Un modelo murino singénico de endometriosis utilizando ratones de ciclo natural

Resumen

Muchos modelos de roedores de endometriosis están limitados por la complejidad técnica, la reproducibilidad y / o la necesidad de animales inmunocomprometidos o ratones reporteros especiales. Presentamos un sistema simplificado de inducción de lesiones utilizando cualquier ratón experimental con un sistema de puntuación objetivo verificable de forma independiente y sin necesidad de ovariectomía o cirugía de supervivencia.

Resumen

La endometriosis es una de las principales causas de dolor pélvico e infertilidad. Se define por la presencia de tejido endometrial en localizaciones extrauterinas. El desarrollo de nuevas terapias y herramientas de diagnóstico para la endometriosis ha sido limitado debido en parte a los desafíos en el estudio de la enfermedad. Fuera de los primates, pocos mamíferos menstrúan y ninguno desarrolla endometriosis espontánea. Los modelos de roedores son populares, pero requieren la inducción artificial de la endometriosis, y muchos utilizan ratones inmunocomprometidos o enfermedades inducidas quirúrgicamente. Recientemente, se ha prestado más atención a los modelos que involucran la inyección intraperitoneal. Presentamos un modelo murino de endometriosis que integra varias características de los modelos de endometriosis existentes en un sistema novedoso y simplificado que se basa en la cuantificación microscópica en lugar de la clasificación subjetiva. En este modelo, realizamos estimulación hormonal de ratones donantes, inyección intraperitoneal, estudio abdominal sistemático y recolección de tejidos, y cuantificación histológica que se puede realizar y verificar en cualquier momento después de la necropsia. Este modelo requiere recursos y capacitación mínimos; no requiere experiencia de técnicos de laboratorio en cirugía de supervivencia murina o en la identificación de lesiones endometriósicas macroscópicas; se puede utilizar en ratones inmunocomprometidos, inmunocompetentes y/o mutantes; y crea de manera confiable lesiones endometriósticas que son histológicamente consistentes con la enfermedad endometrióstica humana.

Introducción

La endometriosis es una enfermedad enigmática del tracto reproductivo femenino con importantes cargas financieras y de salud para las mujeres^1,2. La etiología de la endometriosis no se comprende completamente, y se han propuesto múltiples explicaciones que incluyen metaplasia celómica, restos müllerianos embrionarios, reclutamiento de células progenitoras derivadas de la médula ósea y menstruación retrógrada³. Si bien múltiples aspectos de estos mecanismos propuestos pueden estar involucrados, y ninguna explicación única puede explicar todas las formas de la enfermedad, el modelo principal de patogénesis de la endometriosis es la menstruación retrógrada. La menstruación retrógrada es el paso del efluente menstrual a través de las trompas de Falopio y hacia la cavidad peritoneal; se estima que el 90% de las mujeres que menstrúan regularmente se someten a la menstruación retrógrada^4,5. Dado este fenómeno común de la menstruación retrógrada, no está claro por qué la endometriosis se desarrolla solo en un subconjunto de mujeres⁵. Para comprender mejor la etiología de esta enfermedad, los estudios directos en humanos no son factibles y se justifican los estudios en animales.

La endometriosis es un reto tanto para tratar como para estudiar. La prevalencia de la enfermedad no se conoce, pero se estima que es del 10%¹. Si bien algunos tipos avanzados de endometriosis pueden identificarse con precisión a través de imágenes no invasivas, un diagnóstico definitivo solo se logra a través del análisis histopatológico de muestras de biopsia obtenidas quirúrgicamente; lesiones que visualmente parecen estar enfermas, de hecho pueden ser fibrosis o cicatrices por otras causas⁶. La gravedad y la extensión de la enfermedad no se correlacionan con la sintomatología⁷.

