Flux de travail protéomique quantitative utilisant la détection basée sur la surveillance des réactions multiples des protéines du tissu cérébral humain

Résumé

Le protocole vise à introduire l’utilisation d’un spectromètre de masse triple quadripolaire pour la surveillance des réactions multiples (MRM) des protéines provenant d’échantillons cliniques. Nous avons fourni un flux de travail systématique allant de la préparation des échantillons à l’analyse des données pour les échantillons cliniques avec toutes les précautions nécessaires à prendre.

Résumé

L’analyse protéomique du tissu cérébral humain au cours de la dernière décennie a grandement amélioré notre compréhension du cerveau. Cependant, les troubles liés au cerveau continuent d’être un contributeur majeur de décès dans le monde, nécessitant la nécessité d’une compréhension encore plus grande de leur pathobiologie. Les techniques traditionnelles à base d’anticorps comme le western blotting ou l’immunohistochimie souffrent d’un faible débit en plus d’être à forte intensité de main-d’œuvre et qualitatives ou semi-quantitatives. Même les approches conventionnelles basées sur la spectrométrie de masse au fusil de chasse ne parviennent pas à fournir des preuves concluantes à l’appui d’une certaine hypothèse. Les approches protéomiques ciblées sont largement fondées sur des hypothèses et diffèrent des approches protéomiques conventionnelles qui ont été utilisées depuis longtemps. La surveillance des réactions multiples est l’une de ces approches ciblées qui nécessite l’utilisation d’un spectromètre de masse spécial appelé spectromètre de masse quadripolaire tandem ou spectromètre de masse triple quadripolaire. Dans la présente étude, nous avons systématiquement mis en évidence les principales étapes impliquées dans la réalisation réussie d’un flux de travail protéomique basé sur la spectrométrie de masse quadripolaire en tandem en utilisant du tissu cérébral humain dans le but d’introduire ce flux de travail dans une communauté de recherche plus large.

Introduction

Au cours de la dernière décennie, les développements rapides de la spectrométrie de masse (SEP) associés à une meilleure compréhension des techniques de chromatographie ont grandement contribué à l’avancement de la protéomique basée sur la SEP. Les techniques basées sur la biologie moléculaire telles que le transfert de Western et l’immunohistochimie souffrent depuis longtemps de problèmes de reproductibilité, de délais d’exécution lents, de variabilité entre observateurs et de leur incapacité à quantifier avec précision les protéines, pour n’en nommer que quelques-unes. À cette fin, la sensibilité supérieure des approches protéomiques à haut débit continue d’offrir aux biologistes moléculaires un outil alternatif et plus fiable dans leur quête pour mieux comprendre les rôles des protéines dans les cellules. Cependant, les approches protéomiques au fusil de chasse (Acquisition dépendante des données ou DDA) ne parviennent souvent pas à détecter les protéines faiblement abondantes dans les tissus complexes en plus d’être fortement dépendantes de la sensibilité et de la résolution de l’instrument. Au cours des deux dernières années, des laboratoires du monde entier ont développé des techniques telles que l’acquisition indépendante des données (DIA) qui nécessitent une puissance de calcul accrue et des logiciels fiables pouvant gérer ces ensembles de données très complexes. Cependant, ces techniques sont encore un travail en cours et peu conviviales. Les approches protéomiques ciblées basées sur la SEP offrent un équilibre parfait entre la nature à haut débit des approches MS et la sensibilité des approches de biologie moléculaire comme ELISA. Une expérience protéomique ciblée basée sur la spectrométrie de masse se concentre sur la détection de protéines ou de peptides basés sur des hypothèses à partir d’expériences protéomiques basées sur la découverte ou dans la littérature disponible^1,2. La surveillance des réactions multiples (MRM) est l’une de ces approches ciblées de SEP qui utilise un spectromètre de masse quadripolaire en tandem pour la détection et la quantification précises des protéines / peptides à partir d’échantillons complexes. La technique offre une sensibilité et une spécificité plus élevées malgré l’utilisation d’un instrument à basse résolution.

