Разгадка роли дискретных областей мозга крыс в регуляции овуляции посредством обратимой инактивации микроинъекциями тетродотоксина

Резюме

Этот протокол описывает построение недорогой системы микроинъекций, ее стереотаксическую имплантацию в глубокие мозговые структуры и процедуру временных микроинъекций тетродотоксина у бодрствующих и несдержанных крыс. Цель – выявить участие гипоталамиковых структур в регуляции овуляции путем угнетения их нервной активности.

Аннотация

Многие экспериментальные подходы были использованы для изучения роли мозга в регуляции овуляции. Примеры включают поражение и глухоту групп нейронов, которые являются инвазивными методами, которые постоянно ухудшают целостность целевой области. Эти методы сопровождаются побочными эффектами, которые могут повлиять на анализ острых и временных регуляторных механизмов. Стереотаксическая имплантация направляющих банюл, направленная на определенные области мозга, с последующим восстановительным периодом, позволяет исследователям микроинъектировать различные препараты после исчезновения нежелательных эффектов операции. Тетродотоксин был использован для определения роли нескольких областей мозга в различных физиологических процессах, поскольку он временно ингибирует натриезависимые потенциалы действия, тем самым блокируя всю нейронную активность в целевой области. Этот протокол сочетает этот метод со стратегиями оценки эстрального цикла и овуляции, чтобы выявить роль дискретных областей мозга в регуляции овуляции в определенные моменты любой заданной стадии эстрального цикла. Бодрствующие и несдержанные крысы(Rattus norvegicus)использовались, чтобы избежать блокирующих эффектов, которые анестетики и гормоны стресса оказывают на овуляцию. Этот протокол может быть легко адаптирован к другим видам, мишеням мозга и фармакологическим агентам для изучения различных физиологических процессов. Будущие усовершенствования этого метода включают в себя проектирование системы микроинъекции с использованием стеклянных капилляров малого диаметра вместо направляющих канюль. Это уменьшит количество ткани, поврежденной во время имплантации, и уменьшит распространение инфузии лекарств за пределы целевой области.

Введение

Овуляция - это процесс, при котором один или несколько зрелых ооцитов высвобождаются из яичников один раз в каждый эстральный / менструальный цикл. Поскольку все виды млекопитающих зависят от производства гамет для размножения, понимание механизмов, регулирующих овуляцию, оказывает огромное влияние в областях, начиная от биомедицины, животноводства и содержания исчезающих видов. Овуляция регулируется гипоталамико-гипофизарно-яичниковой осью, которая включает в себя несколько гипоталамиковых и экстрагипоталамиковых областей, гонадотропы в передней гипофизе и клетки теки и гранулезы, которые вместе с ооцитами образуют фолликулы яичников внутри яичников^1.

Фолликулы яичников растут, развиваются и в конечном итоге овулируют в ответ на тонизирующую и фазовую секрецию фолликулостимулирующего гормона и лютеинизирующего гормона, двух гонадотропинов, секретируемых гонадотропами. Структура секреции гонадотропина имеет решающее значение для правильного развития фолликулов и овуляции и регулируется гонадотропин-рилизинг-гормоном (ГнРГ)^1,2. Этот нейропептид синтезируется нейронами, разбросанными по всему базальному диэнцефалону, а затем секретируется в воротную сосудистую, которая связывает гипоталамус и передний гипофиз. Секреторная активность ГнРГ-нейронов, в свою очередь, модулируется синаптическим входом, возникающим из различных структур мозга. Эти структуры передают информацию о состоянии внешней и внутренней среды организма, включая доступность пищи, длину фотопериода и концентрацию гормонов в крови. В этом смысле они формируют репродуктивную модель каждого вида, и конкретные роли таких структур должны быть определены, чтобы правильно понять механизмы, управляющие овуляцией. В качестве примера было показано, что колебания уровня эстрадиола во время эстрального цикла регулируют секрецию ГнРГ; однако ГнРГ-нейроны не экспрессируют изоформу рецептора эстрадиола, необходимую для обнаружения таких изменений. Две популяции нейронов, экспрессирующих эти рецепторы, расположены в ростральной перивентрикулярной области третьего желудочка и в дугообразном ядре соответственно, и стаблируют синапсы с ГнРГ-нейронами. Есть данные, свидетельствующие о том, что эти нейроны интерпретируют концентрацию эстрадиола, а затем стимулируют активность ГнРГ-нейронов, высвобождая кисспептин, мощный индуктор секреции^{ГнРГ 3.}

