İnsan Beyin Dokusundan Proteinlerin Çoklu Reaksiyon İzleme Tabanlı Tespiti Kullanılarak Nicel Proteomik İş Akışı

Özet

Protokol, klinik örneklerden elde edilen proteinlerin Çoklu Reaksiyon İzlemesi (MRM) için üçlü dörtlü kütle spektrometresi kullanımını sağlamayı amaçlamaktadır. Alınması gereken tüm önlemlerle klinik numuneler için numune hazırlamadan veri analizine kadar sistematik bir iş akışı sağladık.

Özet

Son on yılda insan beyin dokusunun proteomik analizi beyin anlayışımızı büyük ölçüde artırdı. Bununla birlikte, beyinle ilgili bozukluklar, patobiyolojilerinin daha da fazla anlaşılması ihtiyacını gerektiren, dünyadaki ölümlerin önemli bir katkısı olmaya devam ediyor. Batı şişkinliği veya immünhistokimya gibi geleneksel antikor bazlı teknikler, emek yoğun ve nitel veya yarı nicel olmanın yanı sıra düşük verimden muzdariptir. Geleneksel kütle spektrometresi bazlı av tüfeği yaklaşımları bile belirli bir hipotezi destekleyecek kesin kanıtlar sunamaz. Hedefli proteomik yaklaşımlar büyük ölçüde hipotez odaklıdır ve uzun süredir kullanımda olan geleneksel av tüfeği proteomik yaklaşımlarından farklıdır. Çoklu reaksiyon izleme, tandem dörtlü kütle spektrometresi veya üçlü dörtlü kütle spektrometresi adı verilen özel bir kütle spektrometresinin kullanılmasını gerektiren bu tür hedefli bir yaklaşımdır. Mevcut çalışmada, bu iş akışını daha geniş bir araştırma topluluğuna tanıtmak amacıyla insan beyin dokusunu kullanarak başarılı bir tandem dörtlü kütle spektrometresi tabanlı proteomik iş akışının gerçekleştirilmesinde önemli adımları sistematik olarak vurguladık.

Giriş

Son on yılda, kütle spektrometreslerindeki (MS) hızlı gelişmeler ve kromatografi tekniklerinin daha fazla anlaşılması, MS tabanlı proteomiklerin ilerlemesine büyük ölçüde yardımcı oldu. Batı şişkinliği ve immünhistokimya gibi moleküler biyoloji tabanlı teknikler uzun zamandır tekrarlanabilirlik sorunları, yavaş geri dönüş süresi, gözlemciler arası değişkenlik ve proteinleri doğru bir şekilde ölçememelerinden muzdariptir. Bu amaçla, yüksek verimli proteomik yaklaşımların üstün duyarlılığı, moleküler biyologlara proteinlerin hücrelerdeki rollerini daha iyi anlama arayışında alternatif ve daha güvenilir bir araç sunmaya devam ediyor. Bununla birlikte, av tüfeği proteomik yaklaşımları (Veriye bağımlı Edinme veya DDA), genellikle cihazın hassasiyetine ve çözünürlüğüne büyük ölçüde güvenmenin yanı sıra karmaşık dokularda düşük bol proteinleri tespit edemez. Son birkaç yıldır, dünyanın dört bir yanındaki laboratuvarlar, daha fazla bilgi işlem gücü ve bu son derece karmaşık veri kümelerini işleyebilen güvenilir yazılım gerektiren Veri Bağımsız Edinimi (DIA) gibi teknikler geliştiriyor. Ancak, bu teknikler hala devam eden bir çalışmadır ve çok kullanıcı dostu değildir. Hedeflenen MS tabanlı proteomik yaklaşımlar, MS yaklaşımlarının yüksek verimli doğası ile ELISA gibi moleküler biyoloji yaklaşımlarının hassasiyeti arasında mükemmel bir denge sağlar. Hedefli kütle spektrometresi tabanlı proteomik deney, hipotez güdümlü proteinleri veya peptitleri keşif tabanlı av tüfeği proteomik deneylerinden veya mevcut literatür^1,2aracılığıyla tespit etmeye odaklanır. Çoklu Reaksiyon İzleme (MRM), karmaşık örneklerden proteinlerin/peptitlerin doğru tespiti ve nicelleştirilmesi için tandem dörtlü kütle spektrometresi kullanan bu tür hedefli bir MS yaklaşımıdır. Teknik, düşük çözünürlüklü bir cihazın kullanılmasını gerektirmesine rağmen daha yüksek hassasiyet ve özgüllük sunar.

