Fluxo de trabalho de proteômica quantitativa usando detecção baseada em monitoramento de múltiplas reações de proteínas do tecido cerebral humano

Resumo

O protocolo visa introduzir o uso de um espectrômetro de massa quadrupole triplo para monitoramento de reação múltipla (MRM) de proteínas de amostras clínicas. Fornecemos um fluxo de trabalho sistemático desde a preparação da amostra até a análise de dados para amostras clínicas com todas as precauções necessárias a serem tomadas.

Resumo

A análise proteômica do tecido cerebral humano na última década aumentou muito nossa compreensão do cérebro. No entanto, os distúrbios cerebrais continuam a ser um dos principais contribuintes das mortes em todo o mundo, necessitando da necessidade de uma compreensão ainda maior de sua patobiologia. Técnicas tradicionais baseadas em anticorpos, como a mancha ocidental ou a imunohistoquímica sofrem de baixa produtividade, além de serem intensivas em mão-de-obra e qualitativas ou semi-quantitativas. Mesmo abordagens convencionais baseadas em espectrometria de massa não fornecem evidências conclusivas para apoiar uma determinada hipótese. As abordagens proteômicas direcionadas são em grande parte orientadas por hipóteses e diferem das abordagens convencionais de proteômica da espingarda que têm sido há muito tempo em uso. O monitoramento de reação múltipla é uma dessas abordagens direcionadas que requer o uso de um espectrômetro de massa especial chamado espectrômetro de massa quadrupole tandem ou espectrômetro de massa quadrupole triplo. No presente estudo, temos destacado sistematicamente os principais passos envolvidos na realização de um fluxo de trabalho de protetrometria de massa baseado em espectrometria de massa tandem bem sucedido usando tecido cerebral humano com o objetivo de introduzir esse fluxo de trabalho a uma comunidade de pesquisa mais ampla.

Introdução

Durante a última década, os rápidos desenvolvimentos da espectrometria de massa (MS) juntamente com o aumento da compreensão das técnicas de cromatografia ajudaram muito no avanço da proteômica baseada em MS. Técnicas baseadas em biologia molecular, como a mancha ocidental e a imunohistoquímica, há muito sofrem com problemas de reprodutibilidade, tempo de reviravolta lento, variabilidade entre observadores e sua incapacidade de quantificar com precisão proteínas, para citar alguns. Para isso, a sensibilidade superior das abordagens proteômicas de alto rendimento continua a oferecer aos biólogos moleculares uma ferramenta alternativa e mais confiável em sua busca para entender melhor os papéis das proteínas nas células. No entanto, as abordagens de proteômica de espingarda (Aquisição dependente de dados ou DDA) muitas vezes não conseguem detectar proteínas de baixa abundância em tecidos complexos, além de serem fortemente dependentes da sensibilidade e resolução do instrumento. Nos últimos dois anos, laboratórios em todo o mundo vêm desenvolvendo técnicas como o Data Independent Acquisition (DIA) que exigem maior poder computacional e software confiável que pode lidar com esses conjuntos de dados altamente complexos. No entanto, essas técnicas ainda são um trabalho em andamento e não muito fáceis de usar. Abordagens de proteômica baseadas em MS fornecem um equilíbrio perfeito entre a natureza de alto rendimento das abordagens de ESM e a sensibilidade de abordagens de biologia molecular como a ELISA. Um experimento de proteômica baseado em espectrometria de massa focado na detecção de proteínas ou peptídeos baseados em hipóteses a partir de experimentos de proteômica de espingarda baseada em descobertas ou através da literatura disponível^1,2. O Monitor de Reação Múltipla (MRM) é uma abordagem de MS direcionada que usa um espectrômetro de massa quadrupole tandem para detecção precisa e quantificação de proteínas/peptídeos a partir de amostras complexas. A técnica oferece maior sensibilidade e especificidade, apesar de exigir o uso de um instrumento de baixa resolução.