Эксперименты с участием термических или химических поражений, а также механической глухоты, позволили исследователям определить вовлечение нескольких структур мозга в регуляцию овуляции^{4,5,6,7,8,9,10,11,12} . Эти эксперименты, однако, имеют недостаток в том, что они являются инвазивными и травматичными, требующими нескольких дней восстановления, прежде чем оценивать эффекты лечения, что препятствует анализу острых эффектов лечения. Кроме того, они постоянно воздействуют на целевые участки и нарушают другие физиологические процессы в долгосрочной перспективе. Из-за этих проблем результаты этих экспериментов обычно затемняются гомеостатическими компенсаторными механизмами в организме животного и извлечение точной информации о временной регуляторной динамике, в которой задействована область, довольно сложно.

Микроинъекция препаратов, которые временно нарушают активность нейронов через направляющие канюли, является подходящей альтернативой, которая превосходит недостатки, упомянутые выше. Канюли могут быть помещены в любую область мозга с помощью стереотаксической операции, что позволяет исследователю начать медикаментозное лечение после того, как смешанные эффекты операции исчезнут. Временная микроинъекция препаратов позволяет исследователям проверять гипотезы относительно вклада региона в ту или иную ступень процесса и может быть выполнена у бодрствующих сдерживающих или свободно движущихся животных. Различные препараты, включая местные анестетики, агонисты, антагонисты, обратные агонисты и биологические токсины, такие как тетродотоксин (TTX), могут быть микроинъецированы в интересующее вас время.

TTX является биологическим токсином, синтезируемым бактериями, живущими в организме рыбы фугу, а также других позвоночных и беспозвоночных. TTX подавляет нейронную активность посредством селективной и преходящей блокады натриевых каналов, что приводит к ингибированию натриезависимых потенциалов действия. В присутствии TTX клетки испытывают изменения в фазе деполяризации и, таким образом, не возбудимы, а остаются живыми. Блокирующий эффект TTX объясняется его молекулярным составом: группа гуанидиния способна проходить через внеклеточный аспект натриевого канала, но остальная часть молекулы не может пройти из-за своих размеров, поэтому она застревает и блокирует канал^{13,14,15,16,17} . Механизм действия ТТХ позволил использовать его в качестве инструмента для изучения нервной системы как in vitro, так и in vivo. Внутримозговая инъекция этого токсина была использована для изучения роли дискретных областей мозга в нескольких процессах, таких как сохранение памяти^18,сон и возбуждение^19,распознавание места^20,пространственная навигация^21,злоупотребление наркотиками^22,терморегуляция^23,развитие шизофрении^24,сексуальное поведение²⁵ и регуляция овуляции²⁶ среди прочих. В этом протоколе описано влияние на овуляцию транзиторной инактивации гипоталамического ядра микроинъекцией TTX у бодрствующих и несдержанных крыс.

протокол

Процедуры, касающиеся животных, были одобрены Комитетом по этике Высшего факультета высшего времени Сарагосы, УНАМ. Это учреждение работает в строгом соответствии с мексиканскими правилами обращения с животными, официальной нормой: NOM-062-ZOO-1999, которая согласуется с международными руководящими принципами.

1. Строительство двусторонних канюл

1. Извлеките вал из нержавеющей стали из ступицы двух подкожных игл по 23 г с помощью пинцета под давлением, а затем удалите оставшийся клей с помощью лезвия скальпеля.
2. Протяни линию на расстояние 15 мм от тупого конца валов тонким перманентным маркером. Используйте режущий пинцет, чтобы удалить скошенные концы.
3. Удерживайте сегменты диаметром 15 мм с помощью тонкого гемостата и прижимайте их перпендикулярно с помощью отсечного диска, прикрепленного к вращательному инструменту, до получения 14-миллиметровых сегментов трубки. Этот шаг делается для того, чтобы устранить закупоренный участок валов, создав открытые и тупые концы. Наконец, вставьте иглу 30 G через сегменты, чтобы устранить любую внутреннюю обструкцию.
4. Определить расстояние между интересуемыми структурами в левом и правом полушариях мозга с помощью атласа мозга^27. Используйте формовочную глину, чтобы прикрепить два 14-миллиметровых сегмента к слайду микроскопа и убедиться, что оба находятся на одном горизонтальном уровне. Наблюдайте через глазной микрометр (10x) и регулируйте сегменты тонким пинцетем до тех пор, пока не будет получено желаемое расстояние.
5. Смешайте паяную пасту с 10% соляной кислотой в пропорции 2:1 и добавьте каплю смеси на 2 мм ниже тупого конца сегментов. Припаяйте оба сегмента одной точкой с помощью паяльника и паяльной проволоки диаметром 0,5 мм. Убедитесь, что припой не препятствует просвету сегментов.
6. Создайте опору для крепления канюли к стереотаксическому держателю, разрезав 10-миллиметровый сегмент упругой проволоки из нержавеющей стали диаметром 0,3 мм. Используйте формовочную глину, чтобы поместить 2 мм проволоки в контакт с предыдущей точкой припоя, а остальную часть положить выше тупого конца канюль. Припаять проволоку к канюлям.
7. Очистите поверхность канюль 70% этанолом, чтобы удалить избыток паяльной пасты. Промывайте внутреннюю часть канюли стерильной водой для удаления металлических частиц. Повторяйте этот процесс до тех пор, пока под микроскопом не будут обнаружены частицы при 10-кратном увеличении.