Las lesiones de endometriosis consisten en tipos celulares heterogéneos y poblaciones que interactúan de manera compleja dentro del microambiente, por lo tanto, limitando la utilidad de los modelos celulares^8,9. Los modelos in vivo existen, pero estos tienen desafíos y limitaciones inherentes^10,11,12. Los modelos de primates son ideales, pero a menudo no son factibles^13,14,15. Pocos mamíferos no primates menstrúan y desarrollan endometriosis espontáneamente¹⁶. Existen modelos de endometriosis en roedores, pero cada uno tiene limitaciones¹⁷. Muchos de estos modelos requieren cirugía de supervivencia para suturar o implantar tejido endometrial en la pared receptora donante o en el intestino, agregando complejidad técnica, necesidad de anestesia y factores inmunes confusos de la cirugía en sí^18,19,20. Además, muchos modelos requieren ovariectomía y suplementos de estrógeno; al tiempo que aumenta el rendimiento de la lesión, esto agrega tiempo, gastos y cirugía de supervivencia adicional. Los modelos de inyección intraperitoneal (IP) no requieren anestesia ni cirugía de supervivencia, y estos modelos lógicamente simulan la menstruación retrógrada mejor que los modelos de sutura^21,22,23. La mayoría de los modelos IP, sin embargo, están sujetos a una mayor variabilidad en la ubicación de la lesión debido a la dispersión aleatoria de fragmentos endometriales después de la inyección y, por lo tanto, a un mayor sesgo en la identificación y medición de la lesión.

Aquí presentamos un modelo murino de endometriosis que integra varias características de los modelos de endometriosis existentes en un sistema novedoso, simplificado y eficiente que se basa en la cuantificación microscópica en lugar de la clasificación subjetiva.

Protocolo

NOTA: El uso de animales en este estudio fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) en el Instituto de Investigación Lerner de la Clínica Cleveland. Todos los estándares de cuidado y uso de animales disponibles públicamente se realizaron siguiendo las pautas de los Institutos Nacionales de Salud. Este procedimiento utiliza técnicas asépticas. La placa de Petri es estéril. El PBS/solución salina utilizado es estéril. Los instrumentos quirúrgicos para la necropsia y la disección de tejidos se esterilizan mediante autoclave. Utilizamos un 70% de EtOH en los instrumentos entre casos de animales (si hay más de uno por sesión) para disminuir la contaminación.

