Flusso di lavoro di proteomica quantitativa utilizzando il rilevamento basato sul monitoraggio di reazioni multiple di proteine dal tessuto cerebrale umano

Riepilogo

Il protocollo mira a introdurre l'uso di uno spettrometro di massa a triplo quadrupolo per il monitoraggio a reazione multipla (MRM) di proteine provenienti da campioni clinici. Abbiamo fornito un flusso di lavoro sistematico a partire dalla preparazione dei campioni all'analisi dei dati per i campioni clinici con tutte le precauzioni necessarie da prendere.

Abstract

L'analisi proteomica del tessuto cerebrale umano nell'ultimo decennio ha notevolmente migliorato la nostra comprensione del cervello. Tuttavia, i disturbi legati al cervello continuano ad essere uno dei principali contributori di decessi in tutto il mondo, rendendo necessaria una comprensione ancora maggiore della loro patobiologia. Le tecniche tradizionali basate su anticorpi come il western blotting o l'immunoistochimica soffrono di bassa produttività oltre ad essere laboriose e qualitative o semi-quantitative. Anche gli approcci convenzionali basati sulla spettrometria di massa non riescono a fornire prove conclusive a sostegno di una certa ipotesi. Gli approcci proteomici mirati sono in gran parte guidati da ipotesi e differiscono dagli approcci convenzionali di proteomica del fucile da caccia che sono stati a lungo in uso. Il monitoraggio a reazione multipla è uno di questi approcci mirati che richiede l'uso di uno speciale spettrometro di massa chiamato spettrometro di massa a quadrupolo tandem o spettrometro di massa a triplo quadrupolo. Nel presente studio, abbiamo sistematicamente evidenziato i principali passi coinvolti nell'esecuzione di un flusso di lavoro proteomico basato sulla spettrometria di massa a quadrupolo tandem di successo utilizzando il tessuto cerebrale umano con l'obiettivo di introdurre questo flusso di lavoro a una più ampia comunità di ricerca.

Introduzione

Durante l'ultimo decennio, i rapidi sviluppi della spettrometria di massa (SM) insieme a una maggiore comprensione delle tecniche di cromatografia hanno notevolmente aiutato nel progresso della proteomica basata sulla SM. Le tecniche basate sulla biologia molecolare come il western blotting e l'immunoistochimica hanno sofferto a lungo di problemi di riproducibilità, tempi di consegna lenti, variabilità inter-osservatore e la loro incapacità di quantificare accuratamente le proteine, per citarne alcuni. A tal fine, la sensibilità superiore degli approcci proteomici ad alto rendimento continua a offrire ai biologi molecolari uno strumento alternativo e più affidabile nella loro ricerca per comprendere meglio il ruolo delle proteine nelle cellule. Tuttavia, gli approcci di proteomica shotgun (Data dependent Acquisition o DDA) spesso non riescono a rilevare proteine a bassa abbondanza nei tessuti complessi oltre ad essere fortemente dipendenti dalla sensibilità e dalla risoluzione dello strumento. Negli ultimi due anni, i laboratori di tutto il mondo hanno sviluppato tecniche come Data Independent Acquisition (DIA) che richiedono una maggiore potenza di calcolo e un software affidabile in grado di gestire questi set di dati altamente complessi. Tuttavia, queste tecniche sono ancora un work in progress e non molto user friendly. Gli approcci proteomici mirati basati sulla SM forniscono un perfetto equilibrio tra la natura ad alto rendimento degli approcci SM e la sensibilità degli approcci di biologia molecolare come ELISA. Un esperimento mirato di proteomica basato sulla spettrometria di massa si concentra sulla rilevazione di proteine o peptidi guidati da ipotesi da esperimenti di proteomica basati sulla scoperta o attraverso la letteratura disponibile^1,2. Il monitoraggio a reazione multipla (MRM) è uno di questi approcci mirati alla SM che utilizza uno spettrometro di massa a quadrupolo tandem per il rilevamento e la quantificazione accurati di proteine / peptidi da campioni complessi. La tecnica offre maggiore sensibilità e specificità nonostante richieda l'uso di uno strumento a bassa risoluzione.