2. Конструкция обтураторов и колпачков

1. Для сборки обтураторов вырезаны два 16-мм сегмента круглой мягкой проволоки из нержавеющей стали (диаметром 0,35 мм). Держите двустороннюю канюлю с гемостатами, перпендикулярную лабораторной скамье, и вставьте один из этих сегментов в каждую канюлю, пока они не достигнут скамейки. Согните остаток под углом 90°.
2. Для колпачков вырежьте два сегмента силиконовой трубки по 2 мм (внутренний диаметр = 0,76 мм) и нанесите каплю силиконового клея на один из концов каждого сегмента. Не позволяйте клею попасть в трубку. Дайте высохнуть не менее 24 часов.

3. Конструкция микроинжекторов

1. Повторите шаг 1.1, используя вместо этого подкожные иглы 30 Г для создания валов.
2. Протяните линию на 18,5 мм друг от друга от тупого конца валов и удалите остатки скошенных концов режущим пинцетом.
3. Повторите шаг 1.1 с одной иглой 23 G для создания адаптеров путем разрезания двух сегментов длиной 6 мм, начиная с тупого конца.
4. Удалите закупоренные участки 6-мм сегментов, прижав их перпендикулярно к отсечке до получения двух 4-мм адаптеров. Устраните любые внутренние препятствия.
5. Вставьте скошенный конец сегментов 30 G в адаптеры. Посмотрите через стереомикроскоп, чтобы убедиться, что конец обоих сегментов и адаптеров находится на одном уровне. Нанесите цианоакрилатный клей на дистальный сустав ватным тампоном и дайте высохнуть в течение 15 минут.
6. Замочите два разъема тефлоновых трубок в 70% этаноле в течение 5 минут, а затем прикрепите их к микроинжекторам через адаптеры. Подождите, пока диаметр соединителей не уменьшится в течение не менее 24 часов, а затем стерилизуйте микроинжектор низкотемпературным методом, чтобы избежать повреждения соединителей (рекомендуется стерилизация окиси этилена).

4. Уход за животными и вагинальные мазки

1. Используйте циклические взрослые самки крыс с капюшоном(Rattus norvegicus,штамм CIIZ-V) весом от 230 до 260 граммов. Размещать крыс группами по четыре человека в стандартных полипропиленовых клетках в комнате со светло-темным фотопериодом 14:10. Установите температуру и влажность на уровне 22 ± 2 °C и на уровне 40% соответственно. Обеспечьте питание и воду ad libitum.
2. Принимайте вагинальные мазки каждый день с 10:00 до 12:00 ч.
   1. Стерилизуют модифицированную бактериологическую петлю внутренним диаметром 1 мм с помощью спиртовой лампы и охлаждают ее стерильной водой. Удерживайте крысу надежной хваткой и вводите 5 мм бактериологической петли во влагалище, касаясь его внутренних стенок. Удалите бактериологическую петлю. В случае успеха на кончике будет видно облачное падение. Поместите эту каплю на слайд микроскопа.
   2. Повторите этот процесс для каждой крысы, стерилизуя и охлаждая петлю между каждым животным.
   3. После того, как капли высохнут, окрашивают гематоксилин-эозином и наблюдают образцы под микроскопом в 10 раз.
   4. Определить пропорцию лейкоцитов, эпителиальных ядерных клеток и ороговевшие клетки на каждом мазке и классифицировать его по критериям стадий эстрального цикла, представленным на фиг.1,что согласуется с предыдущей литературой^28,29.

5. Стереотаксическая имплантация канюли

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните имплантацию канюли после регулярной асептической стереотаксической хирургии и соблюдения институциональных норм.