Um quadrupole é feito de 4 hastes paralelas, com cada haste conectada à haste diagonalmente oposta. Um campo flutuante é criado entre as hastes quadrupoles aplicando tensões de RF e DC alternadas. A trajetória dos íons dentro do quadrupole é influenciada pela presença das mesmas tensões através de hastes opostas. Aplicando o RF à tensão DC, a trajetória dos íons pode ser estabilizada. É esta propriedade do quadrupole que permite que ele seja usado como um filtro de massa que pode seletivamente deixar íons específicos passarem. Dependendo da necessidade, um quadrúpole pode ser operado no modo estático ou no modo de digitalização. O modo estático permite que apenas íons com um m/z especificado passem, tornando o modo altamente seletivo e específico para o íon de interesse. O modo de digitalização, por outro lado, permite que íons em toda a faixa m/z passem. Assim, os espectrômetros de massa de quadrupole tandem podem operar de 4 maneiras possíveis: i) o primeiro quadrupole operando no modo estático enquanto o segundo operando no modo de digitalização; ii) o primeiro quadrúpole operando no modo de digitalização enquanto o segundo opera no modo estático; iii) ambos os quadrupoles que operam no modo de digitalização; iv) ambos quadrupoles operando no modo estático³. Em um experimento típico de MRM, ambos os quadrupoles operam no modo estático permitindo que precursores específicos e seus produtos resultantes após a fragmentação sejam monitorados. Isso torna a técnica muito sensível e seletiva permitindo quantificação precisa.

Para biólogos moleculares, o tecido cerebral humano e suas células são um tesouro. Essas unidades notáveis de um órgão sempre interessante do corpo humano podem fornecer insights moleculares e celulares sobre seu funcionamento. Investigações proteômicas do tecido cerebral podem não apenas nos ajudar a entender o funcionamento sistêmico de um cérebro saudável, mas também as vias celulares que são desreguladas quando infligidas por alguma doença⁴. No entanto, o tecido cerebral com toda a sua heterogeneidade é um órgão muito complexo para analisar e requer uma abordagem concertada para uma melhor compreensão das mudanças no nível molecular. O trabalho a seguir descreve todo o fluxo de trabalho começando desde a extração de proteínas do tecido cerebral, criando e otimizando os métodos para ensaios de MRM, até a validação dos alvos(Figura 1). Aqui, temos destacado sistematicamente os principais passos envolvidos em um experimento bem-sucedido baseado em MRM usando tecido cerebral humano com o objetivo de introduzir a técnica e seus desafios para uma comunidade de pesquisa mais ampla.

Protocolo

Este estudo envolve amostras de tecido cerebral de participantes humanos, revisadas e aprovadas pela TMH e IITB IEC - (IITB-IEC/2018/019). Os participantes forneceram seu consentimento informado e por escrito para participar deste estudo.

1 Extração de proteínas do tecido cerebral

1. Pesar cerca de 50 mg de tecido cerebral e lavar o tecido com 300 μL de soro fisiológico tampão de fosfato de 1x (PBS) usando uma micropipette.
   NOTA: Esta etapa é realizada para remover qualquer sangue na superfície externa do tecido e deve ser repetida se necessário. É aconselhável remover o máximo possível de sangue do tecido, pois interfere na estimativa e processamento da proteína a jusante.
2. Após as lavagens com PBS, adicione 300 μL de tampão de lise (Buffer A) ao tubo que contém o tecido. Buffer A contém 8 M de ureia, 50 mM Tris pH 8.0, 75 mM NaCl, 1 mM MgCl₂ e coquetel inibidor protease (de acordo com as instruções do fabricante).
   NOTA: O rendimento da proteína varia dependendo de vários fatores que vão desde as condições em que as amostras são armazenadas, a quantidade de material inicial e a eficiência do manuseio das amostras durante o processamento. Reduza o volume de tampão A proporcionalmente ao trabalhar com quantidades de tecido inferiores a 50 mgs.
3. Lyse o tecido usando um sônico sonda enquanto mantém o tubo em um banho de gelo. Use os seguintes parâmetros para sônicação: 40% de amplitude, 5 segundos dentro e fora do ciclo durante 2:30 min.
4. Continue com a homogeneização do tecido usando um batedor de contas para lise completamente o tecido.
   NOTA: Esta etapa deve ser realizada em velocidade média durante 90 segundos, seguida de incubação no gelo por 3-5 minutos.
5. Centrifugar o conteúdo do tubo a 6.000 x g por 15 min a 4 °C. Transfira o supernante para um tubo fresco e misture de forma homogênea.
   NOTA: Faça alíquotas da amostra e armazene a -80°C até que use mais.