Dörtgen, her çubuğu çapraz olarak karşı çubuğa bağlı olan 4 paralel çubuktan yapılmıştır. Dörtlü çubuklar arasında alternatif RF ve DC gerilimleri uygulanarak dalgalı bir alan oluşturulur. Dörtlünün içindeki iyonların yörüngesi, karşı çubuklar boyunca aynı voltajların varlığından etkilenir. RF'yi DC voltaja uygulayarak, iyonların yörüngesi stabilize edilebilir. Dörtlünün bu özelliği, belirli iyonların geçmesine seçici olarak izin verebilen bir kütle filtresi olarak kullanılmasına izin verir. İhtiyace bağlı olarak, bir dörtlü statik modda veya tarama modunda çalıştırılabilir. Statik mod, yalnızca belirli bir m/z'ye sahip iyonların geçmesine izin verir, bu da modu son derece seçici ve ilgi iyonlarına özgü hale getirir. Öte yandan tarama modu, tüm m/z aralığındaki iyonların geçmesine izin verir. Böylece, tandem dörtlü kütle spektrometreleri 4 olası şekilde çalışabilir: i) statik modda çalışan ilk dörtlü, ikincisi ise tarama modunda çalışır; ii) tarama modunda çalışan ilk dörtlü, ikincisi ise statik modda çalışır; iii) tarama modunda çalışan her iki dörtlü; ve iv) statik modda çalışan her iki dörtlü³. Tipik bir MRM deneyinde, her iki dörtlü de statik modda çalışır ve parçalanmadan sonra belirli öncüllerin ve elde edilen ürünlerinin izlenmesini sağlar. Bu, tekniği çok hassas ve seçici hale getirerek doğru niceleme sağlar.

Moleküler biyologlar için, insan beyin dokusu ve hücreleri bir hazinedir. İnsan vücudunun sürekli ilginç bir organının bu olağanüstü birimleri, işleyişi hakkında moleküler ve hücresel içgörüler sağlayabilir. Beyin dokusunun proteomik incelemeleri sadece sağlıklı bir beynin sistemik işleyişini anlamamıza yardımcı olmakla kalmaz, aynı zamanda bazı hastalıklar tarafından ortaya çıktığında disregüle olan hücresel yolları da anlamamıza yardımcı olabilir⁴. Bununla birlikte, tüm heterojenliği ile beyin dokusu analiz etmek için çok karmaşık bir organdır ve moleküler düzeydeki değişikliklerin daha iyi anlaşılması için uyumlu bir yaklaşım gerektirir. Aşağıdaki çalışma, beyin dokusundan proteinlerin çıkarılmasından, MRM test yöntemlerinin oluşturulmasından ve optimizelanmasından hedeflerin doğrulanmasına kadar tüm iş akışını açıklar (Şekil 1). Burada, tekniği ve zorluklarını daha geniş bir araştırma topluluğuna tanıtmak amacıyla insan beyin dokusunu kullanarak yapılan başarılı MRM tabanlı bir deneyde yer alan önemli adımları sistematik olarak vurguladık.

Protokol

Bu çalışma, TMH ve IITB IEC tarafından incelenen ve onaylanan insan katılımcılardan alınan beyin dokusu örneklerini içerir - (IITB-IEC/2018/019). Katılımcılar bu çalışmaya katılmak için bilgilendirilmiş ve yazılı onaylarını sunmaktadır.