1. Перед операцией
   1. Стерилизуйте хирургические инструменты, канюли, хирургические винты, обтураторы, марлевые и деревянные ватные тампоны за 24 часа до операции с помощью парового автоклава. Стерилизуйте наконечники металлических инструментов между последовательными операциями, очищая их 10% перекисью водорода с последующей водой, а затем поместите их в горячий стерилизатор.
   2. Подготовьте рабочие зоны и стереотаксический инструмент перед удалением животного из домашней комнаты. Подготовьте животное к операции в области, которая расположена как можно дальше от стола для операции, чтобы избежать загрязнения во время процедуры.
   3. Очистите подготовительные и хирургические участки 70% этанолом с последующим нанесением 10% раствора хлорида в течение десяти минут. Очистите основание, раму и манипуляторы стереотаксического инструмента 70% этанолом и стерилизуйте кончики ушных вкладышей с помощью горячего стерилизатора и охладите их воздухом перед операцией.
   4. Выполните операцию в специальном лабораторном халате, маске для лица, головном чепце, хирургических рукавах, бахилах и хирургических перчатках. Попросите помощника подготовить животных к операции и проверить их общее состояние во время процедуры.
   5. Прикрепите канюлю к стереотаксическому держателю. Попросите помощника принести в комнату первое животное, которое будет прооперировано. Выбирайте крыс в диеструсе для операции, так как наблюдения из нашей лаборатории показывают, что эти животные восстанавливают правильные циклы эструса быстрее, чем крысы, оперированные на других стадиях, вероятно, потому, что реакция на стресс изменяется вместе с эстровым циклом.
   6. Взвесьте животное и индуцировать анестезию 4% изофлураном в 100% кислороде внутри индукционной камеры для крыс, подключенной к испарителю изофлурану. Чтобы избежать стресса для животных, не заправляйте камеру предварительно. Подтвердите хирургическую плоскость анестезии, проверив расширение зрачка и потерю боли, измеренную тестами на защемление хвоста и уха после того, как вы наблюдаете потерю правильного рефлекса.
      1. Обезболить крысу внутрибрюшинной инъекцией смеси кетамина (100 мг/кг) и ксилазина (10 мг/кг), если испаритель изофлурана отсутствует.
   7. Выньте крысу из индукционной камеры и используйте носовой конус в подготовительном столе для поддержания эффектов анестезии с 2,5% изофлураном в 100% кислороде. Подстригните волосы кожи головы с помощью кусачек и удалите распущена волосы ворсовым валиком. Вводят предоперационную подкожную дозу 2 мг/кг мелоксикама и 5 мг/кг энрофлоксацина в качестве нестероидного противовоспалительного/анальгетика и антибиотика соответственно.
      1. Нанесите гипромеллозу искусственных слез на каждый глаз, чтобы избежать высыхания во время операции.
   8. Установите животное в стереотаксический инструмент над согревающей прокладкой, используя неразорвавные ушные вкладыши и анестезирующее маску. Отрегулируйте зажим для носа, чтобы голова животного была плоской. Выполните хирургический скраб в бритой области, чередуя повидон-йод с мылом и 70% этанола один раз, а затем используя повидон-йод и 70% этанол два раза. Вставьте ректальный термометр, чтобы записать температуру животного во время процедуры, а затем накройте его стерильным хирургическим полем.
2. Во время операции
   1. Используйте скальпель, чтобы сделать разрез 2 см в коже и мышцах в середине выбритой области. Удалите покостница из черепа с помощью ватного тампона, покрытого 2% перекисью водорода, чтобы выявить брегму или лямбду, ориентиры, которые будут использоваться для расчета целевых координат. Высушите череп воздухом для лучшей визуализации ориентира.
   2. Используйте манипуляторы стереотаксического инструмента, чтобы переместить канюлю в положение непосредственно над выбранным ориентиром. Регистрируйте передне-задние и медиалально-боковые координаты со стереотаксического прибора и используйте их для вычисления координат целевой области согласно атласу мозга^27.
   3. Установите рассчитанные координаты в стереотаксическом инструменте и поместите кончик канюли на поверхность черепа. Зарегистрируйте дорсально-вентральную координату и используйте ее для расчета глубины до целевой области.
