זרימת עבודה של פרוטאומיה כמותית באמצעות זיהוי מבוסס ניטור תגובה מרובה של חלבונים מרקמת המוח האנושית

Summary

הפרוטוקול נועד להציג את השימוש בספקטרומטר מסה מרובע משולש לניטור תגובה מרובה (MRM) של חלבונים מדגימות קליניות. סיפקנו זרימת עבודה שיטתית החל מהכנת מדגם לניתוח נתונים עבור דגימות קליניות עם כל אמצעי הזהירות הדרושים שיש לנקוט.

Abstract

הניתוח הפרוטאומי של רקמת המוח האנושית בעשור האחרון שיפר מאוד את הבנתנו את המוח. עם זאת, הפרעות הקשורות למוח ממשיכות להיות התורם העיקרי של מקרי מוות ברחבי העולם, המחייב את הצורך בהבנה גדולה עוד יותר של הפתוביולוגיה שלהם. טכניקות מסורתיות המבוססות על נוגדנים כמו סופג מערבי או אימונוהיסטוכימיה סובלות מלהיות תפוקה נמוכה מלבד היותן עתירות עבודה ואיכותיות או חצי כמותיות. אפילו גישות רובה ציד מבוססות ספקטרומטריית מסה קונבנציונליות אינן מספקות ראיות חותכות התומכות בהשערה מסוימת. גישות פרוטאומיות ממוקדות מונעות במידה רבה בהשערות שונות מגישות הפרוטאומיות הקונבנציונליות של רובה הציד שנמצאות בשימוש זמן רב. ניטור תגובה מרובה הוא גישה ממוקדת אחת כזו הדורשת שימוש בספקטרומטר מסה מיוחד הנקרא ספקטרומטר מסה מרובע דו-מושבי או ספקטרומטר מסה מרובע משולש. במחקר הנוכחי, הדגשנו באופן שיטתי את הצעדים העיקריים הכרוכים בביצוע זרימת עבודה מוצלחת של פרוטאומיקה של מסה דו-מושבית המבוססת על ספקטרומטריה באמצעות רקמת מוח אנושית במטרה להציג זרימת עבודה זו לקהילת מחקר רחבה יותר.

Introduction

במהלך העשור האחרון, התפתחויות מהירות בספקטרומטריית מסה (MS) יחד עם הבנה מוגברת של טכניקות כרומטוגרפיה עזרו מאוד בקידום פרוטאומיקה מבוססת טרה-ס. טכניקות מבוססות ביולוגיה מולקולרית כגון סופגות מערביות ואימונוהיסטוכימיה סבלו זה מכבר מבעיות רבייה, זמן תפנית איטי, שונות בין-משקיפה וחוסר יכולתם לכמת במדויק חלבונים, אם להזכיר כמה. לכך, הרגישות המעולה של גישות פרוטאומיות בעלות תפוקה גבוהה ממשיכה להציע לביולוגים מולקולריים כלי חלופי ואמין יותר במסעם להבין טוב יותר את תפקידי החלבונים בתאים. עם זאת, גישות פרוטאומיות רובה ציד (רכישה תלויה נתונים או DDA) לעתים קרובות לא מצליחים לזהות חלבונים בשפע נמוך ברקמות מורכבות מלבד להיות תלוי בכבדות על הרגישות והרזולוציה של המכשיר. במהלך השנים האחרונות, מעבדות ברחבי העולם פיתחו טכניקות כמו רכישה עצמאית של נתונים (DIA) הדורשות כוח מחשוב מוגבר ותוכנות אמינות שיכולות להתמודד עם ערכות נתונים מורכבות אלה. עם זאת, טכניקות אלה הן עדיין עבודה בתהליך ולא מאוד ידידותי למשתמש. גישות פרוטאומיות ממוקדות המבוססות על טרשתות שניה מספקות איזון מושלם בין אופי התפוקה הגבוה של גישות טרשת-בתים לבין הרגישות של גישות ביולוגיה מולקולרית כמו ELISA. ניסוי פרוטאומיקס מבוסס ספקטרומטריית מסה ממוקד מתמקד בזיהוי חלבונים מונעי השערה או פפטידים מניסויי פרוטאומיה מבוססי גילוי או באמצעות ספרות זמינה^1,2. ניטור תגובה מרובה (MRM) היא גישה ממוקדת של טרשת נפוצה המשתמשת בספקטרומטר מסה מרובע דו-מושבי לגילוי וכימות מדויקים של חלבונים/פפטידים מדגימות מורכבות. הטכניקה מציעה רגישות וספציפיות גבוהות יותר למרות שהיא דורשת שימוש במכשיר ברזולוציה נמוכה.

