Flujo de trabajo de proteómica cuantitativa utilizando la detección basada en el monitoreo de reacciones múltiples de proteínas del tejido cerebral humano

Resumen

El protocolo tiene como objetivo introducir el uso de un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo para el monitoreo de reacción múltiple (MRM) de proteínas de muestras clínicas. Hemos proporcionado un flujo de trabajo sistemático desde la preparación de muestras hasta el análisis de datos para muestras clínicas con todas las precauciones necesarias a tomar.

Resumen

El análisis proteómico del tejido cerebral humano durante la última década ha mejorado en gran medida nuestra comprensión del cerebro. Sin embargo, los trastornos relacionados con el cerebro siguen siendo un importante contribuyente de muertes en todo el mundo, lo que requiere la necesidad de una comprensión aún mayor de su patobiología. Las técnicas tradicionales basadas en anticuerpos como el western blotting o la inmunohistoquímica sufren de bajo rendimiento, además de ser intensivas en mano de obra y cualitativas o semicuantitativas. Incluso los enfoques convencionales de escopeta basados en espectrometría de masas no proporcionan evidencia concluyente para apoyar una determinada hipótesis. Los enfoques de proteómica dirigida se basan en gran medida en hipótesis y difieren de los enfoques de proteómica de escopeta convencionales que se han utilizado durante mucho tiempo. El monitoreo de reacciones múltiples es uno de esos enfoques específicos que requiere el uso de un espectrómetro de masas especial llamado espectrómetro de masas cuadrupolo en tándem o espectrómetro de masas cuadrupolo triple. En el estudio actual, hemos destacado sistemáticamente los principales pasos involucrados en la realización de un flujo de trabajo exitoso de proteómica basada en espectrometría de masas cuadrupolo en tándem utilizando tejido cerebral humano con el objetivo de introducir este flujo de trabajo a una comunidad de investigación más amplia.

Introducción

Durante la última década, los rápidos desarrollos en espectrometría de masas (EM) junto con una mayor comprensión de las técnicas de cromatografía han ayudado en gran medida en el avance de la proteómica basada en la EM. Las técnicas basadas en la biología molecular, como el western blotting y la inmunohistoquímica, han sufrido durante mucho tiempo problemas de reproducibilidad, tiempo de respuesta lento, variabilidad entre observadores y su incapacidad para cuantificar con precisión las proteínas, por nombrar algunos. Con este fin, la sensibilidad superior de los enfoques de proteómica de alto rendimiento continúa ofreciendo a los biólogos moleculares una herramienta alternativa y más confiable en su búsqueda para comprender mejor el papel de las proteínas en las células. Sin embargo, los enfoques de proteómica de escopeta (adquisición dependiente de datos o DDA) a menudo no detectan proteínas poco abundantes en tejidos complejos, además de depender en gran medida de la sensibilidad y la resolución del instrumento. En los últimos años, los laboratorios de todo el mundo han estado desarrollando técnicas como la adquisición independiente de datos (DIA) que requieren una mayor potencia informática y un software confiable que pueda manejar estos conjuntos de datos altamente complejos. Sin embargo, estas técnicas siguen siendo un trabajo en progreso y no son muy fáciles de usar. Los enfoques proteómicos específicos basados en la EM proporcionan un equilibrio perfecto entre la naturaleza de alto rendimiento de los enfoques de EM y la sensibilidad de los enfoques de biología molecular como ELISA. Un experimento de proteómica basado en espectrometría de masas dirigida se centra en la detección de proteínas o péptidos impulsados por hipótesis a partir de experimentos de proteómica de escopeta basados en descubrimientos o a través de la literatura disponible^1,2. El monitoreo de reacción múltiple (MRM) es uno de esos enfoques específicos de EM que utiliza un espectrómetro de masas cuadrupolo en tándem para la detección y cuantificación precisas de proteínas / péptidos de muestras complejas. La técnica ofrece una mayor sensibilidad y especificidad a pesar de requerir el uso de un instrumento de baja resolución.