   4. Снимите рычаг манипулятора, открутив его от рамы. Используйте зубной заусенец, прикрепленный к вращательному инструменту со скоростью 15 000 оборотов в минуту, чтобы сделать отметку в месте, где будет выполняться краниотомия. Затем с помощью заусенца сделать три отверстия, образуя равносторонние треугольники вокруг метки. Эти отверстия не должны прокалывать череп. Вставьте хирургические винты в отверстия, убедив, что они плотно размещены.
   5. Сделайте краниотомию достаточно широкой, чтобы вместить расстояние между целевыми областями в каждом полушарии. Она должна быть как можно меньше в диаметре, но достаточно большой, чтобы позволить опускать канюлю, не касаясь границ черепа, так как это изменит траекторию. Выполняйте краниотомию постепенно, применяя минимально возможное давление. Череп грызуна имеет толщину всего несколько миллиметров, и он имеет решающее значение для сохранения целостности тканей ниже.
   6. Как только церна будет видна, используйте стерильную иглу 21 г с наконечником, изогнутым под углом 90°, чтобы удалить осколки кости и сделать передне-задний разрез в менинге. Используйте технику Wirtshafter и коллег^30, чтобы избежать повреждения верхнего сагиттального синуса, если целевая область расположена близко к средней линии.
      1. Поместите держатель с канюлью в раму и используйте дорсально-вентральный манипулятор для достижения вентральной координаты. Убедитесь, что игла не касается границ во время спуска и при необходимости увеличьте диаметр краниотомии.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Важно, чтобы наконечник направляющих канюль был нацелен на область в диапазоне от 0,5 до 2,0 мм над интересуемой областью. Это связано с воспалительной реакцией головного мозга в ответ на введение инородных тел и на разрушение тканей. Это особенно важно, если интересующая область невелика и рабочее расстояние должно быть рассчитано эмпирически заранее.
   7. Нанесите зубной цемент, чтобы прикрепить канюлю к черепу и дайте ей высохнуть. Убедитесь, что зубной цемент не покрывает тупой конец канюли, так как это необратимо затруднит ее. Подождите, пока цемент полностью затвердеет.
   8. Вставьте обтураторы, чтобы избежать дальнейших препятствий и обеспечить проходимость во время исследования. Наденьте силиконовый колпачок, чтобы избежать загрязнения.
3. После операции
   1. Заменить потерянные жидкости внутрибрюшинной инъекцией 1,0 мл стерильного физиологического раствора при физиологической температуре. Поместите животное в клетку восстановления с тепловой поддержкой до тех пор, пока оно не оправится от анестезии. Периодически проверяйте температуру и частоту дыхания/дыхания животного. Эффект изофлурана длится в течение нескольких минут после прерывания газового потока, в то время как эффект кетамина/ксилазина длится в течение 40-50 мин.
   2. Проводят послеоперационные инъекции антибиотика, обезболивающих и противовоспалительных препаратов (в тех же дозах и путях, которые указывались ранее) в течение 48-72 ч и ежедневно внимательно осматривают животных в течение остальной части эксперимента. Сообщайте о любых признаках боли, стресса или потери веса ветеринарным службам или обученному члену лаборатории. Не выполняйте никаких других манипуляций с крысами в этот период.
   3. Начните принимать вагинальные мазки после послеоперационного лечения и продолжайте делать это до тех пор, пока животное не покажет три последовательных эстральных цикла по четыре дня.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Хронические яремные катетеры могут быть имплантированы хирургическим путем, что позволяет исследователю взять серийные образцы крови для анализа секреции гормонов, таких как эстрадиол, прогестерон, тестостерон, лютеинизирующий гормон, фолликулостимулирующий гормон и кортикостерон. Мы рекомендуем поставить такой катетер, как только животное оправится от операции на головном мозге, так как это улучшит выживаемость, а также позволит избежать засорения катетера, которое может возникнуть в результате длительного времени восстановления.

