인간 뇌 조직에서 단백질의 다중 반응 모니터링 기반 검출을 이용한 정량적 프로테오믹스 워크플로우

요약

이 프로토콜은 임상 샘플에서 단백질의 다중 반응 모니터링 (MRM)에 대한 트리플 쿼드러폴 질량 분광계의 사용을 소개하는 것을 목표로합니다. 우리는 샘플 준비에서 임상 샘플을 위한 데이터 분석에 이르기까지 필요한 모든 예방 조치를 취하도록 체계적인 워크플로우를 제공했습니다.

초록

지난 10 년 동안 인간의 뇌 조직의 proteomic 분석은 크게 뇌의 우리의 이해를 향상했다. 그러나, 두뇌 관련 무질서는 그들의 병리학의 더 중대한 이해를 위한 필요를 필요로 하는 세계 적인 죽음의 중요한 기여자가 계속합니다. 서양 블로팅 또는 면역 집중 화학과 같은 전통적인 항체 기반 기술은 노동 집약적이고 질적이거나 반정성인 것 외에 낮은 처리량으로 고통받습니다. 기존의 대량 분광계 기반 산탄총 접근법조차도 특정 가설을 뒷받침하는 결정적인 증거를 제공하지 못합니다. 표적 프로테오믹스 접근법은 대체로 가설이 주도되며 오랫동안 사용되어 온 기존의 산탄총 프로테오믹스 접근법과 다릅니다. 다중 반응 모니터링은 탠덤 쿼드러폴 질량 분광계 또는 삼중 사중극 질량 분광계라고 불리는 특수 질량 분광계의 사용을 요구하는 이러한 표적 접근법 중 하나입니다. 현재 연구에서는, 우리는 체계적으로 더 넓은 연구 커뮤니티에이 워크 플로우를 소개하는 것을 목표로 인간의 뇌 조직을 사용하여 성공적인 탠덤 쿼드러폴 질량 분광학 기반 프로테오믹스 워크플로우를 수행하는 데 관련된 주요 단계를 강조했다.

서문

지난 10년 동안 크로마토그래피 기술에 대한 이해가 증가함에 따라 질량 분석법(MS)의 급속한 발전은 MS 기반 프로테오믹스의 발전에 크게 도움이 되었습니다. 서양 블로팅 및 면역 조직 화학과 같은 분자 생물학 기반 기술은 오랫동안 재현성 문제, 느린 소요 시간, 관찰자 간 가변성 및 단백질을 정확하게 정량화할 수 없는 것으로 인해 몇 가지 이름을 지정했습니다. 이를 위해, 고처리량 프로테오믹스 접근법의 우수한 감도는 분자 생물학자에게 세포에서 단백질의 역할을 더 잘 이해하기 위해 그들의 탐구에 있는 대체되고 더 신뢰할 수 있는 공구를 계속 제공하고 있습니다. 그러나 산탄총 프로테오믹스접근법(데이터 의존적 인수 또는 DDA)은 기기의 민감성과 해상도에 크게 의존하는 것 외에도 복잡한 조직에서 낮은 풍부한 단백질을 검출하지 못합니다. 지난 몇 년 동안 전 세계 실험실은 이러한 매우 복잡한 데이터 집합을 처리할 수 있는 컴퓨팅 성능과 신뢰할 수 있는 소프트웨어가 필요한 데이터 독립 획득(DIA)과 같은 기술을 개발해 왔습니다. 그러나 이러한 기술은 여전히 진행 중인 작업이며 사용자 친화적이지 않습니다. 표적 MS 기반 프로테오믹스 접근법은 MS 접근법의 높은 처리량 특성과 ELISA와 같은 분자 생물학 접근법의 감도 사이의 완벽한 균형을 제공합니다. 표적 질량 분광계 계 프로테오믹스 실험은 발견 기반 산탄총 프로테오믹스 실험또는 사용 가능한 문헌^1,2를통해 가설 구동 단백질 또는 펩티드를 검출하는 데 중점을 둡니다. 다중 반응 모니터링(MRM)은 복잡한 시료로부터 단백질/펩타이드의 정확한 검출 및 정량화를 위해 탠덤 쿼드러폴 질량 분광계를 사용하는 이러한 표적 MS 접근법 중 하나입니다. 이 기술은 저해상도 계측기를 사용해야함에도 불구하고 더 높은 감도와 특이성을 제공합니다.