1 Beyin dokusundan protein ekstraksiyonu

1. Yaklaşık 50 mg beyin dokusu ağırlığında ve bir mikropipette kullanarak dokuyu 300 μL 1x fosfat tampon salin (PBS) ile yıkayın.
   NOT: Bu adım, dokunun dış yüzeyindeki herhangi bir kanı çıkarmak için gerçekleştirilir ve gerekirse tekrarlanmalıdır. Aşağı akış protein tahmini ve işlenmesine müdahale ettiği sürece dokudan mümkün olduğunca fazla kan çıkarılması tavsiye edilir.
2. PBS ile yıkamaları takiben, dokuyu içeren tüpe 300 μL lizis tamponu (Tampon A) ekleyin. Tampon A, 8 M üre, 50 mM Tris pH 8.0, 75 mM NaCl, 1 mM MgCl₂ ve Proteaz inhibitörü kokteyli içerir (üreticinin talimatlarına göre).
   NOT: Protein verimi, numunelerin depolandığı koşullardan, başlangıç malzemesi miktarına ve numunelerin işlenirken işlenmesinin verimliliğine kadar çeşitli faktörlere bağlı olarak değişir. 50 mg'dan daha düşük miktarda doku ile çalışırken tampon A hacmini orantılı olarak azaltın.
3. Tüpü buz banyosunda tutarken sonda sonicator kullanarak dokuyu lyse. Sonication için aşağıdaki parametreleri kullanın: 2:30 dakika boyunca% 40 genlik, 5 saniye açma ve kapama döngüsü.
4. Dokuyu tamamen izlendirmek için boncuk çırpıcı kullanarak doku homojenizasyonuna devam edin.
   NOT: Bu adım 90 saniye orta hızda yapılmalı ve ardından 3-5 dakika boyunca buz üzerinde inkübasyon yapılmalıdır.
5. Tüpün içeriğini 4 °C'de 15 dakika boyunca 6.000 x g'da santrifüj edin. Süpernatant taze bir tüpe aktarın ve homojen bir şekilde karıştırın.
   NOT: Numunenin aliquots olun ve bir sonraki kullanıma kadar -80 °C'de saklayın.

2 Protein nicelleştirme ve kalite kontrolü

1. Bilinen BSA konsantrasyonları ile yapılan standart bir grafik kullanarak sindirimden önce örnekleri ölçün.
   NOT: Protein tahmini için kullanılan testlerin protein lysate yapımında kullanılan tamponla uyumlu olduğundan emin olun. Bir SDS-PAGE jeli çalıştırarak protein lisatının kalitesini kontrol edin.

3 Protein sindirimi

1. Bir mikro santrifüj tüpüne 50 μg protein alın ve tris 2-karboksitetil fosfin (TCEP) ekleyerek proteinleri azaltın, böylece son konsantrasyon 20 mM'dir. İçeriği 37 °C'de 1 saat kuluçkaya yatırın.
2. Kuluçkadan sonra, tüpe iodoasetamid (IAA) ekleyerek azaltılmış proteinleri alkillatın, böylece son konsantrasyonu 40 mM'dir. Tüpü 30 dakika boyunca karanlıkta kuluçkaya bırakın.
   NOT: IAA'yı tüpe eklenmeden hemen önce yeni bir şekilde hazırlayın.
3. Azaltılmış ve alkillenmiş proteinleri içeren tüpe B tamponu ekleyin, böylece tüpteki son üre konsantrasyonu 1 M'den azdır.
   NOT: B tamponu 25 mM Tris (pH 8.0) ve 1 mM CaCl_2'den oluşur ve numunelerin seyreltilmede kullanılır. Seyreltme üzerine, tripin ilavesi sonrasında optimum protein sindirimi için tüpün içeriğinin pH'ının 8 pH olduğundan emin olun.
4. Protein oranına 1:30 enziminde tripsin ekleyin ve tüpleri sürekli sallanarak 37 °C'de bir gecede kuluçkaya yatırın.
5. Sindirimden sonra, sindirilen ürünü bir vakum konsantratörde konsantre edin. Bu adımda, peptitler yeniden inşa edilebilir ve tuzdan arındırılabilir veya gelecekteki kullanım için -80 ° C'de saklanabilir.