6. Обработка тетродотоксинов и приготовление растворов

ВНИМАНИЕ: TTX является одним из самых токсичных известных веществ. Действует на скелетные мышцы и нервную ткань. Интоксикация контактным путем маловероятна, но любая открытая рана является потенциальным путем для инокуляции в организм. Основными проблемами при работе с TTX являются прокол кожи острыми инструментами, которые были в контакте с токсином, и генерация аэрозолей, которые могут достигать рта, глаз и слизистых оболочек. В зависимости от дозы, TTX может быть смертельным при вдыхании, проглатывании или прививке кожей. Это вызовет сильное раздражение глаз. LD50 был протестирован на мышах путем перорального и внутривенного введения, и он составляет 334 мкг / кг и 7,3 мкг / кг соответственно. В настоящее время нет доступного антитоксина.

ПРИМЕЧАНИЕ: Инактивирующим веществом является 1,0% NaOCl с или без 0,25 N NaOH или 10% раствором отбеливателя. Полная инактивация происходит после 30 мин воздействия. TTX не может быть полностью инактивирован любым производным хлорида в концентрации ниже 10%, автоклавированием или сухой тепловой стерилизацией при температуре ниже 500 °F. Все процедуры, связанные с TTX, должны выполняться двумя знающими людьми, одетыми во внутреннюю и внешнюю пары нитриловых перчаток, специальное лабораторное пальто, защитные очки, одноразовую маску для лица, закрытую обувь и брюки во всю длину.

1. Приготовление складского раствора
   1. Поместите прокладку, пропитанную инактивирующим веществом, в вытяжной шкаф, чтобы предотвратить загрязнение в случае разлива. Перед запуском убедитесь, что вытяжной капюшон работает правильно. Подготовьте сосуд с инактивирующим раствором для утилизации наконечников пипетки.
   2. Повторное суспендирование стерильного ЦИТРАТНОГО лиофилизированного порошка TTX в соответствии с инструкциями производителя путем чрезвычайно тщательного и медленного титрования стерильной искусственной спинномозговой жидкостью, промывая стенки флакона в процессе. Избегайте образования пены и аэрозоля. Следуйте асептической технике, чтобы избежать загрязнения раствора TTX, поскольку он будет введен в мозг живых животных. Используйте шприц с иглой вместо микропипетки, если ваши флаконы TTX имеют внешнюю мембрану для предотвращения образования аэрозолей.
   3. Аликвотирует стоковый раствор в стерильные микропробирки. Сделайте аликвоты как можно меньше, так как циклы замораживания/оттаивания могут изменить стабильность молекул. Не заполняйте более половины трубок, потому что вода увеличивается в объеме при замораживании, что может привести к открытию крышки и загрязнению трубки и других образцов, хранящихся в контейнере.
   4. Обеззараживайте внешнюю часть трубок и поверхности, где использовался TTX, инактивирующим веществом. Храните тубы при -20 °C во флаконе внутри вторичного контейнера.
2. Разбавление бульонного раствора до рабочей концентрации
   1. Готовьте свежевыведенные растворы в день их использования, так как разбавленные растворы менее стабильны. Поместите прокладку, пропитанную инактивирующим веществом, в вытяжку и микротрубку поверх нее. Подготовьте сосуд с инактивирующим раствором для утилизации наконечников пипетки.
   2. Пипетка бульонного раствора на дно стерильной микропробирки и затем добавление расчетного количества искусственной спинномозговой жидкости для достижения концентрации 10 нг/мкл. Как описано для повторной приостановки порошка TTX, выполните чрезвычайно тщательное и медленное титрование, промыв стенки флакона и избегая образования пены и аэрозоля.
   3. Если образцы, которые были на морозильной камере, будут использоваться для микроинъекции, им должно быть позволено уравновешиваться при комнатной температуре в течение не менее одного часа до эксперимента.