Un cuadrupolo está hecho de 4 varillas paralelas, con cada varilla conectada a la varilla diagonalmente opuesta. Se crea un campo fluctuante entre las varillas cuadrupolares aplicando voltajes alternos de RF y CC. La trayectoria de los iones dentro del cuadrupolo está influenciada por la presencia de los mismos voltajes a través de varillas opuestas. Al aplicar el voltaje de RF a CC, se puede estabilizar la trayectoria de los iones. Es esta propiedad del cuadrupolo la que le permite ser utilizado como un filtro de masa que puede dejar pasar selectivamente iones específicos. Dependiendo de la necesidad, un cuadrupolo se puede operar en el modo estático o en el modo de escaneo. El modo estático permite que solo pasen iones con un m / z especificado, lo que hace que el modo sea altamente selectivo y específico para el ion de interés. El modo de escaneo, por otro lado, permite que pasen iones en todo el rango m / z. Por lo tanto, los espectrómetros de masas cuadrupolo en tándem pueden operar de 4 maneras posibles: i) el primer cuadrupolo que opera en modo estático mientras que el segundo opera en modo de escaneo; ii) el primer cuadrupolo que funciona en el modo de escaneo mientras que el segundo funciona en el modo estático; iii) ambos cuadrupolos que operan en el modo de escaneo; y iv) ambos cuadrupolos que funcionan en modo estático³. En un experimento típico de MRM, ambos cuadrupolos operan en modo estático, lo que permite monitorear precursores específicos y sus productos resultantes después de la fragmentación. Esto hace que la técnica sea muy sensible y selectiva, lo que permite una cuantificación precisa.

Para los biólogos moleculares, el tejido cerebral humano y sus células son un tesoro. Estas notables unidades de un órgano siempre interesante del cuerpo humano pueden proporcionar información molecular y celular sobre su funcionamiento. Las investigaciones proteómicas del tejido cerebral no solo pueden ayudarnos a comprender el funcionamiento sistémico de un cerebro sano, sino también las vías celulares que se desregulan cuando son infligidas por alguna enfermedad⁴. Sin embargo, el tejido cerebral con toda su heterogeneidad es un órgano muy complejo de analizar y requiere un enfoque concertado para una mejor comprensión de los cambios a nivel molecular. El siguiente trabajo describe todo el flujo de trabajo desde la extracción de proteínas del tejido cerebral, la creación y optimización de los métodos para el ensayo mrm, hasta la validación de los objetivos(Figura 1). Aquí, hemos destacado sistemáticamente los principales pasos involucrados en un experimento exitoso basado en MRM utilizando tejido cerebral humano con el objetivo de introducir la técnica y sus desafíos a una comunidad de investigación más amplia.

Protocolo

Este estudio involucra muestras de tejido cerebral de participantes humanos, revisadas y aprobadas por TMH e IITB IEC - (IITB-IEC/2018/019). Los participantes dieron su consentimiento informado y por escrito para participar en este estudio.

1 Extracción de proteínas del tejido cerebral

1. Pesar alrededor de 50 mg de tejido cerebral y lavar el tejido con 300 μL de solución salina tampón de fosfato 1x (PBS) usando una micropipeta.
   NOTA: Este paso se realiza para eliminar cualquier sangre en la superficie externa del tejido y debe repetirse si es necesario. Es aconsejable eliminar la mayor cantidad de sangre del tejido como sea posible, ya que interfiere con la estimación y el procesamiento de proteínas aguas abajo.
2. Después de los lavados con PBS, agregue 300 μL de tampón de lisis (Tampón A) al tubo que contiene el tejido. Buffer A contiene 8 M de urea, 50 mM Tris pH 8.0, 75 mM de NaCl, 1 mM de MgCl₂ y cóctel inhibidor de proteasa (según las instrucciones del fabricante).
   NOTA: El rendimiento de proteínas varía dependiendo de varios factores que van desde las condiciones en las que se almacenan las muestras, la cantidad de material de partida y la eficiencia del manejo de las muestras durante el procesamiento. Reducir el volumen de tampón A proporcionalmente cuando se trabaja con cantidades de tejido inferiores a 50 mg.
3. Lise el tejido con un sonicador de sonda mientras mantiene el tubo en un baño de hielo. Utilice los siguientes parámetros para la sonicación: 40% de amplitud, 5 segundos de encendido y apagado del ciclo durante 2:30 min.
4. Continúe con la homogeneización del tejido utilizando un batidor de cuentas para lisar completamente el tejido.
   NOTA: Este paso debe realizarse a velocidad media durante 90 segundos seguido de incubación en hielo durante 3-5 minutos.
5. Centrifugar el contenido del tubo a 6.000 x g durante 15 min a 4 °C. Transfiera el sobrenadante a un tubo fresco y mezcle homogéneamente.
   NOTA: Hacer alícuotas de la muestra y conservar a -80°C hasta su uso posterior.