Un quadripôle est composé de 4 tiges parallèles, chaque tige 1 nouant une connexion à la tige diagonalement opposée. Un champ fluctuant est créé entre les tiges quadripolaire en appliquant des tensions RF et CC alternées. La trajectoire des ions à l’intérieur du quadripôle est influencée par la présence des mêmes tensions sur les tiges opposées. En appliquant la RF à la tension continue, la trajectoire des ions peut être stabilisée. C’est cette propriété du quadripôle qui lui permet d’être utilisé comme filtre de masse qui peut sélectivement laisser passer des ions spécifiques. Selon les besoins, un quadripôle peut être utilisé en mode statique ou en mode de numérisation. Le mode statique ne laisse passer que les ions avec un m/z spécifié, ce qui rend le mode très sélectif et spécifique à l’ion d’intérêt. Le mode de balayage, d’autre part, permet aux ions de traverser toute la gamme m / z. Ainsi, les spectromètres de masse quadripolaire tandem peuvent fonctionner de 4 manières possibles : i) le premier quadripolaire fonctionnant en mode statique tandis que le second fonctionnant en mode balayage ; ii) le premier quadripôle fonctionnant en mode de balayage tandis que le second fonctionnant en mode statique; iii) les deux quadripôles fonctionnant en mode de balayage; et iv) les deux quadripôles fonctionnant en mode statique³. Dans une expérience MRM typique, les deux quadripôles fonctionnent en mode statique, ce qui permet de surveiller des précurseurs spécifiques et leurs produits résultants après fragmentation. Cela rend la technique très sensible et sélective permettant une quantification précise.

Pour les biologistes moléculaires, le tissu cérébral humain et ses cellules sont un trésor. Ces unités remarquables d’un organe toujours intéressant du corps humain peuvent fournir des informations moléculaires et cellulaires sur son fonctionnement. Les investigations protéomiques du tissu cérébral peuvent non seulement nous aider à comprendre le fonctionnement systémique d’un cerveau sain, mais aussi les voies cellulaires qui sont dérégulées lorsqu’elles sont infligées par une maladie⁴. Cependant, le tissu cérébral avec toute son hétérogénéité est un organe très complexe à analyser et nécessite une approche concertée pour une meilleure compréhension des changements au niveau moléculaire. Les travaux suivants décrivent l’ensemble du flux de travail, depuis l’extraction des protéines du tissu cérébral, la création et l’optimisation des méthodes de dosage MRM, jusqu’à la validation des cibles (Figure 1). Ici, nous avons systématiquement mis en évidence les principales étapes d’une expérience réussie basée sur la MRM utilisant du tissu cérébral humain dans le but de présenter la technique et ses défis à une communauté de recherche plus large.

Protocole

Cette étude porte sur des échantillons de tissus cérébraux de participants humains, examinés et approuvés par TMH et IITB IEC - (IITB-IEC/2018/019). Les participants ont donné leur consentement éclairé et écrit pour participer à cette étude.

1 Extraction de protéines à partir de tissus cérébraux

1. Peser environ 50 mg de tissu cérébral et laver le tissu avec 300 μL de solution saline tampon phosphate (PBS) à l’aide d’une micropipette.
   REMARQUE: Cette étape est effectuée pour enlever tout sang sur la surface externe du tissu et doit être répétée si nécessaire. Il est conseillé d’éliminer autant de sang que possible des tissus car cela interfère avec l’estimation et le traitement des protéines en aval.
2. Après les lavages avec PBS, ajouter 300 μL de tampon de lyse (tampon A) au tube contenant le tissu. Le tampon A contient 8 M d’urée, 50 mM de Tris pH 8,0, 75 mM de NaCl, 1 mM de MgCl₂ et un cocktail d’inhibiteurs de protéase (selon les instructions du fabricant).
   REMARQUE: Le rendement en protéines varie en fonction de plusieurs facteurs allant des conditions dans lesquelles les échantillons sont stockés, de la quantité de matière première et de l’efficacité de la manipulation des échantillons pendant le traitement. Réduire le volume du tampon A proportionnellement lorsque vous travaillez avec des quantités de tissu inférieures à 50 mg.
3. Lysez le tissu à l’aide d’un sondeur à sonde tout en gardant le tube sur un bain de glace. Utilisez les paramètres suivants pour la sonication : 40 % d’amplitude, 5 secondes de cycle d’arrêt et de 2:30 min.
4. Poursuivez l’homogénéisation des tissus à l’aide d’un batteur de billes pour lyser complètement le tissu.
   REMARQUE: Cette étape doit être effectuée à vitesse moyenne pendant 90 secondes, suivie d’une incubation sur glace pendant 3 à 5 minutes.
5. Centrifuger le contenu du tube à 6 000 x g pendant 15 min à 4 °C. Transférer le surnageant dans un tube frais et mélanger de manière homogène.
   REMARQUE: Faire des aliquotes de l’échantillon et conserver à -80 ° C jusqu’à une utilisation ultérieure.