7. Микроинъекция TTX или транспортных растворов в свободно движущихся крыс

1. Настройте микроинъекционный насос со скоростью инфузии и общим временем инъекции в соответствии с экспериментом. Рассчитайте эти параметры заранее, учитывая объем, занимаемый целевой структурой, и количество раствора, который будет введен. Для этого эксперимента вводят 200 нЛ раствора со скоростью 50 нЛ в минуту для общего времени инфузии 4 минуты.
2. Наполните два 10-мкл шприца Гамильтона стерильной дистиллированной водой, вставьте кусок стерильной тефлоновой трубки в разъем трубки каждого микроинжектора, убедив, что длина трубки не ограничивает движение крысы (трубки могут быть стерилизованы с использованием оксида этилена).
3. Поместите над ней прокладку, пропитанную инактивирующим веществом, и квадрат парафиновой пленки 2 см х 2 см. Пипетка достаточного количества TTX для заполнения иглы инжектора и на 1 см трубки над пленкой. Впитайте каплю TTX, осторожно втягивая плунжер. Установите шприцы в микроинжекционном насосе и используйте его элементы управления для манипулирования плунжером до тех пор, пока на кончике каждого микроинжектора не будет видно капли TTX. Выбросьте капли в прокладку, пропитанную инактивирующим веществом.
4. Выберите крыс, которые будут микроинъекцией. Используйте только крыс, которые показали не менее трех последовательных циклов после операции. Учитывайте их стадию цикла и время суток. И время, и стадия зависят от конкретной гипотезы, которую вы будете проверять, для этого эксперимента выбрано 14:00 часов проэструса, так как нервные предовуляторные сигналы, управляющие фазовой секрецией ГнРГ, происходят в этот момент. Транспортировать их в помещение, где будет происходить инъекция, внутри их собственных жилых клеток, чтобы избежать стресса.
5. Держите крысу крепкой хваткой, снимите с канюли колпачок и обтураторы, вставьте микроинжекторы в направляющие канюли и верните животное в клетку.
6. Включите насос и подождите, пока микроинъекция не закончится. Наблюдайте за животным в этот период, чтобы обнаружить возможное отслоение микроинъекторов и избежать скручивания тефлоновых трубок.
7. Оставьте микроинъекторы на месте в течение двух дополнительных минут, чтобы избежать рефлюкса раствора. Удалите их, очистите поверхность имплантата антисептическим раствором йодоповидона, избегая его протекания внутрь направляющих канюли. Вставьте стерильные обтураторы, наденьте колпачок и верните животное в комнату колонии. Периодически наблюдайте за животным, чтобы обнаружить любые возможные побочные эффекты препарата.
8. Включите насос с теми же параметрами, что и во время микроинъекции, и проверьте правильный поток, чтобы убедиться, что проходимость системы была сохранена во время процедуры.
9. Нажмите на плунжер, чтобы вытолкнуть TTX/транспортное средство из микроинжектора до тех пор, пока пузырь воздуха не достигнет кончика иглы. Вспомните TTX в его микропробире. Наполните шприц дистиллированной водой и используйте ее для очистки внутренней части трубок. Выбросьте воду в инактивировающее вещество и повторите этот процесс не менее трех раз. Очистите внешнюю сторону шприцев, трубок и микроинъекторов тканью, пропитанной инактивирующим веществом.

8. Эвтаназия и обработка тканей

1. В день прогнозируемой или вагинально подтвержденной течки вводят крысе с внутрибрюшинной передозировкой пентобарбитала натрия (75 мг/кг). Проверьте потерю сознания и введите 200 нЛ 0,5% раствора метиленового синего через направляющие канюли, как описано в шагах 7.1-7.9. Проверьте наличие болевых признаков с помощью теста на защемление носка или хвоста и, если они не обнаружены, обезглавить крысу с помощью гильотины грызунов.
2. Используйте ножницы, чтобы открыть брюшную полость и найти яичники. Используйте тонкие ножницы радужной оболочки, чтобы рассекать каждый яичник, разрезая на внутриутробно-трубном соединении с помощью увеличительного стекла. Избегайте повреждения яйцевода, потому что это приведет к потере ооцитов.
3. Поместите яичники под стереомикроскоп и используйте лезвие бритвы, чтобы удалить всю жировую ткань, не повредив орган. Удалите яйцевод из каждого яичника, разрезав бритвенным лезвием как можно дальше от области ампулы. Установите каждый яйцевод на разную горку и накройте каплей воды. Храните яичники во флаконе, содержащем раствор Буина.
4. Аккуратно высушите яйцеводы абсорбирующим бумажным полотенцем и найдите ампулу под стереомикроскопом. Недоминирующей рукой удерживайте яйцевод на месте, зажав далеко от ампулы иглой 23 Г, затем используйте еще одну иглу 23 г в доминирующей руке, чтобы сделать разрез 1 мм в средней области ампулы. Кучевые-ооцитарные комплексы будут выступать из разреза в виде капли вязкой жидкости(рисунок 2D). Используйте иглу в доминирующей руке, чтобы осторожно и медленно вытащить каплю далеко от яйцевода. Надавите на остаток ампулы, чтобы убедиться, что внутри не осталось ооцитов. Извлеките ооциты из яйцеводов как можно быстрее, так как высыхание яйцевода необратимо задержит ооциты внутри.
5. Удалите яйцевод из горки и подождите, пока высохнет капля жидкости, содержащая ооциты. Окрашивают образец гематоксилин-эозином. Используйте монтажную среду для чехлов. Наблюдают под микроскопом (10х) для определения количества ооцитов, выбрасываемых каждым яичком.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Жертвоприношение путем сердечной перфузии не выполняется в этом протоколе, поскольку ооциты будут захвачены в яйцеводах и, следовательно, для оценки овуляции потребуются гистологические методы. Если пользователь должен перфьюироваться для анализа других тканей, яичники могут быть удалены первыми, а нисходящие артерии зажаты толстыми гемостатами ниже печени, чтобы избежать утечки фиксатора.
6. Снимите кожу головы и погруите череп в стеклянную емкость с 10% раствором формалина. Дайте фиксации головки не менее десяти дней перед удалением канюли, чтобы избежать искажения ткани. Чтобы удалить канюлю, используйте ножницы, чтобы отсоединать все мышцы в области черепа, которая ее окружает. Разрезайте между носовой и лобной костями с помощью костных триммеров, а затем удалите затылочную кость. Вставьте кончик триммеров в форамен magnum и начните прорезать сагиттальные гребни, достигающие остатка носовой кости.
7. Изолированная область верхней части черепа должна содержать лобную и теменной кости. Удалите имплантированную канюлю, прикрепленную к верхней части черепа, медленно подтягивая ее вверх перпендикулярно голове. Срежьте любую прикрепленную часть мозговых обеззалений тонкими ножницами радужной оболочки, чтобы избежать деформации мозга.
8. Сделайте передне-задний разрез на мозговых огнях и отложите их в сторону, чтобы удалить мозг от основания черепа. Вставьте тупой пинцет ниже обонятельных луковиц и осторожно подтягивайте мозг, пока зрительные нервы не будут видны. Перережьте нервы тонкими ножницами радужной оболочки и вытащите мозг. Сохраните мозг в фиксаторном растворе.
9. Получите участки мозга толщиной 50 мкм с помощью вибратома, установите их в слайды с поли-L-лизином (0,1% в дистиллированной воде) и окрашивайте с помощью метода Nissl. Наблюдать за слайдами под микроскопом (10х) для определения конечного положения канюль(рисунок 2А-2С)и распространения красителя с помощью атласа мозга^{крысы 27.}