쿼드러폴은 4개의 평행 막대로 만들어졌으며 각 막대는 대각선 반대 막대에 연결됩니다. 교대RF 와 DC 전압을 적용하여 쿼드러폴 로드 사이에 변동 필드가 생성됩니다. 쿼드러폴 내부의 이온의 궤적은 반대 막대에 걸쳐 동일한 전압의 존재에 의해 영향을받습니다. RF를 DC 전압에 적용함으로써 이온의 궤적을 안정화할 수 있습니다. 특정 이온을 선택적으로 통과할 수 있는 질량 필터로 사용할 수 있는 쿼드러폴의 이 특성입니다. 필요에 따라 쿼드러폴을 정적 모드 또는 스캐닝 모드에서 작동할 수 있습니다. 정적 모드는 지정된 m/z가 있는 이온만 통과할 수 있으므로 이 모드는 이온에 매우 선택적이고 특정합니다. 반면에 스캐닝 모드는 전체 m/z 범위에 걸쳐 이온이 통과할 수 있도록 합니다. 따라서, 탠덤 쿼드러폴 질량 분광기는 4가지 가능한 방법으로 작동할 수 있다: i) 제1 쿼드러폴은 스캐닝 모드에서 두 번째 동작하는 동안 정적 모드에서 작동; ii) 두 번째 동작이 정적 모드에서 작동하는 동안 스캐닝 모드에서 작동하는 첫 번째 쿼드러폴; iii) 스캔 모드에서 작동하는 두 쿼드러폴; 및 iv) 정적 모드^3에서작동하는 두 쿼드러폴. 일반적인 MRM 실험에서 쿼드러폴은 정적 모드에서 작동하므로 단편화 후 특정 전구체와 생성된 제품을 모니터링할 수 있습니다. 이것은 정확한 정량화를 허용하는 기술을 매우 민감하고 선택적으로 만듭니다.

분자 생물학자들에게 인간의 뇌 조직과 세포는 보물 창고입니다. 인체의 항상 흥미로운 기관의 이 놀라운 단위는 그것의 기능에 분자 및 세포 통찰력을 제공할 수 있습니다. 뇌 조직의 Proteomic 조사는 우리가 건강한 두뇌의 전신 기능을 이해하는 것을 도울 뿐 아니라 또한 몇몇 질병에 의해 가해질 때 dysregulated를 얻는 세포 통로를 이해하는 것을 도울 수 있습니다^4. 그러나, 모든 이질성을 가진 두뇌 조직은 분석하기 위하여 아주 복잡한 기관이고 분자 수준에서 변경의 더 나은 이해를 위한 공동 접근을 요구합니다. 다음 작품은 뇌 조직에서 단백질을 추출하고 MRM 분석 방법을 생성 및 최적화하는 것부터 표적의 유효성검사(그림 1)에이르기까지 전체 워크플로우를 설명합니다. 여기에서, 우리는 체계적으로 더 넓은 연구 지역 사회에 기술과 그 도전을 소개하는 것을 목적으로 인간 두뇌 조직을 사용하여 성공적인 MRM 기지를 둔 실험에 관련시킨 중요한 단계를 강조했습니다.

프로토콜

이 연구는 인간 참가자로부터 뇌 조직 샘플을 포함, 검토 및 TMH와 IITB IEC에 의해 승인 - (IITB-IEC/ 2018/019). 참가자들은 이 연구에 참여하기 위해 정보에 입각하고 서면 동의를 제공했습니다.