4 Tuzdan arındırma ve peptit nicelemesi

NOT: LC-MS/MS için numuneleri yüklemeden önce tuzdan arındırma veya peptit temizliği esastır. İşlem, piyasada bulunan C18 aşama uçları veya sütunları kullanılarak gerçekleştirilebilir.

1. %0,1 formik asitte (FA) %50 asetonitril (ACN) 20 μL ile sahne ucunu etkinleştirin. İçeriği 1 dakika boyunca 1.000 x g'da santrifüj edin ve akışı atın.
   NOT: Santrifüjleme koşulları prosedürün sonuna kadar aynıdır.
2. %0,1 SK'ya 20 μL %100 ACN ekleyin ve 4.1.
   NOT: Etkinleştirme adımları birkaç kez tekrarlanabilir.
3. Aktivasyonu takiben, 4.1 adımında gerçekleştirilen 20 μL yeniden inşa edilmiş peptit örneğini aşama ucu ve santrifüjden geçirin.
   NOT: Bu adımda akışı atmayın.
4. Aşama ucuna maksimum peptit bağlamasını sağlamak için 4.3.
5. 20 μL%0,1 FA'yı aşama ucundan geçirin ve akışı atın.
   NOT: Daha iyi sonuçlar için bu adımı iki kez daha yineleyin.
6. Bağlı peptitleri taze bir mikrofuge tüpünde sırasıyla artan ACN konsantrasyonlarını, yani% 40, % 60 ve% 80'i geçirerek emüle edin.
7. Peptitleri vakum konsantratöründe kurutun ve peptit nicelleştirmesi için devam edin.
8. Kurutulmuş peptitleri% 0.1 SK'da yeniden inşa edin ve Scopes yöntemini kullanarak ölçün⁵.

5 Kesinleşen hedeflerin geçiş listesi hazırlığı

NOT: Geçiş, MRM denemesinde ürün (Q3) m/z değerlerine öncül (Q1) çiftini ifade eder. Bir peptit, aynı Q1 değerine ancak farklı Q3 değerlerine sahip bir ila birçok geçişe sahip olabilir. Üçlü dörtlü kütle spektrometresi, peptitlerin ve ürünlerinin tespit edilmesi için geçişlerin bilgisini gerektirir. Bu nedenle, hedeflenen bir deneye başlamadan önce bir geçiş listesi hazırlanması gerekir. Bu, SRMAtlas^6'nın (https://db.systemsbiology.net/sbeams/cgi/PeptideAtlas/GetTransitions) çevrimiçi deposu veya Skyline⁷ (https://skyline.ms/project/home/software/Skyline/begin.view) adlı açık kaynaklı bir yazılım kullanılarak yapılabilir.

1. UniProt'tan (https://www.uniprot.org/) son insan proteom FASTA dosyasını indirin ve Skyline'a ekleyerek bir arka plan proteom dosyası oluşturun. Peptit ayarlarında, Arka Plan Proteom açılır menüsüne gidin ve insan proteomunun FASTA sıra dosyasında Ekle. Bir sonraki adıma geçmeden önce bu veritabanının seçili olduğundan ve izin verilen kaçırılan bölünme değerinin 0 olarak ayarlandığından emin olun.
2. Şimdi, Peptit Ayarları'ndaki Filtre sekmesinin altında, kabul edilen peptitlerin uzunluğunu 8 ila 25 amino asit arasında sınırlayın.
3. Geçiş Ayarları'nda, Filtre sekmesi altında Öncül Ücretleri 2,3 olarak ayarlayın, İyon Ücretlerini 1 olarak ayarlayın ve İyon Türlerini y olarak ayarlayın. Ürün iyonları kullanıcının seçimine bağlı olarak seçilebilir. Özel iyonlar için proline için N-terminali seçin ve diğer tüm parametreleri varsayılan olarak bırakın.
   NOT: Peptit ve geçiş ayarları deneye göre değişebilir.
4. Düzenle 'ye tıklayıp Ekle 'ye geçerek ilgi çekici peptitleri veya proteinleri ekleyin. Protein eklemek, katılım kimliklerini kopyalamak ve belirli peptitler eklemek için peptit dizilerini kopyalayın. Yazılım, katılım kimliklerini arka plan proteom ile eşleştirır ve geçiş listesi peptit ve geçiş ayarlarına göre oluşturulur.
5. Geçiş listesini dışarı aktar. Enstrüman Türüaçılır menüsüne doğru cihazın seçildiğine emin olun. En iyi duruma getirme denemeleri için, Skyline'da dosya başına istenen geçiş sayısını ayarlayarak geçiş listelerini daha küçük sayılara bölmeyi seçebilirsiniz. Bu, cihazın tek bir çalıştırmada çok fazla geçişi ekrana getirmek için ezilmemesini sağlayacaktır. Tek bir yöntem elde etmek için geçiş sayısının daha da optimize edilmesi gerekir - bundan sonra yöntem iyileştirme bölümünde bahsettiğimiz.