2 Quantification des protéines et contrôle de la qualité

1. Quantifier les échantillons avant la digestion à l’aide d’un graphique standard avec les concentrations connues de BSA.
   REMARQUE: Assurez-vous que le test utilisé pour l’estimation des protéines est compatible avec le tampon utilisé pour la fabrication du lysate de protéines. Vérifiez la qualité du lysate de protéine en exécutant un gel SDS-PAGE.

3 Digestion des protéines

1. Prendre 50 μg de protéines dans un tube de microcentrifugation et réduire les protéines en ajoutant de la 2-carboxyéthylphosphine trisoxyéthyl (TCEP) de telle sorte que la concentration finale soit de 20 mM. Incuber le contenu à 37 °C pendant 1 h.
2. Après l’incubation, alkyler les protéines réduites en ajoutant de l’iodoacétamide (IAA) au tube de telle sorte que sa concentration finale soit de 40 mM. Incuber le tube dans l’obscurité pendant 30 minutes.
   REMARQUE: Préparez l’IAA fraîchement avant son ajout au tube.
3. Ajouter le tampon B au tube contenant les protéines réduites et alkylées de telle sorte que la concentration finale d’urée dans le tube soit inférieure à 1 M.
   REMARQUE: Le tampon B est composé de 25 mM de Tris (pH 8,0) et de 1 mM de CaCl₂ et est utilisé pour diluer les échantillons. Lors de la dilution, assurez-vous que le contenu du tube a un pH de 8 pour une digestion optimale des protéines après addition de trypsine.
4. Ajouter la trypsine dans un rapport enzyme/protéine de 1:30 et incuber les tubes pendant la nuit à 37 °C avec un agitement constant.
5. Après la digestion, concentrez le produit digéré dans un concentrateur sous vide. À cette étape, les peptides peuvent être reconstitués et dessalés ou stockés à -80 °C pour une utilisation future.

4 Dessalage et quantification des peptides

REMARQUE: Le dessalement ou le nettoyage des peptides est essentiel avant de charger les échantillons pour LC-MS / MS. Les sels et autres contaminants dans l’échantillon peuvent obstruer les colonnes et endommager l’instrument. Le processus peut être effectué à l’aide d’embouts ou de colonnes C18 disponibles dans le commerce.

1. Activez la pointe de la scène avec 20 μL d’acétonitrile à 50 % (ACN) dans 0,1 % d’acide formique (AF). Centrifugez le contenu à 1 000 x g pendant 1 minute et jetez le flux à travers.
   REMARQUE: Les conditions de centrifugation sont les mêmes jusqu’à la fin de la procédure.
2. Ajouter 20 μL de 100 % d’ACN dans 0,1 % de FA et centrifuger le contenu comme à l’étape 4.1.
   REMARQUE: Les étapes d’activation peuvent être répétées plusieurs fois.
3. Après l’activation, passer 20 μL d’échantillon peptidique reconstitué à travers l’extrémité de l’étage et la centrifugeuse comme effectué à l’étape 4.1.
   REMARQUE : Ne jetez pas le flux à travers cette étape.
4. Répétez l’étape 4.3 avec le flux au moins 5 fois pour assurer une liaison peptidique maximale à la pointe de la scène.
5. Passer 20 μL de 0,1 % FA à travers la pointe de la scène et jeter l’écoulement à travers.
   REMARQUE: Répétez cette étape deux fois de plus pour de meilleurs résultats.
6. Éluez les peptides liés dans un tube de microfuge frais en passant des concentrations croissantes d’ACN, c’est-à-dire 40%, 60% et 80%, respectivement.
7. Sécher les peptides dans un concentrateur sous vide et procéder à la quantification des peptides.
8. Reconstituer les peptides séchés dans 0,1% FA et quantifier en utilisant la méthode Scopes⁵.

5 Préparation de la liste de transition des objectifs finalisés

REMARQUE : Une transition fait référence à la paire de précurseurs (Q1) aux valeurs m/z du produit (Q3) dans une expérience MRM. Un peptide peut avoir une à plusieurs transitions, avec la même valeur Q1 mais des valeurs Q3 différentes. Un spectromètre de masse triple quadripolaire nécessite des informations sur les transitions pour que les peptides et leurs produits soient détectés. Par conséquent, avant de commencer une expérience ciblée, une liste de transition doit être préparée. Cela peut être fait en utilisant le référentiel en ligne de SRMAtlas⁶ (https://db.systemsbiology.net/sbeams/cgi/PeptideAtlas/GetTransitions) ou un logiciel open source appelé Skyline⁷ (https://skyline.ms/project/home/software/Skyline/begin.view).