뇌 조직에서 추출한 단백질 1개

1. 뇌 조직의 약 50 mg의 무게와 마이크로 피펫을 사용하여 1 x 인산완충소 염선 (PBS)의 300 μL로 조직을 세척.
   참고: 이 단계는 조직의 외부 표면에 있는 혈액을 제거하기 위하여 행해지고 필요에 따라 반복되어야 합니다. 다운스트림 단백질 추정 및 처리를 방해하기 때문에 가능한 한 많은 혈액을 조직에서 제거하는 것이 좋습니다.
2. PBS를 사용하여 세차하는 다음, 조직을 포함하는 튜브에 300 μL의 분해 버퍼(Buffer A)를 추가합니다. 버퍼 A에는 8M 우레아, 50m Tris pH 8.0, 75mM NaCl, 1mM MgCl₂ 및 Protease 억제제 칵테일(제조업체의 지침에 따라)이 포함되어 있습니다.
   참고: 단백질 수율은 시료가 저장되는 조건, 시정물의 양 및 처리 하는 동안 시료 처리의 효율성에 이르기까지 여러 요인에 따라 달라 집니다. 완충제의 부피를 감소 50 mg보다 낮은 조직의 양으로 작업 할 때 비례적으로.
3. 얼음 욕조에 튜브를 유지하면서 프로브 초음파 처리기를 사용하여 조직을 lyse. 초음파 처리에 대한 다음 매개 변수를 사용합니다 : 40 % 진폭, 2분 30 분 동안 5 초 온오프 사이클.
4. 조직을 완전히 lyse하는 비터를 사용하여 조직 균질화를 계속합니다.
   참고: 이 단계는 90초 동안 중간 속도로 수행되어야 하며, 3-5분 동안 얼음에 잠복해야 합니다.
5. 4°C에서 15분 동안 6,000 x g의 튜브 내용물원심분리. 상체를 신선한 튜브로 옮기고 균일하게 섞습니다.
   참고: 샘플의 알리쿼트를 만들고 추가 사용이 될 때까지 -80°C에 보관하십시오.

2 단백질 정량화 및 품질 검사

1. BSA의 알려진 농도로 만든 표준 그래프를 사용하여 소화하기 전에 샘플을 정량화합니다.
   참고: 단백질 추정에 사용되는 분석이 단백질 용해를 만드는 데 사용되는 버퍼와 호환되는지 확인합니다. SDS-PAGE 젤을 실행하여 단백질 용해의 품질을 확인하십시오.

3 단백질 소화

1. 마이크로 원심분리기 튜브에 50μg의 단백질을 섭취하고 최종 농도가 20mM인 Tris 2-carboxyethyl 인스핀(TCEP)을 추가하여 단백질을 감소시십시오. 내용물인 37°C에서 1시간 동안 배양한다.
2. 배양 후 최종 농도가 40mM인 튜브에 요도아세아미드(IAA)를 첨가하여 감소된 단백질을 알킬 수 있다. 30 분 동안 어둠 속에서 튜브를 배양.
   참고: 튜브에 추가하기 직전에 IAA를 새로 준비하십시오.
3. 튜브내 우레아의 최종 농도가 1M 미만이도록 감소된 단백질과 알자화 단백질을 함유하는 튜브에 완충제 B를 첨가한다.
   참고: 버퍼 B는 25m Tris(pH 8.0) 및 1mM CaCl_2로 구성되어 있으며 샘플을 희석하는 데 사용됩니다. 희석시, 튜브의 내용물이 트립신을 첨가한 후 최적의 단백질 소화를 위해 8의 pH를 가지고 있는지 확인하십시오.
4. 1:30 효소에서 단백질 비에 트립신을 추가하고 일정한 흔들림으로 37°C에서 하룻밤 동안 튜브를 배양합니다.
5. 소화후, 소화된 제품을 진공 농축기에 농축한다. 이 단계에서 펩타이드는 향후 사용을 위해 -80°C에 재구성및 탈염또는 저장될 수 있다.

