerosol che possono raggiungere la bocca, gli occhi e le mucose. A seconda della dose, TTX può essere letale se inalato, ingerito o inoculato dalla pelle. Causerà una forte irritazione degli occhi. La LD50 è stata testata nei topi per via orale e endovenosa ed è rispettivamente di 334 μg/kg e 7,3 μg/kg. Non c'è antitossina disponibile in questo momento.

NOTA: La sostanza inattivante è un NaOCl all'1,0% con o senza 0,25 N NaOH o una soluzione di candeggina al 10%. L'inattivazione completa si verifica dopo un'esposizione di 30 minuti. Il TTX non può essere completamente inattivato da alcun derivato del cloruro ad una concentrazione inferiore al 10%, dall'autoclave né dalla sterilizzazione a calore secco a una temperatura inferiore a 500 °F. Tutte le procedure che coinvolgono TTX devono essere eseguite da due persone esperte che indossano paia interne ed esterne di guanti in nitrile, cappotto da laboratorio dedicato, occhiali di sicurezza, maschera facciale monouso, scarpe chiuse e pantaloni a figura intera.

1. Preparazione della soluzione stock
   1. Posizionare un tampone imbevuto della sostanza inattivante nella cappa aspirante per evitare la contaminazione in caso di fuoriuscita. Assicurarsi che la cappa aspirante funzioni correttamente prima di iniziare. Preparare un recipiente con la soluzione inattivante per smaltire le punte delle pipette.
   2. Spese sterilizzate TTX citrato liofilizzato in polvere secondo le istruzioni del produttore mediante una titolazione estremamente attenta e lenta con liquido cerebrospinale artificiale sterile, risciacquando le pareti del flaconcino nel processo. Evitare la formazione di schiuma e aerosol. Seguire una tecnica asettica per evitare la contaminazione della soluzione TTX poiché verrà iniettata nel cervello di animali vivi. Utilizzare una siringa con un ago invece di una micropipetta se i flaconcini TTX hanno una membrana esterna per prevenire la formazione di aerosol.
   3. Aliquotare la soluzione stock in micro tubi sterili. Rendere le aliquote il più piccole possibile poiché i cicli di congelamento / scongelamento possono alterare la stabilità delle molecole. Non riempire più della metà dei tubi perché l'acqua aumenta di volume quando congelata, il che può portare all'apertura del coperchio e alla contaminazione del tubo e di altri campioni conservati nel contenitore.
   4. Decontaminare l'esterno dei tubi e le superfici in cui TTX è stato utilizzato con la sostanza inattivante. Conservare i tubi a -20 °C in una scatola di flaconcino all'interno di un contenitore secondario.
2. Diluizione della soluzione stock a una concentrazione di lavoro
   1. Preparare soluzioni appena diluite il giorno in cui verranno utilizzate poiché le soluzioni diluite sono meno stabili. Posizionare un tampone imbevuto della sostanza inattivante nella cappa aspirante e un micro tube-rack sopra di esso. Preparare un recipiente con la soluzione inattivante per smaltire le punte delle pipette.
   2. Pipettare la soluzione stock sul fondo di un microtubo sterile e quindi aggiungere la quantità calcolata di liquido cerebrospinale artificiale per ottenere una concentrazione di 10 ng/μL. Come descritto per la ri-sospensione della polvere TTX, eseguire una titolazione estremamente attenta e lenta, risciacquando le pareti del flaconcino ed evitando la formazione di schiuma e aerosol.
   3. Se i campioni che sono stati sul congelatore saranno utilizzati per la microiniezione, devono essere lasciati equilibrare a temperatura ambiente per almeno un'ora prima dell'esperimento.