2 Cuantificación de proteínas y control de calidad

1. Cuantificar las muestras antes de la digestión utilizando un gráfico estándar hecho con concentraciones conocidas de BSA.
   NOTA: Asegúrese de que el ensayo que se utiliza para la estimación de proteínas sea compatible con el tampón utilizado para hacer el lisato de proteínas. Compruebe la calidad del lisato de proteína ejecutando un gel SDS-PAGE.

3 Digestión de proteínas

1. Tome 50 μg de proteína en un tubo de microcentrífuga y reduzca las proteínas agregando Tris 2-carboxietilofosfina (TCEP) de modo que la concentración final sea de 20 mM. Incubar el contenido a 37 °C durante 1 h.
2. Después de la incubación, alquila las proteínas reducidas agregando yodoacetamida (IAA) al tubo de tal manera que su concentración final sea de 40 mM. Incubar el tubo en la oscuridad durante 30 minutos.
   NOTA: Prepare IAA recién hecho justo antes de su adición al tubo.
3. Agregue el tampón B al tubo que contiene las proteínas reducidas y alquiladas de tal manera que la concentración final de urea en el tubo sea inferior a 1 M.
   NOTA: El tampón B está compuesto por 25 mM Tris (pH 8.0) y 1 mM CaCl₂ y se utiliza para diluir las muestras. Tras la dilución, asegúrese de que el contenido del tubo tenga un pH de 8 para una digestión óptima de las proteínas después de la adición de tripsina.
4. Agregue tripsina en una proporción de enzima a proteína de 1:30 e incube los tubos durante la noche a 37 ° C con agitación constante.
5. Después de la digestión, concentre el producto digerido en un concentrador de vacío. En este paso, los péptidos pueden reconstituirse y desalarse o almacenarse a -80 °C para su uso futuro.

4 Desalinación y cuantificación de péptidos

NOTA: La desalinación o la limpieza de péptidos es esencial antes de cargar las muestras para LC-MS / MS. Las sales y otros contaminantes en la muestra pueden obstruir las columnas y causar daños al instrumento también. El proceso se puede realizar utilizando puntas o columnas de etapa C18 disponibles comercialmente.

1. Activar la punta del estadio con 20 μL de acetonitrilo al 50% (ACN) en ácido fórmico (FA) al 0,1%. Centrifugar el contenido a 1.000 x g durante 1 minuto y desechar el flujo.
   NOTA: Las condiciones para la centrifugación son las mismas hasta el final del procedimiento.
2. Agregue 20 μL de 100% ACN en 0.1% FA y centrifugue el contenido como en el paso 4.1.
   NOTA: Los pasos de activación se pueden repetir un par de veces.
3. Después de la activación, pase 20 μL de muestra de péptido reconstituido a través de la punta de la etapa y la centrífuga como se realiza en el paso 4.1.
   NOTA: No descarte el flujo en este paso.
4. Repita el paso 4.3 con el flujo al menos 5 veces para garantizar la máxima unión del péptido a la punta de la etapa.
5. Pase 20 μL de 0.1% FA a través de la punta de la etapa y descarte el flujo a través.
   NOTA: Repita este paso dos veces más para obtener mejores resultados.
6. Eluye los péptidos unidos en un tubo de microfuge fresco pasando concentraciones crecientes de ACN, es decir, 40%, 60% y 80%, respectivamente.
7. Seque los péptidos en un concentrador de vacío y proceda a la cuantificación de péptidos.
8. Reconstituir los péptidos secos en FA al 0,1% y cuantificar utilizando el método Scopes⁵.

5 Preparación de la lista de transición de los objetivos finalizados

NOTA: Una transición se refiere al par de valores m/z del par de precursores (Q1) al producto (Q3) en un experimento MRM. Un péptido puede tener de una a muchas transiciones, con el mismo valor Q1 pero diferentes valores Q3. Un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo requiere información de las transiciones para que se detecten los péptidos y sus productos. Por lo tanto, antes de comenzar un experimento específico, se debe preparar una lista de transición. Esto se puede hacer utilizando el repositorio en línea de SRMAtlas⁶ (https://db.systemsbiology.net/sbeams/cgi/PeptideAtlas/GetTransitions) o un software de código abierto llamado Skyline⁷ (https://skyline.ms/project/home/software/Skyline/begin.view).

