Ein syngenes Murinmodell der Endometriose mit natürlich radfahrenden Mäusen

Zusammenfassung

Viele Nagetiermodelle der Endometriose sind durch technische Komplexität, Reproduzierbarkeit und/oder den Bedarf an immungeschwächten Tieren oder speziellen Reportermäusen begrenzt. Wir präsentieren ein vereinfachtes System der Läsionsinduktion mit jeder experimentellen Maus mit einem unabhängig überprüfbaren, objektiven Scoring-System und ohne Notwendigkeit für Ovariektomie oder Überlebensoperation.

Zusammenfassung

Endometriose ist eine der Hauptursachen für Beckenschmerzen und Unfruchtbarkeit. Es wird durch das Vorhandensein von Endometriumgewebe an extrauterinen Stellen definiert. Die Entwicklung neuartiger Therapien und diagnoseträchtischer Instrumente für Endometriose war zum Teil aufgrund von Herausforderungen bei der Untersuchung der Krankheit begrenzt. Außerhalb von Primaten menstruieren nur wenige Säugetiere, und keines entwickelt eine spontane Endometriose. Nagetiermodelle sind beliebt, erfordern jedoch eine künstliche Induktion der Endometriose, wobei viele entweder immungeschwächte Mäuse oder chirurgisch induzierte Erkrankungen verwenden. In jüngster Zeit wurde Modellen mit intraperitonealer Injektion mehr Aufmerksamkeit geschenkt. Wir präsentieren ein murines Modell der Endometriose, das mehrere Merkmale bestehender Endometriosemodelle in ein neuartiges, vereinfachtes System integriert, das auf mikroskopischer Quantifizierung anstelle einer subjektiven Einstufung beruht. In diesem Modell führen wir eine hormonelle Stimulation von Spendermäusen, eine intraperitoneale Injektion, eine systematische Bauchuntersuchung und Gewebeentnahme sowie eine histologische Quantifizierung durch, die jederzeit nach der Nekropsie durchgeführt und verifiziert werden kann. Dieses Modell erfordert nur minimale Ressourcen und Schulungen; erfordert keine Expertise von Labortechnikern in der Mausüberlebenschirurgie oder in der Identifizierung von groben endometriotischen Läsionen; kann bei immungeschwächten, immunkompetenten und/oder mutierten Mäusen angewendet werden; und erzeugt zuverlässig endometriotische Läsionen, die histologisch mit der menschlichen endometriotischen Erkrankung übereinstimmen.

Einleitung

Endometriose ist eine rätselhafte Erkrankung des weiblichen Fortpflanzungstraktes mit erheblichen finanziellen und gesundheitlichen Belastungen für Frauen^1,2. Die Ätiologie der Endometriose ist nicht vollständig verstanden, und es wurden mehrere Erklärungen vorgeschlagen, darunter coelomische Metaplasie, embryonale Müllersche Reste, Rekrutierung von Knochenmark-abgeleiteten Vorläuferzellen und retrograde Menstruation³. Während mehrere Aspekte dieser vorgeschlagenen Mechanismen beteiligt sein können und keine einzige Erklärung für alle Formen der Krankheit verantwortlich sein kann, ist das führende Modell der Endometriose-Pathogenese die retrograde Menstruation. Retrograde Menstruation ist die Passage von Menstruationsabfluss durch die Eileiter und in die Peritonealhöhle; Es wird geschätzt, dass 90% der menstruierenden Frauen regelmäßig einer retrograden Menstruation^{unterzogen werden 4,5}. Angesichts dieses alltäglichen Phänomens der retrograden Menstruation ist unklar, warum sich Endometriose nur bei einer Untergruppe von Frauen entwickelt⁵. Um die Ätiologie dieser Krankheit besser zu verstehen, sind direkte Studien am Menschen nicht durchführbar und Tierversuche sind gerechtfertigt.

Endometriose ist eine Herausforderung sowohl zu behandeln als auch zu untersuchen. Die Prävalenz der Krankheit ist nicht bekannt, wird aber auf 10% geschätzt¹. Während einige fortgeschrittene Arten von Endometriose durch nichtinvasive Bildgebung genau identifiziert werden können, wird eine endgültige Diagnose nur durch histopathologische Analyse von chirurgisch erhaltenen Biopsieproben erreicht; Läsionen, die visuell krank zu sein scheinen, können in der Tat Fibrose oder Narbenbildung aus anderen Ursachen sein⁶. Schwere und Ausmaß der Erkrankung korrelieren nicht mit der Symptomatik⁷.