ריבוע עשוי מ-4 מוטות מקבילים, כאשר כל מוט מחובר למוט הנגדי באלכסון. שדה משתנה נוצר בין מוטות quadrupole על ידי החלת מתחי RF ו- DC לסירוגין. מסלול היונים בתוך הקוואדרופול מושפע מנוכחותם של אותם מתחים על פני מוטות מנוגדים. על ידי החלת RF על מתח DC, המסלול של היונים ניתן לייצב. זהו מאפיין זה של quadrupole המאפשר לו לשמש כמסנן מסה אשר יכול באופן סלקטיבי לתת יונים ספציפיים לעבור. בהתאם לצורך, ניתן להפעיל ריבוע במצב הסטטי או במצב הסריקה. המצב הסטטי מאפשר רק יונים עם m/z שצוין לעבור, מה שהופך את המצב סלקטיבי מאוד ספציפי ליון של עניין. מצב הסריקה לעומת זאת מאפשר ליונים לאורך כל טווח m/z לעבור. לכן, ספקטרומטר מסה מרובע דו-מושבי יכול לפעול בארבע דרכים אפשריות: i) הרביעייה הראשונה הפועלת במצב סטטי בעוד השני פועל במצב סריקה; ii) הרביעייה הראשונה הפועלת במצב הסריקה בזמן שהשנייה פועלת במצב סטטי; iii) שני הרביעייה הפועלת במצב הסריקה; ו- iv) שני הרביעייה הפועלים במצב^{סטטי 3}. בניסוי MRM טיפוסי, שני הרביעייה פועלים במצב סטטי ומאפשרים למבשרים ספציפיים והמוצרים המתקבלים שלהם לאחר הפיצול להיות במעקב. זה הופך את הטכניקה למאוד רגישה וסלקטיבית ומאפשרת כימות מדויק.

עבור ביולוגים מולקולריים, רקמת המוח האנושית ותאיה הם אוצר בלום. יחידות מדהימות אלה של איבר מעניין מתמיד של גוף האדם יכולות לספק תובנות מולקולריות ותאיות על תפקודו. חקירות פרוטאומיות של רקמת המוח יכולות לא רק לעזור לנו להבין את התפקוד המערכתי של מוח בריא, אלא גם את המסלולים התאיים כי לקבל dysregulated כאשר נגרם על ידי מחלה כלשהי⁴. עם זאת, רקמת המוח עם כל ההטרוגניות שלה היא איבר מורכב מאוד לנתח ודורש גישה מתואמת להבנה טובה יותר של השינויים ברמה המולקולרית. העבודה הבאה מתארת את כל זרימת העבודה החל החל חילוץ חלבונים מרקמת המוח, יצירת ומיטוב השיטות לבדיקת MRM, לאימות המטרות (איור 1). כאן, הדגשנו באופן שיטתי את הצעדים העיקריים הכרוכים בניסוי מוצלח המבוסס על MRM באמצעות רקמת מוח אנושית במטרה להציג את הטכניקה ואת האתגרים שלה לקהילת מחקר רחבה יותר.

Protocol

מחקר זה כולל דגימות רקמת מוח ממשתתפים אנושיים, שנבדקו ואושרו על ידי TMH ו- IITB IEC - (IITB-IEC/2018/019). המשתתפים סיפקו את הסכמתם מדעת ובכתב להשתתף במחקר זה.