1. Preparación de ratones donantes y receptores (ver Figura 1)

1. Asegúrese de que existe la aprobación adecuada para trabajar con animales de laboratorio.
2. Determine la tensión del ratón. En estos experimentos, se utilizaron ratones de tipo salvaje y mutantes con antecedentes C57BL / 6J, pero los investigadores que utilizan modelos similares informan éxito con otras cepas de ratón como los ratones BALB / c¹⁰. Además, los ratones donantes y/o receptores pueden utilizar sistemas de reporteros, como ratones GFP o RFP (ver Figura 2 y Figura 3).
3. Para el momento del trasplante de tejido endometrial, asegúrese de que los ratones donantes tienen entre 22 y 24 días de edad en el momento de la inyección de gonadotropina. Esto asegura que sean reproductivamente ingenuos, por ejemplo, que aún no hayan comenzado el ciclo estral.
4. Asegúrese de que los ratones receptores estén reproductivamente intactos (sin ovariectomía previa) entre los 2 y los 4 meses de edad. Si bien no es necesario, se recomienda colocar la ropa de cama empapada en orina de una jaula de ratones machos periódicamente en la jaula del receptor para facilitar el ciclo estral en curso y nuevamente a las 72 h antes del trasplante de tejido endometrial.
   NOTA: Esto no asegurará la sincronización del ciclo estral de los receptores, ya que la colocación de la ropa de cama empapada en orina depende en gran medida de la cantidad de ropa de cama masculina utilizada y tiene resultados variables. Si se desea la sincronización del ciclo estral, tres inyecciones subcutáneas consecutivas de 100 ng/100 μL estradiol llevarán a todos los animales a la fase estral. Si bien no encontramos diferencias en la inducción de la lesión en función de la fase del ciclo estral, otros grupos han encontrado que la fase del ciclo es importante¹⁰.
5. Inyecte por vía subcutánea gonadotropina sérica de yegua embarazada (PMSG, 2 UI diluidas en 200 μL) en ratones donantes por vía subcutánea utilizando una aguja fina(serecomiendan 25-27 G). No le dé PMSG a los ratones receptores, ya que desencadenará la ovulación y el posterior ambiente de alta progesterona, que es menos receptivo a la formación de endometriosis.
   NOTA: Los modelos de ratón anteriores han utilizado PMSG o estrógeno para estimular la proliferación endometrial en los ratones donantes antes de la cosecha endometrial²³. PmSG se recomienda por las siguientes razones: La vida media de PMSG es de 40 h, mientras que la vida media de 17-beta-estradiol es de solo 2 h. La utilización de una sola inyección subcutánea de PMSG en los donantes 40 h antes de la obtención de tejido endometrial proporciona una duración sostenida de la exposición a la estimulación con gonadotropina, que actúa para estimular el estrógeno endógeno. Muchas preparaciones de estrógeno exógeno requieren múltiples inyecciones para preparar adecuadamente el endometrio.
6. Después de la inyección de PMSG, programe la necropsia, la obtención y el trasplante en el receptor entre 38-42 h. Cronometre la cosecha de tejido endometrial después de la inyección de gonadotropina para asegurar la recolección de tejido antes de la ovulación, que ocurre a las 42 h después de la inyección. La ovulación produce un ambiente alto de progesterona (P4), lo que reduciría el establecimiento de lesiones.

2. Obtención de tejido endometrial de ratón donante

1. Después de la eutanasia del ratón donante (utilizando la cámara de CO₂ seguida de dislocación cervical), rocíe el abdomen con una solución de etanol al 70%; esto sirve para reducir la contaminación del tejido obtenido de la flora de la piel y de los pelos desalojados. Con tijeras de disección, haga un recorte transversal poco profundo en la línea media a través de la piel y el tejido subcutáneo. Luego, agarrando cada lado de la incisión en la piel, use tracción contundente para abrir el abdomen.
2. Identificar el útero. Antes de extirpar el útero, recorte el tejido conectivo adyacente. Transecte cada cuerno uterino justo debajo de su respectiva trompa de Falopio y luego transecte el cuello uterino para extirpar todo el útero en bloque.
3. Después de la extracción de la cavidad abdominal, inspeccione el útero cuidadosamente y elimine cualquier grasa periférica adicional o tejido conectivo. Coloque el útero en una gota de PBS frío en una placa de Petri. Determinar y documentar la masa combinada de todo el útero.
4. Transecte cada cuerno desde el fondo de fondo del útero, haciendo que la transección sea lo más cercana posible al fondo de la unión para maximizar la longitud de cada cuerno. Con la ayuda de un microscopio de disección, coloque una hoja de las tijeras de disección dentro de la luz del primer cuerno, luego corte a lo largo del eje principal del tubo. Abra cuidadosamente el tubo, teniendo en cuenta qué lado es la serosa y qué lado es el epitelio.
5. Ponga 500 cc de solución salina o PBS en una nueva placa de Petri; el líquido permanecerá unido debido a la tensión superficial.
6. Luego, realice la fragmentación del útero de manera uniforme. Es mejor tener menos lesiones más grandes que muchas lesiones más pequeñas. Comience separando el epitelio del miometrio agarrando la capa endometrial y pelándola.
   1. Alternativamente, simplemente fragmente el tejido sin separarse del miometrio (siempre que el lado epitelial esté completamente expuesto), pero retener el miometrio disminuye la relevancia fisiológica de este modelo para la enfermedad humana. Asegúrese de que los fragmentos sean lo más grandes posible pero lo suficientemente pequeños como para pasar a través de una aguja de 18 G; (Se recomienda 1 mm x 1 mm).
   2. Recolecte 10-12 de estos fragmentos de 1 mm x 1 mm del primer cuerno (que corresponde aproximadamente a 40 mg de tejido en los ratones C57BL / 6J). Coloque los fragmentos recolectados en la colección de líquidos.
7. Realice los mismos pasos para el otro cuerno uterino para un total de aproximadamente 24 fragmentos por ratón. Documente el número total de fragmentos.