6 LC parametreleri

1. %0,1 FA (Solvent A) içeren sulu çözücü ve %80 ACN (Solvent B) içeren organik çözücü içeren ikili çözücü sistemi kullanın.
2. Kolon sıcaklığını 45 °C olarak ayarlayın.
3. 450 μL/dk akış hızına sahip 10 dakikalık bir LC degradesi ayarlayın (Tablo S1'degösterildiği gibi).

7 MS parametreleri

NOT: Açıklanan test, TSQ Altis Üçlü Dörtgen Kütle Spektrometresi için geliştirilmiş ve optimize edilmiştir.

1. Q1 ve Q3 çözünürlük gibi çalıştırma parametrelerini optimize edin, durma süresi ve döngü süresi - her seferinde bir parametre. Q1 ve Q3 için 0.7 çözünürlüğün en iyi şekilde çalıştığını görüyoruz. Döngü süresi veya durma süresinin, izlenen peptitlerin geçiş sayısına ve ortalama tepe genişliğine göre değiştirilmesi gerekebilir.
2. Tablo S2 ve Tablo S3'teki MS parametrelerini kullanın. Toplam yöntem süresi 10 dk'dır.
   NOT: Aksi belirtilmedikçe, parametreler yöntem iyileştirmesi sırasında ve sonrasındaki tüm çalıştırmalar için aynı kalır. Yeni bir deneme için, örnek ve örnek işleme adımlarının türüne bağlı olarak belirli parametreleri değiştirme ihtiyacı olabilir.

8 Koşu sırası ve Enstrüman QC

1. Bir su karışımı hazırlayın: metanol: izopropanol: asetonitril 1:1:1:1 oranında. Bu karışımı boş olarak kullanın.
2. Peptitleri, cihazın performansını sürekli olarak izlemek için kullanılabilecek herhangi bir standart numune için hazırlayın. Bu bir QC standardı olarak kullanılacaktır. BSA sindirmelerinden optimize edilmiş peptitleri tespit ediyoruz ve birkaç gün boyunca iyi ve tutarlı yanıt veriyoruz(Şekil 2).
3. Örnekleri çalıştırmak için, sıra birkaç boşlukla başlamalı ve ardından QC standardı ve klinik örnekler almalıdır. Her zaman ardışık iki örnek arasında bir boşluk olduğundan emin olun.
4. Karşılaştırma kolaylığı için, her numunenin eşit miktarda ve hacimde her seferinde enjekte edildiğinden emin olun.