1 מיצוי חלבון מרקמת המוח

1. שקול סביב 50 מ"ג של רקמת המוח לשטוף את הרקמה עם 300 μL של 1x תמיסת מלח פוספט (PBS) באמצעות micropipette.
   הערה: שלב זה מבוצע כדי להסיר כל דם על פני השטח החיצוניים של הרקמה ויש לחזור על עצמו במידת הצורך. מומלץ להסיר דם רב ככל האפשר מן הרקמה כפי שהוא מפריע להערכת חלבון במורד הזרם ועיבוד.
2. לאחר שטיפות עם PBS, להוסיף 300 μL של חוצץ תמותה (חוצץ A) לצינור המכיל את הרקמה. חוצץ A מכיל 8 M urea, 50 mM טריס pH 8.0, 75 מ"מ NaCl, 1 mM MgCl₂ וקוקטייל מעכב פרוטאז (בהתאם להוראות היצרן).
   הערה: תפוקת החלבון משתנה בהתאם למספר גורמים החל מהתנאים שבהם מאוחסנות הדגימות, כמות החומר ההתחלתי ויעילות הטיפול בדגימות בעת העיבוד. להפחית את נפח המאגר A באופן יחסי בעת עבודה עם כמויות של רקמות נמוכות מ 50 מ"ג.
3. ללקק את הרקמה באמצעות sonicator בדיקה תוך שמירה על הצינור על אמבט קרח. השתמש בפרמטרים הבאים עבור sonication: 40% משרעת, 5 שניות לסירוגין מחזור במשך 2:30 דקות.
4. המשך עם הומוגניזציה רקמות באמצעות מקצף חרוזים כדי לגמרי לייס את הרקמה.
   הערה: שלב זה צריך להתבצע במהירות בינונית במשך 90 שניות ואחריו דגירה על קרח במשך 3-5 דקות.
5. צנטריפוגות את התוכן של הצינור ב 6,000 x g במשך 15 דקות ב 4 °C (70 °F). מעבירים את הסופר-נט לצינור טרי ומערבבים בצורה הומוגנית.
   הערה: יש לבצע עליבוטים של הדגימה ולאחסן ב-80°C עד לשימוש נוסף.

2 כימות חלבונים ובדיקת איכות

1. לכמת את הדגימות לפני העיכול באמצעות גרף סטנדרטי שנעשה עם ריכוזים ידועים של BSA.
   הערה: ודאו כי ההבחנה המשמשת להערכת חלבונים תואמת את המאגר המשמש להכנת החלבון ליסאט. בדוק את איכות החלבון lysate על ידי הפעלת ג'ל SDS-PAGE.

3 עיכול חלבונים

1. קח 50 מיקרוגרם של חלבון בצינור מיקרו צנטריפוגה ולהפחית את החלבונים על ידי הוספת טריס 2-קרבוקסיתיל פוספין (TCEP) כך הריכוז הסופי הוא 20 mM. לדגור על התוכן ב 37 °C (55 °F) במשך 1 שעות.
2. לאחר הדגירה, alkylate חלבונים מופחתים על ידי הוספת iodoacetamide (IAA) לצינור, כך הריכוז הסופי שלה הוא 40 mM. לדגור על הצינור בחושך במשך 30 דקות.
   הערה: הכן את רשות העתיקות טרי ממש לפני הוספתו לצינור.
3. הוסף חוצץ B לצינור המכיל חלבונים מופחתים ואלקיליים, כך הריכוז הסופי של אוריאה בצינור הוא פחות מ 1 M.
   הערה: מאגר B מורכב 25 mM טריס (pH 8.0) ו 1 mM CaCl₂ ומשמש לדילול הדגימות. עם דילול, להבטיח כי התוכן של הצינור יש pH של 8 לעיכול חלבון אופטימלי לאחר תוספת של טריפסין.
4. הוסף טריפסין ביחס אנזים לחלבון של 1:30 ודגר את הצינורות למשך הלילה ב 37 °C (50 °F) עם רעידות מתמידות.
5. לאחר העיכול, לרכז את המוצר המעוכל ברכז ואקום. בשלב זה, הפפטידים יכולים להיות משוחזרים ומותפלים או מאוחסנים ב -80 מעלות צלזיוס לשימוש עתידי.