Un quadrupolo è costituito da 4 aste parallele, con ogni asta collegata all'asta diagonalmente opposta. Un campo fluttuante viene creato tra le aste quadrupolo applicando tensioni RF e DC alternate. La traiettoria degli ioni all'interno del quadrupolo è influenzata dalla presenza delle stesse tensioni attraverso barre opposte. Applicando la tensione RF a CC, la traiettoria degli ioni può essere stabilizzata. È questa proprietà del quadrupolo che gli consente di essere utilizzato come filtro di massa in grado di far passare selettivamente ioni specifici. A seconda delle esigenze, un quadrupolo può essere azionato sia in modalità statica che in modalità di scansione. La modalità statica consente il passaggio solo di ioni con un m/z specificato, rendendo la modalità altamente selettiva e specifica per lo ione di interesse. La modalità di scansione, d'altra parte, consente il passaggio di ioni su tutta la gamma m / z. Pertanto, gli spettrometri di massa a quadrupolo tandem possono funzionare in 4 modi possibili: i) il primo quadrupolo che opera in modalità statica mentre il secondo opera in modalità di scansione; ii) il primo quadrupolo operante in modalità di scansione mentre il secondo operante in modalità statica; iii) entrambe le quadruffle che operano in modalità di scansione; e iv) entrambi i quadrupoli operanti in modalità statica³. In un tipico esperimento MRM, entrambi i quadruttori operano in modalità statica consentendo di monitorare specifici precursori e i loro prodotti risultanti dopo la frammentazione. Questo rende la tecnica molto sensibile e selettiva permettendo una quantificazione accurata.

Per i biologi molecolari, il tessuto cerebrale umano e le sue cellule sono un tesoro. Queste notevoli unità di un organo sempre interessante del corpo umano possono fornire informazioni molecolari e cellulari sul suo funzionamento. Le indagini proteomiche del tessuto cerebrale possono non solo aiutarci a capire il funzionamento sistemico di un cervello sano, ma anche i percorsi cellulari che si disregolano quando inflitti da qualche malattia⁴. Tuttavia, il tessuto cerebrale con tutta la sua eterogeneità è un organo molto complesso da analizzare e richiede un approccio concertato per una migliore comprensione dei cambiamenti a livello molecolare. Il lavoro che segue descrive l'intero flusso di lavoro a partire dall'estrazione di proteine dal tessuto cerebrale, creando e ottimizzando i metodi per il test MRM, fino alla convalida dei bersagli (Figura 1). Qui, abbiamo sistematicamente evidenziato i principali passi coinvolti in un esperimento basato sulla MRM di successo che utilizza tessuto cerebrale umano con l'obiettivo di introdurre la tecnica e le sue sfide a una comunità di ricerca più ampia.

Protocollo

Questo studio coinvolge campioni di tessuto cerebrale di partecipanti umani, esaminati e approvati da TMH e IITB IEC - (IITB-IEC/2018/019). I partecipanti hanno fornito il loro consenso informato e scritto a partecipare a questo studio.

1 Estrazione di proteine dal tessuto cerebrale

1. Pesare circa 50 mg di tessuto cerebrale e lavare il tessuto con 300 μL di 1x soluzione salina tampone fosfato (PBS) utilizzando una micropipetta.
   NOTA: Questo passaggio viene eseguito per rimuovere il sangue sulla superficie esterna del tessuto e deve essere ripetuto se necessario. Si consiglia di rimuovere il più possibile il sangue dai tessuti in quanto interferisce con la stima e l'elaborazione delle proteine a valle.
2. Dopo i lavaggi con PBS, aggiungere 300 μL di tampone di lisi (Tampone A) al tubo contenente il tessuto. Il tampone A contiene 8 M di urea, 50 mM Tris pH 8,0, 75 mM di NaCl, 1 mM di MgCl₂ e cocktail inibitore della proteasi (secondo le istruzioni del produttore).
   NOTA: La resa proteica varia a seconda di diversi fattori che vanno dalle condizioni in cui vengono conservati i campioni, alla quantità di materiale di partenza e all'efficienza della gestione dei campioni durante la lavorazione. Ridurre il volume del tampone A proporzionalmente quando si lavora con quantità di tessuto inferiori a 50 mg.
3. Lisire il tessuto utilizzando un sonicatore a sonda mantenendo il tubo su un bagno di ghiaccio. Utilizzare i seguenti parametri per la sonicazione: ampiezza del 40%, ciclo di 5 secondi di on e off per 2:30 min.
4. Continuare con l'omogeneizzazione dei tessuti utilizzando un battitore di perle per perlisi completare il tessuto.
   NOTA: Questo passaggio deve essere eseguito a velocità media per 90 secondi seguito da incubazione su ghiaccio per 3-5 minuti.
5. Centrifugare il contenuto del tubo a 6.000 x g per 15 min a 4 °C. Trasferire il surnatante in un tubo fresco e mescolare in modo omogeneo.
   NOTA: Fare aliquote del campione e conservare a -80°C fino a nuovo utilizzo.