7. Microiniezione di soluzioni TTX o veicoli in ratti che si muovono liberamente

1. Configurare la pompa di microiniezione con la velocità di infusione e il tempo totale di iniezione in base all'esperimento. Calcolare questi parametri in anticipo considerando il volume occupato dalla struttura target e la quantità di soluzione da iniettare. Per questo esperimento iniettare 200 nL di soluzione ad una velocità di 50 nL al minuto per un tempo totale di infusione di 4 minuti.
2. Riempire due siringhe Hamilton da 10 μL con acqua distillata sterile, inserire un pezzo di tubo di Teflon sterile nel connettore del tubo di ciascun microiniettore, assicurandosi che la lunghezza del tubo non vincoli il movimento del ratto (il tubo può essere sterilizzato usando ossido di etilene).
3. Posizionare un tampone imbevuto della sostanza inattivante e un quadrato di 2 cm x 2 cm di pellicola di paraffina sopra di esso. Pipettare una quantità sufficiente di TTX per riempire l'ago dell'iniettore e 1 cm del tubo sopra il film. Assorbire la goccia TTX ritraendo delicatamente lo stantuffo. Montare le siringhe nella pompa di microiniezione e utilizzare i suoi controlli per manipolare lo stantuffo fino a quando una goccia di TTX può essere vista sulla punta di ciascun microiniettore. Scartare le gocce nel pad imbevuto di sostanza inattivante.
4. Seleziona i ratti che verranno microiniettati. Utilizzare solo ratti che hanno mostrato almeno tre cicli consecutivi dopo l'intervento chirurgico. Considera la loro fase del ciclo e l'ora del giorno. Sia il tempo che lo stadio dipendono dall'ipotesi specifica che testerai, per questo esperimento 14:00 ore di proestro selezionate poiché i segnali nervosi preovulatori che governano la secrezione fasica di GnRH si verificano in questo momento. Trasportali nella stanza in cui avverrà l'iniezione all'interno delle loro gabbie abitative per evitare angoscia.
5. Tenere il ratto con una presa salda, rimuovere il cappuccio e gli otturatori dalle cannule, inserire i microiniettori nelle cannule guida e riportare l'animale nella gabbia.
6. Accendere la pompa e attendere fino al termine della microiniezione. Osservare l'animale durante questo periodo al fine di rilevare un possibile distacco dei microiniettori ed evitare la torsione dei tubi in Teflon.
7. Lasciare i microiniettori in posizione per altri due minuti per evitare il reflusso della soluzione. Rimuoverli, pulire la superficie dell'impianto con soluzione antisettica di iodopovidone, evitando il suo flusso all'interno delle cannule guida. Inserire otturatori sterili, indossare il cappuccio e riportare l'animale nella stanza della colonia. Osservare periodicamente l'animale per rilevare eventuali effetti collaterali del farmaco.
8. Accendere la pompa con gli stessi parametri della microiniezione e verificare la disponibilità di un flusso corretto per garantire che la pervietà del sistema sia stata mantenuta durante la procedura.
9. Premere lo stantuffo per espellere il TTX/veicolo dal microiniettore fino a quando la bolla d'aria raggiunge la punta dell'ago. Ricorda il TTX nel suo microtubo. Riempire la siringa con acqua distillata e usarla per pulire l'interno dei tubi. Scartare l'acqua nella sostanza inattivante e ripetere questo processo almeno tre volte. Pulire l'esterno di siringhe, tubi e microiniettori con un panno imbevuto della sostanza inattivante.