2 Quantificação de proteínas e verificação de qualidade

1. Quantifique as amostras antes da digestão usando um gráfico padrão feito com concentrações conhecidas de BSA.
   NOTA: Certifique-se de que o ensaio que está sendo utilizado para a estimativa de proteína é compatível com o tampão usado para fazer o lise de proteína. Verifique a qualidade do lysate de proteína executando um gel SDS-PAGE.

3 Digestão de proteínas

1. Tome 50 μg de proteína em um tubo de microcrífuga e reduza as proteínas adicionando Tris 2-carboxyethyl phosphine (TCEP) de tal forma que a concentração final seja de 20 mM. Incubar o conteúdo a 37 °C por 1 h.
2. Após a incubação, aquila as proteínas reduzidas adicionando iodoacetamida (IAA) ao tubo de tal forma que sua concentração final seja de 40 mM. Incubar o tubo no escuro por 30 minutos.
   NOTA: Prepare o IAA recentemente antes de sua adição ao tubo.
3. Adicione o tampão B ao tubo contendo as proteínas reduzidas e alquiladas, de tal forma que a concentração final de ureia no tubo seja inferior a 1 M.
   NOTA: O buffer B é composto por 25 mM Tris (pH 8.0) e 1 mM CaCl₂ e é usado para diluir as amostras. Após a diluição, certifique-se de que o conteúdo do tubo tenha um pH de 8 para a digestão de proteínas ideal após a adição de trippsina.
4. Adicione trippsina em uma razão de 1:30 enzima para proteína e incubar os tubos durante a noite a 37 °C com agitação constante.
5. Após a digestão, concentre o produto digerido em um concentrador de vácuo. Nesta etapa, os peptídeos podem ser reconstituídos e dessel ou armazenados a -80 °C para uso futuro.

4 Quantificação de desalização e peptídeo

NOTA: A limpeza de desalamento ou peptídeo é essencial antes de carregar as amostras para LC-MS/MS. Sais e outros contaminantes da amostra podem entupir as colunas e causar danos ao instrumento também. O processo pode ser realizado utilizando-se dicas ou colunas de estágio C18 disponíveis comercialmente.

1. Ative a ponta do palco com 20 μL de acetonitrila (ACN) em ácido fórmico de 0,1% (FA). Centrifugar o conteúdo a 1.000 x g por 1 minuto e descartar o fluxo através.
   NOTA: As condições para centrifugação são as mesmas até o final do procedimento.
2. Adicione 20 μL de 100% ACN em 0,1% FA e centrifugar o conteúdo como na etapa 4.1.
   NOTA: As etapas de ativação podem ser repetidas algumas vezes.
3. Após a ativação, passe 20 μL de amostra de peptídeo reconstituído através da ponta de palco e centrífuga como realizado na etapa 4.1.
   NOTA: Não descarte o fluxo nesta etapa.
4. Repita o passo 4.3 com o fluxo pelo menos 5 vezes para garantir a ligação máxima do peptídeo à ponta do palco.
5. Passe 20 μL de 0,1% FA através da ponta de estágio e descarte o fluxo através.
   NOTA: Repita esta etapa mais duas vezes para melhores resultados.
6. Elute os peptídeos encadernados em um tubo de microfuge fresco, passando concentrações crescentes de ACN, ou seja, 40%, 60% e 80%, respectivamente.
7. Seque os peptídeos em um concentrador de vácuo e prossiga para quantificação de peptídeos.
8. Reconstituir os peptídeos secos em 0,1% FA e quantificar usando o método Scopes⁵.

5 Preparação da lista de transição de metas finalizadas

NOTA: Uma transição refere-se ao par de precursores (Q1) aos valores do produto (Q3) m/z em um experimento MRM. Um peptídeo pode ter uma a muitas transições, com o mesmo valor do Q1, mas valores diferentes do Q3. Um espectrômetro de massa quadrupole triplo requer informações das transições para que os peptídeos e seus produtos sejam detectados. Portanto, antes de iniciar um experimento direcionado, uma lista de transição precisa ser preparada. Isso pode ser feito usando o repositório on-line do SRMAtlas⁶ (https://db.systemsbiology.net/sbeams/cgi/PeptideAtlas/GetTransitions) ou um software de código aberto chamado Skyline⁷ (https://skyline.ms/project/home/software/Skyline/begin.view).