2 Quantificazione delle proteine e controllo di qualità

1. Quantificare i campioni prima della digestione utilizzando un grafico standard realizzato con concentrazioni note di BSA.
   NOTA: Assicurarsi che il saggio utilizzato per la stima delle proteine sia compatibile con il tampone utilizzato per la produzione del lisirato proteico. Controllare la qualità del lasato proteico eseguendo un gel SDS-PAGE.

3 Digestione delle proteine

1. Prendere 50 μg di proteine in un tubo di microcentrizzazione e ridurre le proteine aggiungendo Tris 2-carbossietilfosfina (TCEP) in modo tale che la concentrazione finale sia di 20 mM. Incubare il contenuto a 37 °C per 1 ora.
2. Dopo l'incubazione, alchilare le proteine ridotte aggiungendo iodoacetammide (IAA) al tubo in modo tale che la sua concentrazione finale sia di 40 mM. Incubare il tubo al buio per 30 minuti.
   NOTA: Preparare IAA appena prima della sua aggiunta al tubo.
3. Aggiungere il tampone B al tubo contenente le proteine ridotte e alchilate in modo tale che la concentrazione finale di urea nel tubo sia inferiore a 1 M.
   NOTA: Il tampone B è composto da 25 mM Tris (pH 8,0) e 1 mM CaCl₂ e viene utilizzato per diluire i campioni. Alla diluizione, assicurarsi che il contenuto del tubo abbia un pH di 8 per una digestione ottimale delle proteine dopo l'aggiunta di tripsina.
4. Aggiungere la tripsina in un rapporto enzima/proteina di 1:30 e incubare le provette durante la notte a 37 °C con agitazione costante.
5. Dopo la digestione, concentrare il prodotto digerito in un concentratore sottovuoto. In questa fase, i peptidi possono essere ricostituiti e dissattati o conservati a -80 °C per un uso futuro.

4 Dissalitura e quantificazione peptidica

NOTA: la desalazione o la pulizia dei peptidi è essenziale prima di caricare i campioni per LC-MS/MS. Sali e altri contaminanti nel campione possono ostruire le colonne e causare danni allo strumento. Il processo può essere eseguito utilizzando punte o colonne C18 disponibili in commercio.

1. Attivare la punta dello stadio con 20 μL di acetonitrile al 50% (ACN) in acido formico allo 0,1% (FA). Centrifugare il contenuto a 1.000 x g per 1 minuto ed eliminare il flusso.
   NOTA: Le condizioni per la centrifugazione sono le stesse fino alla fine della procedura.
2. Aggiungere 20 μL di 100% ACN in 0,1% FA e centrifugare il contenuto come al punto 4.1.
   NOTA: i passaggi di attivazione possono essere ripetuti un paio di volte.
3. Dopo l'attivazione, passare 20 μL di campione peptidico ricostituito attraverso la punta dello stadio e la centrifuga come eseguito nel passaggio 4.1.
   NOTA: non scartare il flusso in questo passaggio.
4. Ripetere il passaggio 4.3 con il flusso attraverso almeno 5 volte per garantire il massimo legame peptidico alla punta dello stadio.
5. Passare 20 μL dello 0,1% di FA attraverso la punta dello stadio ed eliminare il flusso.
   NOTA: ripetere questo passaggio altre due volte per risultati migliori.
6. Eluire i peptidi legati in un tubo di microfuga fresco passando concentrazioni crescenti di ACN, cioè rispettivamente del 40%, 60% e 80%.
7. Asciugare i peptidi in un concentratore di vuoto e procedere alla quantificazione del peptide.
8. Ricostituire i peptidi essiccati in 0,1% FA e quantificare utilizzando il metodo Scopes⁵.

5 Preparazione della lista di transizione degli obiettivi finalizzati

NOTA: una transizione si riferisce alla coppia di precursori (Q1) ai valori m/z del prodotto (Q3) in un esperimento MRM. Un peptide può avere una o molte transizioni, con lo stesso valore Q1 ma diversi valori Q3. Uno spettrometro di massa a triplo quadrupolo richiede informazioni sulle transizioni per i peptidi e i loro prodotti da rilevare. Quindi, prima di iniziare un esperimento mirato, è necessario preparare un elenco di transizione. Questo può essere fatto utilizzando il repository online di SRMAtlas⁶ (https://db.systemsbiology.net/sbeams/cgi/PeptideAtlas/GetTransitions) o un software open source chiamato Skyline⁷ (https://skyline.ms/project/home/software/Skyline/begin.view).