9 Yöntem iyileştirmesi

1. Skyline kullanarak havuza alınan örneklerden elde edilen ön verileri analiz edin. En iyi sonuçları seçmek için doğru tepe noktasını, geçişleri ve tepe şekli ve yoğunluğu gibi parametreleri arayın. Dosyayı yeni bir Skyline projesi olarak kaydedin.
2. En iyi eşleşen tepeyi bulmak için bir kitaplık kullanın ve sonuç olarak mümkün olan en iyi geçiş listesi önerilir. Kitaplık, literatür veya şirket içi deneylerden elde edilen ms/ms zirveleri kümesidir.
3. Yeni kaydedilen Skyline projesinden yeni bir geçiş listesi dışa aktarın ve yeni bir yöntem yapmak için bu geçiş listesini kullanın. Oluşturulan yeni yöntemden veri alın ve Skyline kullanarak geçişleri iyileştirme işlemini tekrarlayın.
4. Skyline kullanılarak veri analizinden sonra peptitlerin ve geçişlerin listesi tamamlandıktan sonra, döngü süresinin ve durma süresinin farklı permütasyonlarını deneyerek yönteme ince ayar yapın.
   NOT: Ağır etiketli sentetik peptitlerin ve indekslenmiş tutma süresi (iRT) peptitlerinin kullanımı yöntem iyileştirmesini kolaylaştırır^8,9. Bu nedenle, yöntemin ince ayarının bu peptitler kullanılarak yapılması tavsiye edilir.
5. İyileştirme denemelerindeki saklama süresi bilgilerini kullanarak, zamanlanmış son bir yöntem oluşturun (tanımlı bir edinme penceresine sahip).
6. Örnekleri tek tek denekler için hazırlayın. Bu örnekler için son zamanlanmış yöntem kullanılarak veri elde edilecektir.
7. Veriler elde edildikten sonra, ham dosyalar Skyline'a alınarak daha fazla aşağı akış analizi ve grup açısından karşılaştırma yapılabilir.

Sonuçlar

10 numuneden 3 proteinin, beyinde anormallikleri olan her hasta grubundan 5 numunenin göreli nicelemesini gerçekleştirdik. Bu proteinler arasında beyin hücrelerinde çeşitli roller üstlenerek bilinen Apolipoprotein A-I (APOA-I), Vimentin (VIM) ve Nikotinamid fosforibosyltransferaz (NAMPT) yer aldı. Verilerin çalıştırma sonrası analizi Skyline-daily (Ver 20.2.1.286) kullanılarak gerçekleştirildi. 3 proteine karşılık gelen toplam 10 peptit izlendi. Bunlar arasında APOA-I için 3 peptit, VIM için 4 pept...

Tartışmalar

İmmünohistokinoloji ve Batı şişkinliği gibi teknikler uzun yıllar boyunca protein hedeflerinin doğrulanmasında altın standartlar olarak kabul edildi. Bu yöntemler, protokoldeki küçük değişiklikler ve teknolojiye çok az bağımlılık ile bugün bile kullanım bulur ve bu da onları çok hantal ve sıkıcı hale getirir. Bunun yanı sıra, partiler arasında her zaman aynı özgüllüğü göstermeyen ve çok fazla uzmanlık gerektiren pahalı antikorların kullanımını da içerirler. Ek olarak, kütle...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Acetonitrile (MS grade)	Fisher Scientific	A/0620/21
Bovine Serum Albumin	HiMedia	TC194-25G
Calcium chloride	Fischer Scienific	BP510-500
Formic acid (MS grade)	Fisher Scientific	147930250
Iodoacetamide	Sigma	1149-25G
Isopropanol (MS grade)	Fisher Scientific	Q13827
Magnesium Chloride	Fischer Scienific	BP214-500
Methanol (MS grade)	Fisher Scientific	A456-4
MS grade water	Pierce	51140
Phosphate Buffer Saline	HiMedia	TL1006-500ML
Protease inhibitor cocktail	Roche Diagnostics	11873580001
Sodium Chloride	Merck	DF6D661300
TCEP	Sigma	646547
Tris Base	Merck	648310
Trypsin (MS grade)	Pierce	90058
Urea	Merck	MB1D691237
Supplies
Hypersil Gold C18 column	Thermo	25002-102130
Micropipettes	Gilson	F167380
Stage tips	MilliPore	ZTC18M008
Zirconia/Silica beads	BioSpec products	11079110z
Equipment
Bead beater (Homogeniser)	Bertin Minilys	P000673-MLYS0-A
Microplate reader (spectrophotometer)	Thermo	MultiSkan Go
pH meter	Eutech	CyberScan pH 510
Probe Sonicator	Sonics Materials, Inc	VCX 130
Shaking Drybath	Thermo	88880028
TSQ Altis mass spectrometer	Thermo	TSQ02-10002
uHPLC - Vanquish	Thermo	VQF01-20001
Vacuum concentrator	Thermo	Savant ISS 110