1. Baixe o recente arquivo human proteome FASTA do UniProt (https://www.uniprot.org/) e crie um arquivo proteome de fundo inserindo-o no Skyline. Nas configurações do peptídeo, vá para a dropdown do Proteome de fundo e clique em Adicionar. Alimentação no arquivo sequência FASTA do proteome humano. Certifique-se de que este banco de dados está selecionado e o valor de decote perdido permitido está definido para 0 antes de prosseguir para a próxima etapa.
2. Agora, sob a guia Filtro em Configurações de Peptídeos delimitar o comprimento dos peptídeos aceitos de 8 a 25 aminoácidos.
3. Em Configurações de transição, em Filter tab set Precursor Charges como 2,3, definir cargas de íons como 1 e definir tipos de íons para y. Os íons do produto podem ser selecionados dependendo da escolha do usuário. Selecione N-terminal para proline para íons especiais e deixe todos os outros parâmetros como padrão.
   NOTA: As configurações de peptídeo e transição podem variar de acordo com o experimento.
4. Insira os peptídeos ou proteínas de interesse clicando em Editar e movendo-se para Inserir. Para inserir proteínas, copie suas IDs de adesão e insira peptídeos específicos, copie as sequências de peptídeos. O software mapeia os IDs de adesão ao proteome de fundo e a lista de transição é criada com base nas configurações de peptídeo e transição.
5. Exporte a lista de transição. Certifique-se de que na desistência para tipo de instrumento,o instrumento certo é selecionado. Para os experimentos de otimização, pode-se optar por dividir as listas de transição em números menores, definindo o número desejado de transições por arquivo no Skyline. Isso garantirá que o instrumento não seja sobrecarregado para exibir muitas transições em uma única execução. O número de transições precisa ser ainda mais otimizado para obter um único método - isso mencionamos a partir de agora sob a seção de refinamento do método.

6 parâmetros LC

1. Use um sistema de solvente binário com o solvente aquoso contendo 0,1% fa (Solvente A) e o solvente orgânico contendo 80% de ACN (Solvente B).
2. Coloque a temperatura da coluna em 45 °C.
3. Defina um gradiente LC de 10 minutos com um fluxograma de 450 μL/min (como mostrado na Tabela S1).

Parâmetros de 7 MS

NOTA: O ensaio explicado foi desenvolvido e otimizado para o Espectrômetro de Massa TSQ Altis Altis Triple Quadrupole.

1. Otimizar executa parâmetros como resolução Q1 e Q3, tempo de moradia e tempo de ciclo - um parâmetro de cada vez. Achamos que a resolução de 0,7 para o 1º e o 3º trimestre funciona melhor. O tempo de ciclo ou o tempo de moradia podem precisar ser ajustados de acordo com o número de transições e a largura média de pico dos peptídeos sendo monitorados.
2. Use os parâmetros MS na Tabela S2 e Tabela S3. A duração total do método é de 10 minutos.
   NOTA: Os parâmetros permanecem iguais para todas as corridas durante e após o refinamento do método, a menos que mencionado o contrário. Para um experimento novo, pode haver a necessidade de alterar certos parâmetros dependendo do tipo de etapas de processamento de amostras e amostras.

8 Executar sequência e Instrumento QC

1. Prepare uma mistura de água: metanol: isopropanol: acetonitrilo na proporção 1:1:1:1. Use esta mistura como um branco.
2. Prepare peptídeos para qualquer amostra padrão que possa ser usada para monitorar consistentemente o desempenho do instrumento. Este será usado como um padrão QC. Detectamos peptídeos de digestores BSA que foram otimizados e dão uma resposta boa e consistente ao longo de vários dias(Figura 2).
3. Para executar amostras, a sequência deve começar com um par de espaços em branco, seguido pelo padrão QC e amostras clínicas. Certifique-se sempre de que há um branco entre duas amostras consecutivas.
4. Para facilitar a comparação, certifique-se de que quantidades iguais e volumes de cada amostra sejam injetados todas as vezes.