1. Scarica il recente file del proteoma umano FASTA da UniProt (https://www.uniprot.org/) e crea un file proteoma di sfondo inserendolo in Skyline. Nelle impostazioni peptidiche, vai al menu a discesa Proteoma in background e fai clic su Aggiungi. Feed nel file di sequenza FASTA del proteoma umano. Assicurarsi che questo database sia selezionato e che il valore di scissione mancato consentito sia impostato su 0 prima di procedere al passaggio successivo.
2. Ora, sotto la scheda Filtro in Impostazioni peptidi delimitare la lunghezza dei peptidi accettati da 8 a 25 amminoacidi.
3. In Impostazioni di transizione, nella scheda Filtro impostare Le cariche precursori su 2,3, impostare Cariche ioniche su 1 e impostare Tipi ioni su y. Gli ioni prodotto possono essere selezionati in base alla scelta dell'utente. Selezionate N-terminale a prolina per ioni speciali e lasciate tutti gli altri parametri come predefiniti.
   NOTA: le impostazioni del peptide e della transizione possono variare in base all'esperimento.
4. Inserire i peptidi o le proteine di interesse cliccando su Modifica e spostandosi su Inserisci. Per inserire proteine, copiare i loro id di adesione e inserire peptidi specifici, copiare le sequenze peptidiche. Il software mappa gli ID di adesione al proteoma di sfondo e l'elenco di transizione viene creato in base alle impostazioni peptidiche e di transizione.
5. Esportare l'elenco di transizione. Assicurarsi che nel menu a discesa per Tipo di strumentosia selezionato lo strumento giusto. Per gli esperimenti di ottimizzazione, si può scegliere di dividere gli elenchi di transizione in numeri più piccoli impostando il numero desiderato di transizioni per file in Skyline. Ciò garantirà che lo strumento non sia sopraffatto per schermare troppe transizioni in una singola esecuzione. Il numero di transizioni deve essere ulteriormente ottimizzato per ottenere un unico metodo - questo lo menzioniamo d'ora in poi nella sezione di perfezionamento del metodo.

6 parametri LC

1. Utilizzare un sistema a solvente binario con il solvente acquoso contenente lo 0,1% di FA (Solvente A) e il solvente organico contenente l'80% di ACN (Solvente B).
2. Impostare la temperatura della colonna a 45 °C.
3. Impostare un gradiente LC di 10 min con una portata di 450 μL/min (come mostrato nella Tabella S1).

7 parametri MS

NOTA: Il test spiegato è stato sviluppato e ottimizzato per lo spettrometro di massa a triplo quadrupolo TSQ Altis.

1. Ottimizza i parametri di esecuzione come la risoluzione Q1 e Q3, il tempo di permanenza e il tempo di ciclo, un parametro alla volta. Troviamo che la risoluzione 0.7 per Q1 e Q3 funzioni meglio. Potrebbe essere necessario modificare il tempo di ciclo o il tempo di permanenza in base al numero di transizioni e alla larghezza media del picco dei peptidi monitorati.
2. Utilizzare i parametri MS nella tabella S2 e nella tabella S3. La durata totale del metodo è di 10 min.
   NOTA: i parametri rimangono gli stessi per tutte le esecuzioni durante e dopo il perfezionamento del metodo, se non diversamente specificato. Per un nuovo esperimento, potrebbe essere necessario modificare determinati parametri a seconda del tipo di campione e delle fasi di elaborazione del campione.

8 Sequenza di esecuzione e controllo di qualità dello strumento

1. Preparare una miscela di acqua: metanolo: isopropanolo: acetonitrile in rapporto 1:1:1:1. Usa questa miscela come uno spazio vuoto.
2. Preparare peptidi per qualsiasi campione standard che può essere utilizzato per monitorare costantemente le prestazioni dello strumento. Questo sarà usato come standard QC. Rileviamo peptidi da digest BSA che sono stati ottimizzati e diamo una risposta buona e coerente per diversi giorni (Figura 2).
3. Per eseguire i campioni, la sequenza dovrebbe iniziare con un paio di spazi vuoti, seguiti dallo standard QC e dai campioni clinici. Assicurarsi sempre che ci sia uno spazio vuoto tra due campioni consecutivi.
4. Per facilitare il confronto, assicurarsi che quantità e volumi uguali di ciascun campione vengano iniettati ogni volta.