4 탈염 및 펩타이드 정량화

참고: 탈염 또는 펩타이드 정화는 LC-MS/MS. 염 및 샘플의 다른 오염 물질에 대한 샘플을 적재하기 전에 컬럼을 막고 기기에 손상을 일으킬 수 있습니다. 이 프로세스는 시판되는 C18 단계 팁 또는 열을 사용하여 수행할 수 있습니다.

1. 0.1% 포믹산(FA)에서 50%의 아세토닐(ACN)의 20μL로 스테이지 팁을 활성화합니다. 1분 동안 1,000 x g의 내용물 원심 분리하고 흐름을 폐기합니다.
   참고: 원심분리 조건은 절차가 끝날 때까지 동일합니다.
2. 0.1% FA에 100% ACN의 20 μL을 추가하고 4.1 단계에서와 같이 내용물 원심분리기를 추가합니다.
   참고: 활성화 단계를 몇 번 반복할 수 있습니다.
3. 활성화 후, 4.1 단계에서 수행된 단계 팁 및 원심분리기를 통해 재구성된 펩타이드 시료의 20 μL을 통과한다.
   참고: 이 단계에서 흐름을 버리지 마십시오.
4. 단계 팁에 최대 펩타이드 결합을 보장하기 위해 적어도 5 배를 통해 흐름으로 4.3 단계를 반복합니다.
5. 스테이지 팁을 통해 0.1% FA의 20 μL을 통과하고 흐름을 폐기합니다.
   참고: 더 나은 결과를 얻으려면 이 단계를 두 번 더 반복합니다.
6. ACN, 즉, 각각 40%, 60% 및 80%의 농도를 증가시킴으로써 신선한 미세분리관에서 바운드 펩티드를 엘테.
7. 진공 농축기에서 펩티드를 건조시키고 펩타이드 정량화를 진행한다.
8. 말린 펩티드를 0.1% FA로 재구성하고 Scopes 메서드^5를사용하여 정량화한다.

5 최종 목표의 전환 목록 준비

참고: 전환은 MRM 실험에서 제품(Q3) m/z 값으로 전구체 쌍을 말합니다. 펩타이드는 동일한 Q1 값이지만 Q3 값이 다른 많은 전환을 가질 수 있습니다. 트리플 쿼드러폴 질량 분광계는 펩타이드와 그 제품이 검출될 수 있는 전이에 대한 정보를 필요로 한다. 따라서 대상 실험을 시작하기 전에 전환 목록을 준비해야 합니다. SRMAtlas⁶ (https://db.systemsbiology.net/sbeams/cgi/PeptideAtlas/GetTransitions)의 온라인 리포지토리 또는 Skyline⁷ (https://skyline.ms/project/home/software/Skyline/begin.view)이라는 오픈 소스 소프트웨어를 사용하여 수행 할 수 있습니다.

1. UniProt (https://www.uniprot.org/)에서 최근 인간 proteome FASTA 파일을 다운로드하고 스카이 라인에 삽입하여 배경 proteome 파일을 만들 수 있습니다. 펩티드 설정에서, 배경 프로테오메 드롭다운으로 이동하여 추가를 클릭합니다. 다음 단계로 진행하기 전에 이 데이터베이스가 선택되고 허용된 누락된 절단 값이 0으로 설정되어 있는지 확인합니다.
2. 지금, 펩 티 드 설정에서 필터 탭에서 허용 된 펩 티 드의 길이 구분 8 받는 것 25 아미노산.
3. 전환 설정에서 필터 탭에서 전구체 요금을 2,3으로 설정하고 이온 요금을 1로 설정하고 이온 유형을 y로 설정합니다. 제품 이온은 사용자의 선택에 따라 선택할 수 있습니다. 특수 이온에 대해 프롤라인을 위해 N 단자값을 선택하고 다른 모든 매개 변수를 기본값으로 둡니다.
   참고: 펩타이드 및 전이 설정은 실험에 따라 달라질 수 있습니다.
4. 편집을 클릭하고 삽입으로이동하여 관심있는 펩티드 또는 단백질을 삽입합니다. 단백질을 삽입하려면, 그들의 가입 ID를 복사하고 특정 펩티드를 삽입하려면, 펩티드 서열을 복사. 이 소프트웨어는 액세스 용 ID를 배경 프로테오메로 매핑하고 전환 목록은 펩타이드 및 전환 설정에 따라 만들어집니다.
5. 전환 목록을 내보냅니다. 계측기 유형의드롭다운에서 올바른 계측기를 선택합니다. 최적화 실험의 경우 Skyline에서 파일당 원하는 전환 수를 설정하여 전환 목록을 더 작은 숫자로 분할하도록 선택할 수 있습니다. 이렇게 하면 계측기가 한 번의 실행에서 너무 많은 전환을 화면에 대지 않도록 합니다. 단일 메서드를 얻으려면 전환 수를 더 최적화해야 합니다.