4 התפלה וכימות פפטיד

הערה: התפלה או ניקוי פפטיד חיוני לפני טעינת הדגימות עבור LC-MS / MS. מלחים ומזהמים אחרים במדגם יכולים לסתום את העמודות ולגרום נזק גם למכשיר. ניתן לבצע את התהליך באמצעות עצות במה או עמודות C18 הזמינות מסחרית.

1. הפעל את קצה הבמה עם 20 μL של 50% acetonitrile (ACN) ב 0.1% חומצה פורמית (FA). צנטריפוגות את התוכן ב 1,000 x g במשך 1 דקה ולהשליך את הזרימה דרך.
   הערה: התנאים עבור צנטריפוגה זהים עד סוף ההליך.
2. הוסף 20 μL של 100% ACN ב 0.1% FA וצנטריפוגה התוכן כמו בשלב 4.1.
   הערה: ניתן לחזור על שלבי ההפעלה מספר פעמים.
3. לאחר ההפעלה, לעבור 20 μL של דגימת פפטיד מחדש דרך קצה הבמה צנטריפוגה כפי שבוצע בשלב 4.1.
   הערה: אל תמחק את הזרימה בשלב זה.
4. חזור על שלב 4.3 עם הזרימה לפחות 5 פעמים כדי להבטיח כריכת פפטיד מקסימלית לקצה הבמה.
5. לעבור 20 μL של 0.1% FA דרך קצה הבמה ולהשליך את הזרימה דרך.
   הערה: חזור על שלב זה פעמיים נוספות לקבלת תוצאות טובות יותר.
6. לחמוק הפפטידים הכבולים בצינור מיקרופוגה טרי על ידי העברת ריכוזים הולכים וגדלים של ACN, כלומר, 40%, 60% ו 80%, בהתאמה.
7. יבשו את הפפטידים ברכז ואקום והמשיכו לכימות פפטיד.
8. לבסס מחדש את הפפטידים היבשים ב- FA של 0.1% ולכומת באמצעות שיטת Scopes⁵.

5 הכנת רשימת מעבר של יעדים שהושלמו

הערה: מעבר מתייחס לזוג המבשרים (Q1) לערכי m/z של מוצר (Q3) בניסוי MRM. לפפטיד יכול להיות מעבר אחד עד רבים, עם אותו ערך Q1 אך ערכי Q3 שונים. ספקטרומטר מסה מרובע משולש דורש מידע על המעברים עבור הפפטידים ומוצריהם כדי להתגלות. לפיכך, לפני תחילת ניסוי ממוקד, רשימת מעבר צריך להיות מוכן. ניתן לעשות זאת באמצעות המאגר המקוון של SRMAtlas⁶ (https://db.systemsbiology.net/sbeams/cgi/PeptideAtlas/GetTransitions) או תוכנת קוד פתוח בשם Skyline⁷ (https://skyline.ms/project/home/software/Skyline/begin.view).

1. הורד את קובץ FASTA בן האדם האחרון מ- UniProt (https://www.uniprot.org/) וצור קובץ פרוטאום ברקע על-ידי הכנסתו לקו הרקיע. בהגדרות פפטיד, עבור אל החלק הנפתח של פרוטאום ברקע ולחץ על הוסף. הזנה בקובץ רצף FASTA של הפרוטאום האנושי. ודא שמסד נתונים זה נבחר וערך המחשוף המותר שהוחמץ מוגדר כ- 0 לפני שתמשיך לשלב הבא.
2. עכשיו, תחת הכרטיסייה מסנן בהגדרות פפטיד לתעד את אורך הפפטידים המקובלים מ 8 עד 25 חומצות אמינו.
3. בהגדרות מעבר, תחת הכרטיסיה מסנן להגדיר חיובי מקדם כ- 2,3, הגדר חיובי יון כ- 1 והגדר סוגי יונים כ- y. ניתן לבחור יונים של מוצרים בהתאם לבחירת המשתמש. בחר N-terminal כדי למקם עבור יונים מיוחדים ולהשאיר את כל הפרמטרים האחרים כברירת מחדל.
   הערה: הגדרות הפפטיד והמעבר יכולות להשתנות בהתאם לניסוי.
4. הכנס את הפפטידים או החלבונים מעניינים על ידי לחיצה על ערוך ומעבר ל- Insert. כדי להכניס חלבונים, להעתיק את מזהי הגישה שלהם ולהכניס פפטידים ספציפיים, להעתיק את רצפי הפפטיד. התוכנה ממפה את זהות הגישה לפרוטום הרקע ורשימת המעבר נוצרת בהתבסס על הגדרות הפפטיד והמעבר.
5. יצא את רשימת המעבר. ודא שבבחירה הנפתחת עבור סוג כלי נגינה, הכלי הנכון נבחר. עבור ניסויי המיטוב, ניתן לבחור לפצל את רשימות המעבר למספרים קטנים יותר על-ידי הגדרת מספר המעברים הרצוי לכל קובץ ב- Skyline. פעולה זו תבטיח כי המכשיר אינו המום כדי לסנן מעברים רבים מדי בריצה אחת. מספר המעברים צריך להיות מותאם עוד יותר כדי לקבל שיטה אחת - את זה אנו מזכירים מעתה והלאה תחת סעיף עידון השיטה.