9 Affinamento del metodo

1. Analizza i dati preliminari ottenuti dai campioni raggruppati utilizzando Skyline. Cerca il picco, le transizioni e i parametri giusti come la forma e l'intensità del picco per selezionare i risultati migliori. Salvare il file come nuovo progetto Skyline.
2. Utilizzare una libreria per trovare il picco corrispondente migliore e di conseguenza si consiglia la migliore lista di transizione possibile. Una libreria è un insieme di picchi MS/MS disponibili dalla letteratura o da esperimenti interni.
3. Esporta un nuovo elenco di transizione dal progetto Skyline appena salvato e utilizza questo elenco di transizione per creare un nuovo metodo. Acquisisci i dati dal nuovo metodo creato e ripeti il processo di perfezionamento delle transizioni utilizzando Skyline.
4. Una volta che l'elenco dei peptidi e delle transizioni è finalizzato dopo l'analisi dei dati utilizzando Skyline, perfeziona il metodo provando diverse permutazioni del tempo di ciclo e del tempo di permanenza.
   NOTA: L'uso di peptidi sintetici marcati pesantemente e peptidi iRT (Indexed Retention Time) rende facile il perfezionamento del metodo^8,9. È quindi consigliabile che la messa a punto del metodo venga eseguita utilizzando questi peptidi.
5. Utilizzando le informazioni sul tempo di conservazione degli esperimenti di perfezionamento, creare un metodo finale pianificato (con una finestra di acquisizione definita).
6. Preparare campioni per singoli soggetti. I dati saranno acquisiti per questi campioni utilizzando il metodo finale programmato.
7. Una volta acquisiti i dati, è possibile eseguire ulteriori analisi a valle e confronti di gruppo importando i file raw in Skyline.

Risultati

Abbiamo eseguito la quantificazione relativa di 3 proteine da 10 campioni, 5 campioni da ciascun gruppo di pazienti con anomalie nel cervello. Queste proteine includevano Apolipoproteina A-I (APOA-I), Vimentina (VIM) e Nicotinamide fosforibosiltransferasi (NAMPT) che sono noti per svolgere ruoli diversi nelle cellule cerebrali. L'analisi post-run dei dati è stata eseguita utilizzando Skyline-daily (Ver 20.2.1.286). Sono stati monitorati un totale di 10 peptidi corrispondenti a 3 proteine. Questi includevano 3 peptidi pe...

Discussione

Tecniche come l'immunoistochimica e il Western blotting sono state considerate come i gold standard per la convalida di bersagli proteici per molti anni. Questi metodi trovano uso ancora oggi con piccole modifiche nel protocollo e poca dipendenza dalla tecnologia che li rende molto ingombranti e noiosi. Oltre a questo, comportano anche l'uso di anticorpi costosi che non sempre mostrano la stessa specificità tra i lotti e richiedono una grande quantità di esperienza. Inoltre, solo una piccola frazione di proteine ident...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Acetonitrile (MS grade)	Fisher Scientific	A/0620/21
Bovine Serum Albumin	HiMedia	TC194-25G
Calcium chloride	Fischer Scienific	BP510-500
Formic acid (MS grade)	Fisher Scientific	147930250
Iodoacetamide	Sigma	1149-25G
Isopropanol (MS grade)	Fisher Scientific	Q13827
Magnesium Chloride	Fischer Scienific	BP214-500
Methanol (MS grade)	Fisher Scientific	A456-4
MS grade water	Pierce	51140
Phosphate Buffer Saline	HiMedia	TL1006-500ML
Protease inhibitor cocktail	Roche Diagnostics	11873580001
Sodium Chloride	Merck	DF6D661300
TCEP	Sigma	646547
Tris Base	Merck	648310
Trypsin (MS grade)	Pierce	90058
Urea	Merck	MB1D691237
Supplies
Hypersil Gold C18 column	Thermo	25002-102130
Micropipettes	Gilson	F167380
Stage tips	MilliPore	ZTC18M008
Zirconia/Silica beads	BioSpec products	11079110z
Equipment
Bead beater (Homogeniser)	Bertin Minilys	P000673-MLYS0-A
Microplate reader (spectrophotometer)	Thermo	MultiSkan Go
pH meter	Eutech	CyberScan pH 510
Probe Sonicator	Sonics Materials, Inc	VCX 130
Shaking Drybath	Thermo	88880028
TSQ Altis mass spectrometer	Thermo	TSQ02-10002
uHPLC - Vanquish	Thermo	VQF01-20001
Vacuum concentrator	Thermo	Savant ISS 110