1. Téléchargez le récent fichier FASTA de protéome humain à partir d’UniProt (https://www.uniprot.org/) et créez un fichier de protéome d’arrière-plan en l’insérant dans Skyline. Dans les paramètres peptidiques, allez dans la liste déroulante Protéome d’arrière-plan et cliquez sur Ajouter. Feed dans le fichier de séquence FASTA du protéome humain. Assurez-vous que cette base de données est sélectionnée et que la valeur de clivage manquée autorisée est définie sur 0 avant de passer à l’étape suivante.
2. Maintenant, sous l’onglet Filtre dans Paramètres peptidiques, délimitez la longueur des peptides acceptés de 8 à 25 acides aminés.
3. Dans Paramètres de transition, sous l’onglet Filtre, définissez Les charges de précurseur sur 2,3, définissez Charges d’ions sur 1 et définissez Types d’ions sur y. Les ions de produit peuvent être sélectionnés en fonction du choix de l’utilisateur. Sélectionnez N-terminal à proline pour les ions spéciaux et laissez tous les autres paramètres par défaut.
   REMARQUE: Les paramètres de peptide et de transition peuvent varier en fonction de l’expérience.
4. Insérez les peptides ou les protéines d’intérêt en cliquant sur Modifier et en passant à Insérer. Pour insérer des protéines, copier leurs D’accession et pour insérer des peptides spécifiques, copier les séquences peptidiques. Le logiciel mappe les D’acquisition au protéome d’arrière-plan et la liste de transition est créée en fonction du peptide et des paramètres de transition.
5. Exportez la liste de transition. Assurez-vous que dans la liste déroulante Type d’instrument, le bon instrument est sélectionné. Pour les expériences d’optimisation, on peut choisir de diviser les listes de transition en nombres plus petits en définissant le nombre souhaité de transitions par fichier dans Skyline. Cela garantira que l’instrument n’est pas submergé pour filtrer trop de transitions en une seule fois. Le nombre de transitions doit être encore optimisé pour obtenir une méthode unique - nous le mentionnons désormais dans la section affinement de la méthode.

6 paramètres LC

1. Utilisez un système de solvant binaire avec le solvant aqueux contenant 0,1% de FA (Solvant A) et le solvant organique contenant 80% d’ACN (Solvant B).
2. Réglez la température de la colonne sur 45 °C.
3. Définissez un gradient LC de 10 min avec un débit de 450 μL/min (comme indiqué dans le tableau S1).

7 paramètres MS

REMARQUE: Le test expliqué a été développé et optimisé pour le spectromètre de masse triple quadripolaire TSQ Altis.

1. Optimisez les paramètres d’exécution tels que la résolution Q1 et Q3, le temps d’attente et le temps de cycle - un paramètre à la fois. Nous constatons que la résolution 0.7 pour Q1 et Q3 fonctionne le mieux. Le temps de cycle ou le temps de séjour peut devoir être modifié en fonction du nombre de transitions et de la largeur de crête moyenne des peptides surveillés.
2. Utilisez les paramètres MS des tableaux S2 et S3. La durée totale de la méthode est de 10 min.
   REMARQUE : Les paramètres restent les mêmes pour toutes les exécutions pendant et après l’affinement de la méthode, sauf indication contraire. Pour une nouvelle expérience, il peut être nécessaire de modifier certains paramètres en fonction du type d’échantillon et des étapes de traitement de l’échantillon.

8 Séquence d’exécution et QC de l’instrument

1. Préparer un mélange d’eau: méthanol: isopropanol: acétonitrile dans un rapport de 1: 1: 1: 1. Utilisez ce mélange comme un blanc.
2. Préparez des peptides pour tout échantillon standard pouvant être utilisé pour surveiller de manière cohérente les performances de l’instrument. Cela sera utilisé comme norme de contrôle qualité. Nous détectons les peptides des digestions BSA qui ont été optimisés et donnent une réponse bonne et cohérente sur plusieurs jours (Figure 2).
3. Pour exécuter des échantillons, la séquence doit commencer par quelques blancs, suivis de la norme QC et des échantillons cliniques. Assurez-vous toujours qu’il y a un blanc entre deux échantillons consécutifs.
4. Pour faciliter la comparaison, assurez-vous que des quantités et des volumes égaux de chaque échantillon sont injectés à chaque fois.