6 LC 매개 변수

1. 0.1% FA(용매 A)와 80% ACN(용매 B)을 함유한 유기 용매를 함유한 수성 용매를 사용한 이진 용매 시스템을 사용한다.
2. 기둥 온도를 45°C로 설정합니다.
3. 450 μL/min 유량으로 10분의 LC 그라데이션을 설정합니다(표 S1에나와 있음).

7MS 매개 변수

참고 : 설명 된 분석은 TSQ 알티스 트리플 쿼드 러폴 질량 분광계에 대해 개발되고 최적화되었습니다.

1. 최적화는 Q1 및 Q3 해상도와 같은 실행 매개 변수를 최적화하고 시간과 주기 시간을 한 번에 하나씩 제공합니다. 1분기와 3분기의 0.7 해상도가 가장 효과적이라는 것을 알게 되었습니다. 사이클 시간 또는 거주 시간은 모니터링되는 펩티드의 전환 수및 평균 피크 폭에 따라 조정해야 할 수도 있습니다.
2. 표 S2 및 표 S3에서MS 매개 변수를 사용합니다. 총 메서드 지속 시간은 10분입니다.
   참고: 매개 변수는 달리 언급하지 않는 한 메서드 구체화 중 및 이후의 모든 실행에 대해 동일하게 유지됩니다. 새로운 실험의 경우 샘플 및 샘플 처리 단계의 유형에 따라 특정 매개 변수를 변경해야 할 필요가 있을 수 있습니다.

8 실행 시퀀스 및 악기 QC

1. 물의 혼합물을 준비: 메탄올: 이소프로판올: 1:1:1:1 비율로 아세토닐. 이 혼합물을 빈 것으로 사용하십시오.
2. 기기의 성능을 일관되게 모니터링하는 데 사용할 수 있는 표준 샘플에 대해 펩티드를 준비합니다. 이것은 QC 표준으로 사용됩니다. 최적화된 BSA 다이제스트로부터 펩티드를 검출하고 며칠 동안 양호하고 일관된 반응을제공합니다(그림 2).
3. 샘플을 실행하려면 서열은 몇 개의 공백으로 시작하여 QC 표준 및 임상 샘플이 뒤따릅니다. 항상 두 개의 연속 샘플 사이에 하나의 공백이 있는지 확인합니다.
4. 비교의 용이성을 위해 각 샘플의 동일한 양과 볼륨이 매번 주입되도록 하십시오.