8. Eutanasia e lavorazione dei tessuti

1. Il giorno dell'estro previsto o confermato vaginalmente, iniettare al ratto un sovradosaggio intraperitoneale di pentobarbital di sodio (75 mg/kg). Verificare la perdita di coscienza e iniettare 200 nL di una soluzione di blu di metilene allo 0,5% attraverso le cannule guida come descritto nei passaggi da 7.1 a 7.9. Controllare i segni di dolore utilizzando il test del pizzico della dita o della coda e, se non ne viene rilevato nessuno, decapitare il ratto usando una ghigliottina per roditori.
2. Utilizzare le forbici per aprire la cavità addominale e trovare le ovaie. Utilizzare forbici dell'iride fine per sezionare ogni ovaia, tagliando alla giunzione utero-tuba con l'aiuto di una lente d'ingrandimento. Evitare di danneggiare l'ovidotto perché ciò comporterà la perdita di ovociti.
3. Metti le ovaie sotto uno stereomicroscopio e usa una lama di rasoio per rimuovere tutto il tessuto adiposo senza danneggiare l'organo. Rimuovere l'ovidotto da ciascuna ovaia tagliando con la lama di rasoio il più lontano possibile dalla regione dell'ampolla. Montare ogni ovidotto su una diapositiva diversa e coprire con una goccia d'acqua. Conservare le ovaie in un flaconcino contenente la soluzione di Bouin.
4. Asciugare delicatamente gli ovidotti con un tovagliolo di carta assorbente e cercare l'ampolla sotto lo stereomicroscopio. Con la mano non dominante, tenere l'ovidotto in posizione pizzicando lontano dall'ampolla con un ago da 23 G, quindi utilizzare un altro ago da 23 G nella mano dominante per praticare un'incisione di 1 mm nella regione centrale dell'ampolla. I complessi cumulo-ovocita sporgeranno dall'incisione come una goccia di liquido viscoso (Figura 2D). Utilizzare l'ago nella mano dominante per tirare delicatamente e lentamente la goccia lontano dall'ovidotto. Premere il residuo dell'ampolla per assicurarsi che nessun ovocita rimanga all'interno. Estrarre gli ovociti dagli ovidotti il più velocemente possibile poiché l'essiccazione dell'ovidotto intrappola irreversibilmente gli ovociti all'interno.
5. Rimuovere l'ovidotto dal vetrino e attendere che la goccia di liquido contenente gli ovociti si asciughi. Macchiare il campione con ematossilina-eosina. Utilizzare il mezzo di montaggio per coprire lo slittamento. Osservare al microscopio (10x) per determinare il numero di ovociti versati da ciascuna ovaia.
   NOTA: Il sacrificio per perfusione cardiaca non viene eseguito in questo protocollo poiché gli ovociti sarebbero intrappolati negli ovidotti e quindi sarebbero necessari metodi istologici per valutare l'ovulazione. Se l'utente deve perfondere per analizzare altri tessuti, le ovaie possono essere rimosse prima e le arterie discendenti bloccate con eremostati spessi sotto il fegato per evitare perdite di fissativo.
6. Rimuovere la pelle della testa e immergere il cranio in un contenitore di vetro con una soluzione di formalina al 10%. Lasciare fissare la testa per almeno dieci giorni prima di rimuovere la cannula per evitare la distorsione del tessuto. Per rimuovere la cannula, utilizzare le forbici per staccare tutti i muscoli nella regione del cranio che la circonda. Tagliare tra le ossa nasali e frontali con trimmer ossei e quindi rimuovere l'osso occipitale. Inserire la punta dei trimmer nel forame magnum e iniziare a tagliare le creste sagittali raggiungendo il residuo dell'osso nasale.
7. La regione isolata della parte superiore del cranio deve contenere le ossa frontali e parietali. Rimuovere la cannula impiantata attaccata alla parte superiore del cranio tirandola lentamente verso l'alto perpendicolarmente alla testa. Tagliare qualsiasi porzione attaccata delle meningi con forbici dell'iride fini per evitare la deformazione del cervello.
8. Fai un taglio anteriore-posteriore sulle meningi e mettile da parte per rimuovere il cervello dalla base del cranio. Inserire una pinzetta smussata sotto i bulbi olfattivi e tirare delicatamente su il cervello fino a quando i nervi ottici sono visibili. Taglia i nervi con le forbici dell'iride fine e tira fuori il cervello. Preservare il cervello in soluzione fissativa.
9. Ottenere sezioni spesse 50 μm del cervello utilizzando un vibratoma, montarle in vetrini rivestiti di poli-L-lisina (0,1% in acqua distillata) e macchiarle con la tecnica Nissl. Osservare i vetrini al microscopio (10x) per determinare la posizione finale delle cannule (Figura 2A-2C) e la diffusione del colorante con l'aiuto di un atlante cerebrale di ratto²⁷.