9 Raffinement de la méthode

1. Analysez les données préliminaires obtenues à partir des échantillons regroupés à l’aide de Skyline. Recherchez le pic, les transitions et les paramètres corrects tels que la forme et l’intensité du pic pour sélectionner les meilleurs résultats. Enregistrez le fichier en tant que nouveau projet Skyline.
2. Utilisez une bibliothèque pour trouver le meilleur pic correspondant et, par conséquent, la meilleure liste de transition possible est conseillée. Une bibliothèque est un ensemble de pics de MS / MS disponibles à partir de la littérature ou d’expériences internes.
3. Exportez une nouvelle liste de transition à partir du projet Skyline nouvellement enregistré et utilisez cette liste de transition pour créer une nouvelle méthode. Acquérez des données à partir de la nouvelle méthode créée et répétez le processus d’affinement des transitions à l’aide de Skyline.
4. Une fois la liste des peptides et des transitions finalisée après l’analyse des données à l’aide de Skyline, affinez la méthode en essayant différentes permutations du temps de cycle et du temps de séjour.
   REMARQUE: L’utilisation de peptides synthétiques lourds marqués et de peptides à temps de rétention indexé (iRT) facilite le raffinement de la méthode^8,9. Il est donc conseillé d’affiner la méthode à l’aide de ces peptides.
5. À l’aide des informations de temps de rétention des expériences d’affinement, créez une méthode finale planifiée (avec une fenêtre d’acquisition définie).
6. Préparez des échantillons pour des sujets individuels. Les données seront acquises pour ces échantillons à l’aide de la méthode planifiée finale.
7. Une fois les données acquises, une analyse en aval et une comparaison par groupe peuvent être effectuées en important les fichiers bruts dans Skyline.

Résultats

Nous avons effectué une quantification relative de 3 protéines à partir de 10 échantillons, 5 échantillons de chaque groupe de patients présentant des anomalies dans le cerveau. Ces protéines comprenaient l’apolipoprotéine A-I (APOA-I), la vimentine (VIM) et la nicotinamide phosphoribosyltransférase (NAMPT) qui sont connues pour jouer divers rôles dans les cellules du cerveau. L’analyse post-exécution des données a été effectuée à l’aide de Skyline-daily (Ver 20.2.1.286). Au total, 10 peptides corre...

Discussion

Des techniques telles que l’immunohistochimie et le Western blotting ont été considérées comme les étalons-or pour la validation des cibles protéiques pendant de nombreuses années. Ces méthodes trouvent une utilisation même aujourd’hui avec des modifications mineures dans le protocole et peu de dépendance à la technologie, ce qui les rend très lourdes et fastidieuses. En outre, ils impliquent également l’utilisation d’anticorps coûteux qui ne présentent pas toujours la même spécificité entre le...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Acetonitrile (MS grade)	Fisher Scientific	A/0620/21
Bovine Serum Albumin	HiMedia	TC194-25G
Calcium chloride	Fischer Scienific	BP510-500
Formic acid (MS grade)	Fisher Scientific	147930250
Iodoacetamide	Sigma	1149-25G
Isopropanol (MS grade)	Fisher Scientific	Q13827
Magnesium Chloride	Fischer Scienific	BP214-500
Methanol (MS grade)	Fisher Scientific	A456-4
MS grade water	Pierce	51140
Phosphate Buffer Saline	HiMedia	TL1006-500ML
Protease inhibitor cocktail	Roche Diagnostics	11873580001
Sodium Chloride	Merck	DF6D661300
TCEP	Sigma	646547
Tris Base	Merck	648310
Trypsin (MS grade)	Pierce	90058
Urea	Merck	MB1D691237
Supplies
Hypersil Gold C18 column	Thermo	25002-102130
Micropipettes	Gilson	F167380
Stage tips	MilliPore	ZTC18M008
Zirconia/Silica beads	BioSpec products	11079110z
Equipment
Bead beater (Homogeniser)	Bertin Minilys	P000673-MLYS0-A
Microplate reader (spectrophotometer)	Thermo	MultiSkan Go
pH meter	Eutech	CyberScan pH 510
Probe Sonicator	Sonics Materials, Inc	VCX 130
Shaking Drybath	Thermo	88880028
TSQ Altis mass spectrometer	Thermo	TSQ02-10002
uHPLC - Vanquish	Thermo	VQF01-20001
Vacuum concentrator	Thermo	Savant ISS 110