1. Descargue el archivo FASTA de proteoma humano reciente de UniProt (https://www.uniprot.org/) y cree un archivo de proteoma de fondo insertándolo en Skyline. En la configuración del péptido, vaya al menú desplegable Proteoma de fondo y haga clic en Agregar. Alimentar en el archivo de secuencia FASTA del proteoma humano. Asegúrese de que esta base de datos esté seleccionada y que el valor de escisión omitido permitido se establezca en 0 antes de continuar con el siguiente paso.
2. Ahora, en la pestaña Filtro en Configuración de péptidos, delimite la longitud de los péptidos aceptados de 8 a 25 aminoácidos.
3. En Configuración de transición, en la pestaña Filtro, establezca Cargas precursoras como 2,3, establezca Cargas de iones como 1 y establezca Tipos de iones en y. Los iones de producto se pueden seleccionar dependiendo de la elección del usuario. Seleccione N-terminal para prolinar iones especiales y deje todos los demás parámetros como predeterminados.
   NOTA: La configuración del péptido y la transición puede variar según el experimento.
4. Inserte los péptidos o proteínas de interés haciendo clic en Editar y moviéndose a Insertar. Para insertar proteínas, copie sus IDs de acceso y para insertar péptidos específicos, copie las secuencias peptídicas. El software asigna los documentos de acceso al proteoma de fondo y la lista de transición se crea en función de la configuración de péptido y transición.
5. Exporte la lista de transición. Asegúrese de que en el menú desplegable de Tipo de instrumento, el instrumento correcto está seleccionado. Para los experimentos de optimización, se puede optar por dividir las listas de transición en números más pequeños estableciendo el número deseado de transiciones por archivo en Skyline. Esto asegurará que el instrumento no se vea abrumado por filtrar demasiadas transiciones en una sola ejecución. El número de transiciones debe optimizarse aún más para obtener un solo método, esto lo mencionamos en adelante en la sección de refinamiento del método.

6 Parámetros LC

1. Utilice un sistema de disolvente binario con el disolvente acuoso que contiene 0,1% FA (disolvente A) y el disolvente orgánico que contiene 80% ACN (disolvente B).
2. Ajuste la temperatura de la columna a 45 °C.
3. Establezca un gradiente LC de 10 min con un caudal de 450 μL/min (como se muestra en la Tabla S1).

7 Parámetros de MS

NOTA: El ensayo explicado ha sido desarrollado y optimizado para el espectrómetro de masas triple cuadrupolo TSQ Altis.

1. Optimice los parámetros de ejecución como la resolución Q1 y Q3, el tiempo de permanencia y el tiempo de ciclo, un parámetro a la vez. Encontramos que la resolución 0.7 para Q1 y Q3 funciona mejor. Es posible que sea necesario ajustar el tiempo de ciclo o el tiempo de permanencia de acuerdo con el número de transiciones y el ancho máximo promedio de los péptidos que se monitorean.
2. Utilice los parámetros de MS en la Tabla S2 y la Tabla S3. La duración total del método es de 10 min.
   NOTA: Los parámetros siguen siendo los mismos para todas las ejecuciones durante y después del refinamiento del método, a menos que se indique lo contrario. Para un nuevo experimento, puede ser necesario cambiar ciertos parámetros dependiendo del tipo de muestra y los pasos de procesamiento de la muestra.

8 Secuencia de ejecución y control de calidad del instrumento

1. Prepare una mezcla de agua: metanol: isopropanol: acetonitrilo en proporción 1: 1: 1: 1. Use esta mezcla como un espacio en blanco.
2. Prepare péptidos para cualquier muestra estándar que se pueda usar para monitorear consistentemente el rendimiento del instrumento. Esto se utilizará como un estándar de control de calidad. Detectamos péptidos de digestos BSA que han sido optimizados y dan una respuesta buena y consistente durante varios días (Figura 2).
3. Para ejecutar muestras, la secuencia debe comenzar con un par de espacios en blanco, seguidos por el estándar de control de calidad y muestras clínicas. Asegúrese siempre de que haya un espacio en blanco entre dos muestras consecutivas.
4. Para facilitar la comparación, asegúrese de que se inyecten cantidades y volúmenes iguales de cada muestra cada vez.