3. Inyección peritoneal de fragmentos de tejido en el ratón receptor

1. Aspirar los fragmentos suspendidos de 1 mm x 1 mm utilizando el extremo romo de una jeringa de 1 cc; el volumen total debe ser de 1 ml.
2. Conecte una aguja de 18 G a la jeringa completa y cargue el líquido en la aguja. Considere una inyección simulada de nuevo en la placa de Petri para asegurarse de que todo el tejido pase a través de la aguja.
3. Tome el ratón receptor. Ya sea antes o después de la inyección IP, obtenga un frotis vaginal del ratón receptor para la documentación del ciclo estral (10 μL de solución salina utilizando la jeringa de bulbo en el orificio vaginal y chapada en el portaobjetos de vidrio con la funda).
4. Realizar inyección intraperitoneal de los fragmentos con la jeringa en un ángulo de 45 grados, teniendo cuidado de no inyectar por vía subcutánea.
5. Si quedan fragmentos después de la inyección, extraiga 200 μL adicionales del líquido en la jeringa para inyección para asegurarse de que todos los fragmentos se inyecten con éxito por vía intraperitoneal.
6. Una vez que tenga la seguridad de que no habrá sangrado ni complicaciones, coloque a los ratones receptores de nuevo en sus jaulas y alimente con una dieta normal.

4. Cosecha de lesiones endometriósticas

1. Sacrificar a los ratones receptores aproximadamente 21 días después de la inyección de fragmentos después del trasplante.
   NOTA: Por experiencia y por discusión con colaboradores utilizando modelos similares, el tamaño máximo de la lesión y el número ocurren aproximadamente a las 3 semanas después del trasplante; después de 3 semanas, las lesiones comienzan a retroceder en tamaño. Se utiliza el método de eutanasia aprobado por la IACUC.
2. Después de la eutanasia y la dislocación cervical, rocíe el abdomen del animal con etanol al 70% y tienda la piel para cortar superficialmente con tijeras de disección. Incite la piel y el espacio subcutáneo con tijeras para abrir sin rodeos el abdomen.
3. Antes de realizar cualquier disección adicional, se realiza un estudio completo de las lesiones macrópicas, con el tamaño medido por calibradores y documentado en cuanto a su región anatómica (ver más abajo).
4. Realizar la recolección completa de tres regiones anatómicas distintas en bloque (independientemente de si las lesiones se pueden apreciar o no de forma grosera). Si se observan lesiones en otras regiones (por ejemplo, intestinos), estas deben ignorarse y no recogerse a menos que la lesión atraviese una de las tres áreas a continuación.
   1. A = pared abdominal/peritoneo (puede aplanarse en un cassette o enrollarse, siempre que sea consistente entre las muestras).
   2. B = páncreas y grasa mesentérica.
   3. C = tejido conectivo parauterino y grasa (tejido blanco brillante que rodea el útero pero no involucra ningún otro órgano que no sea la vejiga; tenga cuidado de no confundir la vejiga con una lesión).
5. Coloque cada área diseccionada en un casete, debidamente etiquetada, y colóquela en formalina y procese según el protocolo de laboratorio para la seccionamiento histológico.
6. Bloques de formalina de sección en dos diapositivas (D1 y D2) por área de tejido a dos profundidades uniformes.