6 פרמטרי LC

1. השתמש במערכת ממס בינארית עם ממס מימי המכיל 0.1% FA (ממס A) ואת הממס האורגני המכיל 80% ACN (ממס B).
2. הגדר את טמפרטורת העמודה ל 45 °C (70 °F).
3. הגדר מעבר צבע של LC של 10 דקות עם קצב זרימה של 450 μL/min (כפי שמוצג בטבלה S1).

7 פרמטרי MS

הערה: ההסתה הסבירה פותחה ומותבה עבור ספקטרומטר מסה מרובע משולש TSQ Altis.

1. מטב פרמטרים של ריצות כמו רזולוציית Q1 ו- Q3, זמן השתהות וזמן מחזור - פרמטר אחד בכל פעם. אנו מוצאים כי רזולוציה 0.7 עבור Q1 ו- Q3 עובד בצורה הטובה ביותר. ייתכן שיהיה צורך לכוונן את זמן המחזור או זמן ההשתהות בהתאם למספר המעברים ורוחב השיא הממוצע של הפפטידים המנוטרים.
2. השתמש בפרמטרי MS בטבלה S2 ובטבלה S3. משך פעולת השירות הכולל הוא 10 דקות.
   הערה: הפרמטרים נשארים זהים עבור כל הריצות במהלך עידון השיטה ואחרי, אלא אם צוין אחרת. עבור ניסוי טרי, ייתכן שיהיה צורך לשנות פרמטרים מסוימים בהתאם לסוג המדגם ושלבי העיבוד לדוגמה.

8 רצף ריצה ו- QC של מכשיר

1. הכן תערובת של מים: מתנול: איזופרופנול: acetonitrile ביחס 1:1:1:1. השתמש בתערובת זו כריקים.
2. הכן פפטידים עבור כל מדגם סטנדרטי שניתן להשתמש בו כדי לפקח באופן עקבי על הביצועים של המכשיר. זה ישמש כסטנדרט QC. אנו מזהים פפטידים מתעכלי BSA שעברו אופטימיזציה ונותנים מענה טוב ועקבי במשך מספר ימים(איור 2).
3. כדי להפעיל דגימות, הרצף צריך להתחיל עם כמה ריקים, ואחריו תקן QC ודגימות קליניות. ודא תמיד שיש ריק אחד בין שתי דוגמאות רצופות.
4. כדי להקל על ההשוואה, ודא כמויות ונפחים שווים של כל דגימה מוזרקים בכל פעם.