9 Refinamento de método

1. Analise os dados preliminares obtidos a partir das amostras agrupadas usando Skyline. Procure o pico certo, transições e parâmetros como forma de pico e intensidade para selecionar os melhores resultados. Salve o arquivo como um novo projeto Skyline.
2. Use uma biblioteca para encontrar o melhor pico de correspondência e, consequentemente, a melhor lista de transição possível é aconselhável. Uma biblioteca é um conjunto de picos de MS/MS disponíveis a partir da literatura ou experimentos internos.
3. Exporte uma nova lista de transição do projeto Skyline recém-salvo e use esta lista de transição para fazer um método novo. Adquira dados do novo método criado e repita o processo de refinação das transições usando o Skyline.
4. Uma vez que a lista de peptídeos e transições é finalizada após a análise de dados usando Skyline, ajuste o método experimentando diferentes permutações de tempo de ciclo e tempo de moradia.
   NOTA: O uso de peptídeos sintéticos com rótulo pesado e peptídeos indexados (iRT) torna o refinamento do método fácil^8,9. Portanto, é aconselhável que a sintonia fina do método seja realizada utilizando esses peptídeos.
5. Usando as informações do tempo de retenção dos experimentos de refinamento, crie um método final que está programado (ter uma janela de aquisição definida).
6. Prepare amostras para indivíduos. Os dados serão adquiridos para essas amostras utilizando o método final programado.
7. Uma vez que os dados são adquiridos, uma análise mais a jusante e comparação em grupo pode ser realizada importando os arquivos brutos para o Skyline.

Resultados

Foram realizadas quantificação relativa de 3 proteínas de 10 amostras, 5 amostras de cada grupo de pacientes com anormalidades no cérebro. Essas proteínas incluíam Apolipoprotein A-I (APOA-I), Vimentina (VIM) e Nicotinamida phosphoribosyltransferase (NAMPT) que são conhecidas por desempenhar diversos papéis nas células cerebrais. A análise pós-execução dos dados foi realizada utilizando-se skyline-daily (Ver 20.2.1.286). Foram monitorados 10 peptídeos correspondentes a 3 proteínas. Estes incluíram 3 pept?...

Discussão

Técnicas como a imunohistoquímica e a mancha ocidental foram consideradas como os padrões de ouro para validação de alvos proteicos por muitos anos. Esses métodos encontram uso ainda hoje com pequenas modificações no protocolo e pouca dependência da tecnologia tornando-os muito complicados e tediosos. Além disso, envolvem também o uso de anticorpos caros que nem sempre mostram a mesma especificidade entre os lotes e exigem muita expertise. Além disso, apenas uma pequena fração de proteínas identificadas u...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Acetonitrile (MS grade)	Fisher Scientific	A/0620/21
Bovine Serum Albumin	HiMedia	TC194-25G
Calcium chloride	Fischer Scienific	BP510-500
Formic acid (MS grade)	Fisher Scientific	147930250
Iodoacetamide	Sigma	1149-25G
Isopropanol (MS grade)	Fisher Scientific	Q13827
Magnesium Chloride	Fischer Scienific	BP214-500
Methanol (MS grade)	Fisher Scientific	A456-4
MS grade water	Pierce	51140
Phosphate Buffer Saline	HiMedia	TL1006-500ML
Protease inhibitor cocktail	Roche Diagnostics	11873580001
Sodium Chloride	Merck	DF6D661300
TCEP	Sigma	646547
Tris Base	Merck	648310
Trypsin (MS grade)	Pierce	90058
Urea	Merck	MB1D691237
Supplies
Hypersil Gold C18 column	Thermo	25002-102130
Micropipettes	Gilson	F167380
Stage tips	MilliPore	ZTC18M008
Zirconia/Silica beads	BioSpec products	11079110z
Equipment
Bead beater (Homogeniser)	Bertin Minilys	P000673-MLYS0-A
Microplate reader (spectrophotometer)	Thermo	MultiSkan Go
pH meter	Eutech	CyberScan pH 510
Probe Sonicator	Sonics Materials, Inc	VCX 130
Shaking Drybath	Thermo	88880028
TSQ Altis mass spectrometer	Thermo	TSQ02-10002
uHPLC - Vanquish	Thermo	VQF01-20001
Vacuum concentrator	Thermo	Savant ISS 110