5. Puntuación de las lesiones endometriósticas

1. Escanee (con un aumento de 40x) y archive diapositivas.
2. Utilice un software de lectura digital de diapositivas, defina la distancia más larga (X) entre los bordes de una lesión endometrióstica, ya sea que el borde consista en glándulas o estroma, y márquelo. Una lesión continua se define por glándulas rodeadas de estroma; la línea no necesariamente atraviesa solo tejido endometriósico (como en el caso de determinar puntos finales en un foco de endometriosis de forma irregular u ondulante), sino que los dos puntos finales deben estar conectados por estroma continuo y / o glándulas (ver Figura 4).
3. Haga una segunda línea (Y) de 90 grados a través de la primera línea, con la longitud de la segunda línea determinada siguiendo las reglas anteriores.
4. Si se encuentran múltiples lesiones no contiguas, dé a cada una sus propias medidas X e Y.
5. Calcule la puntuación final de cada diapositiva como la suma de áreas (X*Y) de cada lesión.
6. Tome la mayor de las puntuaciones de las dos diapositivas (D1 vs D2) como la puntuación final para esa región (A, B, C).
7. Totaliza las puntuaciones de cada región para dar la puntuación microscópica final para ese animal.

Resultados

Para un experimento inicial de prueba de concepto, se inyectó endometrio de donantes de ratones RFP en ratones receptores de tipo salvaje. La tinción de H&E reveló la confirmación histopatológica de la arquitectura clásica de la lesión de endometriosis(Figura 3A). La microscopía fluorescente confirmó que la lesión observada en cuestión se originó en el donante (Figura 3B).

El segundo experimento se realizó utilizando 10 d...

Discusión

Nuestro estudio demuestra que la endometriosis se puede inducir de manera confiable en ratones sin requerir el uso de ovariectomía y / o cirugía de supervivencia, y que las lesiones endometriales ectópicas se pueden identificar y cuantificar utilizando una encuesta estandarizada del abdomen y el análisis histológico.

Muchos estudios murinos de endometriosis utilizan endometriosis inducida quirú...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Supplies for injecting PMSG into donor mouse
1 mL Tuberculin syringe with 27G needle	Fisher Scientific	14-826-87
Pregnant mare serum gonadotropin	Sigma-Aldrich	9002-70-4
Supplies for necropsy of donor mouse and tissue processing
6” serrated forceps, curved tip	Electron Microscopy Sciences	72993-6C
70% ethanol solution	Pharmco	33000HPLCCS4L	70% solution dilute ethyl acetate 200 proof
Analytical balance	Mettler Toledo	ME54TE
Carbon dioxide	TriGas Supplier
Dissecting tray	Fisher Scientific	S14000
No. 10 disposable scalpel	Fisher Scientific	NC9999403
Scissors, curved	Electron Microscopy Sciences	72941
Scissors, straight	Electron Microscopy Sciences	72940
Stereo microscope	Leica Microsystems	Leica SE 4	For tissue dissection
Sterile phosphate buffered saline (PBS)	Institutional core facility supplies
Surgical instrument sterilization tray	Electron Microscopy Sciences	66112-02
Tissue culture dishes	Fisher Scientific	08-772E
Weighing dishes	Fisher Scientific	02-202-103
Supplies for injecting into recipient mouse
1 cc syringe	BD Biosciences	301025
18 G needle	Fisher Scientific	148265d
200 uL pipette tip	Fisher Scientific	02-707-422
Double distilled water	Institutional core facility supplies
Latex bulb	Fisher Scientific	03-448-21
Micro cover glass slip	VWR	48366-067
Microscope slide	Fisher Scientific	12-544-7
Standard light microscope	Leica Microsystems	DM IL	For evaluating vaginal cytology smears
Supplies for harvesting tissue from recipient mouse
10% Buffered formalin	Fisher Scientific	SF100-4
Biopsy foam pads	Fisher Scientific	22-038-222
Precision Digital Calipers	Electron Microscopy Sciences	62065-40
Processing/embedding cassettes	Fisher Scientific	22-272416