9 עידון שיטתי

1. נתח את הנתונים הראשוניים שהתקבלו מהדגימות במאגר באמצעות קו הרקיע. חפש את הפסגה, המעברים והפרמטרים הנכונים, כגון צורת שיא ועוצמה כדי לבחור את התוצאות הטובות ביותר. שמור את הקובץ כפרוייקט קו סקיי חדש.
2. השתמש בספריה כדי למצוא את שיא ההתאמה הטוב ביותר וכתוצאה מכך מומלץ לבצע את רשימת המעבר הטובה ביותר האפשרית. ספריה היא קבוצה של פסגות MS/MS הזמינות מספרות או מניסויים פנימיים.
3. יצא רשימת מעבר חדשה מפרוייקט Skyline שנשמר לאחרונה והשתמש ברשימת מעבר זו כדי ליצור שיטה חדשה. השג נתונים מהשיטה החדשה שנוצרה וחזר על תהליך עידון המעברים באמצעות Skyline.
4. לאחר שרשימת הפפטידים והמעברים תושלם לאחר ניתוח נתונים באמצעות Skyline, כוונן את השיטה על-ידי ניסיון תמורות שונות של זמן מחזור וזמן התעכבות.
   הערה: השימוש בפפטידים סינתטיים כבדים ומסומנים בפפטידים עם תווית כבדה (iRT) הופך את עידון השיטה לקל^8,9. לכן מומלץ כי כוונון עדין של השיטה להתבצע באמצעות פפטידים אלה.
5. באמצעות מידע זמן השמירה מניסויי השיפור, צור שיטה סופית המתוזמנת (בעל חלון רכישה מוגדר).
6. הכן דוגמאות עבור נושאים בודדים. נתונים יירכשו עבור דוגמאות אלה באמצעות השיטה המתוזמנת הסופית.
7. לאחר רכישת הנתונים, ניתוח במורד הזרם והשוואה קבוצתית ניתן לבצע על ידי ייבוא הקבצים הגולמיים סקייליין.

תוצאות

ביצענו כימות יחסי של 3 חלבונים מ-10 דגימות, 5 דגימות מכל קבוצה של חולים עם חריגות במוח. חלבונים אלה כללו Apolipoprotein A-I (APOA-I), Vimentin (VIM) ו Nicotinamide זרחן זרחן (NAMPT) אשר ידועים לבצע תפקידים מגוונים בתאי המוח. ניתוח לאחר הריצה של הנתונים בוצע באמצעות Skyline-daily (Ver 20.2.1.286). בסך הכל 10 פפטידים המתאימים ל -3 חלבונים ה...

Discussion

טכניקות כמו אימונוהיסטוכימיה וכתמים מערביים נחשבו לסטנדרטים של זהב לאימות מטרות חלבון במשך שנים רבות. שיטות אלה מוצאות שימוש גם היום עם שינויים קלים בפרוטוקול ותלות מועטה בטכנולוגיה מה שהופך אותם מסורבלים ומייגע מאוד. מלבד זאת, הם כוללים גם שימוש בנוגדנים יקרים אשר לא תמיד מראים את אותה ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Acetonitrile (MS grade)	Fisher Scientific	A/0620/21
Bovine Serum Albumin	HiMedia	TC194-25G
Calcium chloride	Fischer Scienific	BP510-500
Formic acid (MS grade)	Fisher Scientific	147930250
Iodoacetamide	Sigma	1149-25G
Isopropanol (MS grade)	Fisher Scientific	Q13827
Magnesium Chloride	Fischer Scienific	BP214-500
Methanol (MS grade)	Fisher Scientific	A456-4
MS grade water	Pierce	51140
Phosphate Buffer Saline	HiMedia	TL1006-500ML
Protease inhibitor cocktail	Roche Diagnostics	11873580001
Sodium Chloride	Merck	DF6D661300
TCEP	Sigma	646547
Tris Base	Merck	648310
Trypsin (MS grade)	Pierce	90058
Urea	Merck	MB1D691237
Supplies
Hypersil Gold C18 column	Thermo	25002-102130
Micropipettes	Gilson	F167380
Stage tips	MilliPore	ZTC18M008
Zirconia/Silica beads	BioSpec products	11079110z
Equipment
Bead beater (Homogeniser)	Bertin Minilys	P000673-MLYS0-A
Microplate reader (spectrophotometer)	Thermo	MultiSkan Go
pH meter	Eutech	CyberScan pH 510
Probe Sonicator	Sonics Materials, Inc	VCX 130
Shaking Drybath	Thermo	88880028
TSQ Altis mass spectrometer	Thermo	TSQ02-10002
uHPLC - Vanquish	Thermo	VQF01-20001
Vacuum concentrator	Thermo	Savant ISS 110