Результаты

Протокол, описанный выше, был протестирован путем оценки воздействия одного TTX или транспортного средства (искусственная спинномозговая жидкость; ACSF) микроинъекция в одно из двух различных ядер, которые, как известно, участвуют в регуляции овуляции у крыс: супрахиазматическое и дугооб?...

Обсуждение

В этой статье описывается метод временной инактивации в любой момент времени дискретной области в мозге бодрствующих и неограниченных крыс. Также предусмотрен простой метод отслеживания их эструционного цикла и оценки овуляции. Этот протокол позволяет провести простой анализ вклада...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 μL Hamilton syringes	Hamilton	80314
21 G x 1" stainless steel hypdermic needle	BD	305165
23 G x 1" stainless steel hypdermic needle	BD	305145
30 G x 1/2" stainless steel hypdermic needle	BD	305106
Artificial cerebrospinal fluid	BASi	MD-2400
Bone trimer	Fine Science Tools	16152-12
Burr for micro drill	Fine Science Tools	19007-05
Clipper	Wahl
Cut-off disc	Dremel	SM5010
Cutting tweezers	Truper	17367
Cyanocrylate glue	Kola loka	K-1
Dental cement	Nic Tone
Enrofloxasin	Senosiain
Eosin	Sigma	E4009
Estereoscope	Zeiss
Extra fine Bonn scissors	Fine Science Tools	14084-08
Face mask	Lanceta HG	60036
Graefe Forceps	Fine Science Tools	11050-10
Hematoxilin	Sigma	H3136
Hemostats	Fine Science Tools	13008-12
Hot bead sterilizer	Fine Science Tools	18000-45
Hydrochloric acid	Sigma	320331
Hypromelose artificial tears	Sophia Labs	8950015
Isoflurane	Pisa Agropecuaria
Meloxicam	Aranda	1183
Microinjection pump	KD Scientific	788380
Monomer	Nic Tone
Mototool	Dremel	3000
Nitrile gloves	Lanceta HG	69028
Non-Rupture Ear Bars	David Kopf Instruments	855
Poly-L lysine	Sigma	P4707
Povidone-iodine	Dermo Dine
Povidone-iodine with soap	Germisin espuma
Pressure tweezers	Truper	17371
Rat anesthesia mask	David Kopf Instruments	Model 906
Saline solution	PISA
Scalpel	Fine Science Tools	10004-13
Scalpel blade	Fine Science Tools	10015-00
Sodium pentobarbital	Pisa Agropecuaria
Standard electrode holder	David Kopf Instruments	1770
Stainless steel wire	American Orthodontic	856-612
Stereotaxic apparatus	David Kopf Instruments	Model 900LS
Surgical Sissors	Fine Science Tools	14001-12
Teflon connectors	Basi	MD-1510
Teflon tubing	Basi	MF-5164
Tetrodotoxin	Alomone labs	T-500
Vaporizer	Kent scientific	VetFlo