Risultati

Il protocollo sopra descritto è stato testato valutando gli effetti di un singolo TTX o veicolo (liquido cerebrospinale artificiale; ACSF) microiniezione in uno dei due diversi nuclei noti per essere coinvolti nella regolazione dell'ovulazione nel ratto: il nucleo soprachiasmatico e il nucleo arcuato. Il nucleo soprachiasmatico è stato scelto poiché contiene il pacemaker circadiano centrale nei mammiferi. È coinvolto nella regolazione di eventi ciclici come la secrezione di gonadotropine. Il nucleo arcuato è stato s...

Discussione

Questo articolo descrive un metodo per inattivare transitoriamente, in qualsiasi momento, una regione discreta nel cervello di ratti svegli e sfrenati. Viene inoltre fornito un metodo semplice per monitorare il loro ciclo estrale e valutare l'ovulazione. Questo protocollo consente un'analisi diretta del contributo di specifiche regioni del cervello ai meccanismi che guidano l'ovulazione confrontando l'esito ovulatorio degli animali trattati con TTX con quello di quelli trattati con veicoli. Ad eccezione dello strumento s...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 μL Hamilton syringes	Hamilton	80314
21 G x 1" stainless steel hypdermic needle	BD	305165
23 G x 1" stainless steel hypdermic needle	BD	305145
30 G x 1/2" stainless steel hypdermic needle	BD	305106
Artificial cerebrospinal fluid	BASi	MD-2400
Bone trimer	Fine Science Tools	16152-12
Burr for micro drill	Fine Science Tools	19007-05
Clipper	Wahl
Cut-off disc	Dremel	SM5010
Cutting tweezers	Truper	17367
Cyanocrylate glue	Kola loka	K-1
Dental cement	Nic Tone
Enrofloxasin	Senosiain
Eosin	Sigma	E4009
Estereoscope	Zeiss
Extra fine Bonn scissors	Fine Science Tools	14084-08
Face mask	Lanceta HG	60036
Graefe Forceps	Fine Science Tools	11050-10
Hematoxilin	Sigma	H3136
Hemostats	Fine Science Tools	13008-12
Hot bead sterilizer	Fine Science Tools	18000-45
Hydrochloric acid	Sigma	320331
Hypromelose artificial tears	Sophia Labs	8950015
Isoflurane	Pisa Agropecuaria
Meloxicam	Aranda	1183
Microinjection pump	KD Scientific	788380
Monomer	Nic Tone
Mototool	Dremel	3000
Nitrile gloves	Lanceta HG	69028
Non-Rupture Ear Bars	David Kopf Instruments	855
Poly-L lysine	Sigma	P4707
Povidone-iodine	Dermo Dine
Povidone-iodine with soap	Germisin espuma
Pressure tweezers	Truper	17371
Rat anesthesia mask	David Kopf Instruments	Model 906
Saline solution	PISA
Scalpel	Fine Science Tools	10004-13
Scalpel blade	Fine Science Tools	10015-00
Sodium pentobarbital	Pisa Agropecuaria
Standard electrode holder	David Kopf Instruments	1770
Stainless steel wire	American Orthodontic	856-612
Stereotaxic apparatus	David Kopf Instruments	Model 900LS
Surgical Sissors	Fine Science Tools	14001-12
Teflon connectors	Basi	MD-1510
Teflon tubing	Basi	MF-5164
Tetrodotoxin	Alomone labs	T-500
Vaporizer	Kent scientific	VetFlo