9 Refinamiento del método

1. Analice los datos preliminares obtenidos de las muestras agrupadas utilizando Skyline. Busque el pico, las transiciones y los parámetros correctos, como la forma y la intensidad del pico, para seleccionar los mejores resultados. Guarde el archivo como un nuevo proyecto de Skyline.
2. Utilice una biblioteca para encontrar el mejor pico de coincidencia y, en consecuencia, se recomienda la mejor lista de transición posible. Una biblioteca es un conjunto de picos de EM / EM disponibles a partir de literatura o experimentos internos.
3. Exporte una nueva lista de transición desde el proyecto Skyline recién guardado y use esta lista de transición para hacer un método nuevo. Adquiera datos del nuevo método creado y repita el proceso de refinamiento de las transiciones utilizando Skyline.
4. Una vez que se finalice la lista de péptidos y transiciones después del análisis de datos utilizando Skyline, ajuste el método probando diferentes permutaciones del tiempo de ciclo y el tiempo de permanencia.
   NOTA: El uso de péptidos sintéticos marcados pesados y péptidos de tiempo de retención indexado (iRT) facilita el refinamiento del método^8,9. Por lo tanto, es aconsejable que el ajuste fino del método se realice utilizando estos péptidos.
5. Utilizando la información de tiempo de retención de los experimentos de refinamiento, cree un método final que esté programado (con una ventana de adquisición definida).
6. Preparar muestras para sujetos individuales. Los datos se adquirirán para estas muestras utilizando el método programado final.
7. Una vez que se adquieren los datos, se puede realizar un análisis posterior y una comparación grupal importando los archivos sin procesar a Skyline.

Resultados

Realizamos una cuantificación relativa de 3 proteínas de 10 muestras, 5 muestras de cada grupo de pacientes con anomalías en el cerebro. Estas proteínas incluyen la apolipoproteína A-I (APOA-I), la vimentina (VIM) y la nicotinamida fosforribosiltransferasa (NAMPT), que se sabe que desempeñan diversas funciones en las células cerebrales. El análisis posterior a la ejecución de los datos se realizó utilizando Skyline-daily (Ver 20.2.1.286). Se monitorizaron un total de 10 péptidos correspondientes a 3 proteínas...

Discusión

Técnicas como la inmunohistoquímica y el Western blotting fueron consideradas como los estándares de oro para la validación de objetivos de proteínas durante muchos años. Estos métodos encuentran uso incluso hoy en día con pequeñas modificaciones en el protocolo y poca dependencia de la tecnología, lo que los hace muy engorrosos y tediosos. Además de esto, también implican el uso de anticuerpos costosos que no siempre muestran la misma especificidad en todos los lotes y requieren una gran cantidad de experie...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Acetonitrile (MS grade)	Fisher Scientific	A/0620/21
Bovine Serum Albumin	HiMedia	TC194-25G
Calcium chloride	Fischer Scienific	BP510-500
Formic acid (MS grade)	Fisher Scientific	147930250
Iodoacetamide	Sigma	1149-25G
Isopropanol (MS grade)	Fisher Scientific	Q13827
Magnesium Chloride	Fischer Scienific	BP214-500
Methanol (MS grade)	Fisher Scientific	A456-4
MS grade water	Pierce	51140
Phosphate Buffer Saline	HiMedia	TL1006-500ML
Protease inhibitor cocktail	Roche Diagnostics	11873580001
Sodium Chloride	Merck	DF6D661300
TCEP	Sigma	646547
Tris Base	Merck	648310
Trypsin (MS grade)	Pierce	90058
Urea	Merck	MB1D691237
Supplies
Hypersil Gold C18 column	Thermo	25002-102130
Micropipettes	Gilson	F167380
Stage tips	MilliPore	ZTC18M008
Zirconia/Silica beads	BioSpec products	11079110z
Equipment
Bead beater (Homogeniser)	Bertin Minilys	P000673-MLYS0-A
Microplate reader (spectrophotometer)	Thermo	MultiSkan Go
pH meter	Eutech	CyberScan pH 510
Probe Sonicator	Sonics Materials, Inc	VCX 130
Shaking Drybath	Thermo	88880028
TSQ Altis mass spectrometer	Thermo	TSQ02-10002
uHPLC - Vanquish	Thermo	VQF01-20001
Vacuum concentrator	Thermo	Savant ISS 110