9 방법 구체화

1. 스카이라인을 사용하여 풀로 풀린 샘플에서 얻은 예비 데이터를 분석합니다. 최상의 결과를 선택하려면 피크 모양 및 강도와 같은 올바른 피크, 전환 및 매개 변수를 찾습니다. 파일을 새 스카이라인 프로젝트로 저장합니다.
2. 라이브러리를 사용하여 최상의 일치 피크를 찾으므로 최상의 전환 목록을 찾는 것이 좋습니다. 라이브러리는 문헌 또는 사내 실험에서 사용할 수 있는 MS/MS 피크 집합입니다.
3. 새로 저장된 Skyline 프로젝트에서 새 전환 목록을 내보내고 이 전환 목록을 사용하여 새로운 방법을 만듭니다. 생성된 새 메서드에서 데이터를 획득하고 Skyline을 사용하여 전환을 구체화하는 프로세스를 반복합니다.
4. 스카이라인을 이용한 데이터 분석에 따라 펩타이드 및 전환 목록이 확정되면, 사이클 시간의 다른 순열을 시도하고 시간을 거머게 하여 방법을 미세 조정한다.
   참고: 무거운 라벨합성 펩타이드와 인덱싱된 보존 시간(iRT) 펩타이드를 사용하면 방법 세련미가^8,9로쉽게 개선된다. 따라서 이러한 펩티드를 사용하여 방법의 미세 조정을 수행하는 것이 좋습니다.
5. 구체화 실험의 보존 시간 정보를 사용하여 예약된 최종 메서드를 만듭니다(정의된 획득 창 있음).
6. 개별 과목에 대한 샘플을 준비합니다. 최종 예약된 방법을 사용하여 이러한 샘플에 대해 데이터가 수집됩니다.
7. 데이터가 수집되면 원시 파일을 스카이라인으로 가져와 서 다운스트림 분석 및 그룹 별 비교를 수행할 수 있습니다.

결과

우리는 10개의 견본에서 3개의 단백질의 상대적인 정량화를, 두뇌에 있는 이상을 가진 환자의 각 단에서 5 개의 견본을 수행했습니다. 이러한 단백질에는 뇌 세포에서 다양한 역할을 수행하는 것으로 알려진 Apolipoprotein A-I (APOA-I), 비멘틴 (VIM) 및 니코티나미드 인지질 전달제 (NAMPT)가 포함되었습니다. 데이터의 사후 분석은 스카이라인 데일리(Ver 20.2.1.286)를 사용하여 수행하였다. 3개의 단백질에 대?...

토론

면역 히스토케와 서양 얼룩같은 기술은 수년 동안 단백질 표적의 검증을 위한 금 표준으로 여겨졌습니다. 이러한 방법은 프로토콜의 사소한 수정과 기술에 대한 의존도가 거의 없어 오늘날에도 사용이 매우 번거롭고 지루합니다. 이 외에도, 그들은 또한 항상 배치에 걸쳐 동일한 특이성을 표시하지 않고 전문 지식의 큰 거래를 필요로 비싼 항체의 사용을 포함한다. 추가적으로, 질량 분석과 같은...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Acetonitrile (MS grade)	Fisher Scientific	A/0620/21
Bovine Serum Albumin	HiMedia	TC194-25G
Calcium chloride	Fischer Scienific	BP510-500
Formic acid (MS grade)	Fisher Scientific	147930250
Iodoacetamide	Sigma	1149-25G
Isopropanol (MS grade)	Fisher Scientific	Q13827
Magnesium Chloride	Fischer Scienific	BP214-500
Methanol (MS grade)	Fisher Scientific	A456-4
MS grade water	Pierce	51140
Phosphate Buffer Saline	HiMedia	TL1006-500ML
Protease inhibitor cocktail	Roche Diagnostics	11873580001
Sodium Chloride	Merck	DF6D661300
TCEP	Sigma	646547
Tris Base	Merck	648310
Trypsin (MS grade)	Pierce	90058
Urea	Merck	MB1D691237
Supplies
Hypersil Gold C18 column	Thermo	25002-102130
Micropipettes	Gilson	F167380
Stage tips	MilliPore	ZTC18M008
Zirconia/Silica beads	BioSpec products	11079110z
Equipment
Bead beater (Homogeniser)	Bertin Minilys	P000673-MLYS0-A
Microplate reader (spectrophotometer)	Thermo	MultiSkan Go
pH meter	Eutech	CyberScan pH 510
Probe Sonicator	Sonics Materials, Inc	VCX 130
Shaking Drybath	Thermo	88880028
TSQ Altis mass spectrometer	Thermo	TSQ02-10002
uHPLC - Vanquish	Thermo	VQF01-20001
Vacuum concentrator	Thermo	Savant ISS 110