Endometrioseläsionen bestehen aus heterogenen Zelltypen und Populationen, die auf komplexe Weise innerhalb der Mikroumgebung interagieren, was die Nützlichkeit zellulärer Modelle einschränkt^8,9. In-vivo-Modelle existieren, aber diese haben inhärente Herausforderungen und Einschränkungen^10,11,12. Primatenmodelle sind ideal, aber oft nicht realisierbar^13,14,15. Nur wenige Nicht-Primaten-Säugetiere menstruieren und entwickeln spontan Endometriose¹⁶. Nagetiermodelle der Endometriose existieren, aber jedes hat Einschränkungen¹⁷. Viele dieser Modelle erfordern eine Überlebensoperation, um Endometriumgewebe in die Spenderempfängerwand oder den Darm zu nähen oder zu implantieren, was die technische Komplexität, die Notwendigkeit einer Anästhesie und die Störfaktoren der Operation selbst erhöht^18,19,20. Darüber hinaus erfordern viele Modelle Ovariektomie und Östrogen-Supplementierung; Während die Läsionsausbeute erhöht wird, erhöht dies Zeit, Kosten und zusätzliche Überlebensoperationen. Intraperitoneale (IP) Injektionsmodelle erfordern keine Anästhesie oder Überlebensoperation, und diese Modelle simulieren logischerweise eine retrograde Menstruation besser als die Nähmodelle^21,22,23. Die meisten IP-Modelle unterliegen jedoch einer größeren Variabilität der Läsionsstelle aufgrund der zufälligen Verteilung von Endometriumfragmenten nach der Injektion und damit einer stärkeren Verzerrung bei der Identifizierung und Messung von Läsionen.

Hier präsentieren wir ein murines Modell der Endometriose, das mehrere Merkmale bestehender Endometriosemodelle in ein neuartiges, vereinfachtes und effizientes System integriert, das auf mikroskopischer Quantifizierung anstelle einer subjektiven Einstufung beruht.

Protokoll

HINWEIS: Die Verwendung von Tieren in dieser Studie wurde vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) am Cleveland Clinic Lerner Research Institute genehmigt. Alle öffentlich zugänglichen Tierpflege- und -verwendungsstandards wurden nach den Richtlinien der National Institutes of Health durchgeführt. Dieses Verfahren verwendet aseptische Techniken. Die Petrischale ist steril. Die verwendete PBS/Kochsalzlösung ist steril. Die chirurgischen Instrumente zur Nekropsie und Gewebedissektion werden per Autoklaven sterilisiert. Wir verwenden 70% EtOH auf den Instrumenten zwischen Tierfällen (wenn mehr als einer pro Sitzung), um die Kontamination zu verringern.

1. Vorbereitung von Spender- und Empfängermäusen (siehe Abbildung 1)

1. Stellen Sie sicher, dass eine entsprechende Genehmigung für die Arbeit mit Labortieren vorliegt.
2. Bestimmen Sie die Dehnung der Maus. In diesen Experimenten wurden Wildtyp- und mutanten Mäuse mit einem C57BL / 6J-Hintergrund verwendet, aber Forscher, die ähnliche Modelle verwenden, berichten über Erfolge mit anderen Mausstämmen wie BALB / c-Mäusen¹⁰. Darüber hinaus können Spender- und/oder Empfängermäuse Reportersysteme wie GFP- oder RFP-Mäuse verwenden (siehe Abbildung 2 und Abbildung 3).
3. Stellen Sie für den Zeitpunkt der Endometriumgewebetransplantation sicher, dass die Spendermäuse zum Zeitpunkt der Gonadotropin-Injektion zwischen 22 und 24 Tagen alt sind. Dies stellt sicher, dass sie reproduktiv naiv sind, z.B. noch nicht mit dem Östrusradfahren begonnen haben.
4. Stellen Sie sicher, dass die Empfängermäuse im Alter von 2 bis 4 Monaten reproduktiv intakt sind (keine vorherige Ovariektomie). Obwohl dies nicht erforderlich ist, wird empfohlen, uringetränkte Einstreu aus einem männlichen Mäusekäfig regelmäßig in den Käfig des Empfängers zu legen, um den laufenden Östriumzyklus zu erleichtern, und erneut um 72 h vor der Endometriumgewebetransplantation.
   HINWEIS: Dies gewährleistet keine Synchronisation des Östrogenzyklus der Empfänger, da die Platzierung uringetränkter Bettwäsche stark von der Menge der verwendeten männlichen Bettwäsche abhängt und variable Ergebnisse hat. Wenn eine Synchronisation des Östrogenzyklus gewünscht wird, bringen drei aufeinanderfolgende subkutane Injektionen von 100 ng/100 μL Östradiol alle Tiere in die Östrogenphase. Während wir keinen Unterschied in der Läsionsinduktion basierend auf der Phase des Östrogenzyklus gefunden haben, haben andere Gruppen die Zyklusphase als wichtig^{empfunden 10}.
5. Subkutane Injektion von Pregnant Mare Serum Gonadotropin (PMSG, 2 IE verdünnt auf 200 μL) in Spendermäuse subkutan mit einer feinen Nadel (25-27 Gempfohlen). Geben Sie PMSG nicht an Empfängermäuse, da es den Eisprung und die anschließende Umgebung mit hohem Progesteron auslöst, die weniger empfänglich für die Endometriosebildung ist.
   HINWEIS: Frühere Mausmodelle haben entweder PMSG oder Östrogen verwendet, um die Endometriumproliferation bei den Spendermäusen vor der Endometriumernte zu stimulieren²³. PMSG wird aus folgenden Gründen empfohlen: Die Halbwertszeit von PMSG beträgt 40 h, während die Halbwertszeit von 17-beta-Estradiol nur 2 h beträgt. Die Verwendung einer einzigen subkutanen Injektion von PMSG in die Spender 40 Stunden vor der Beschaffung von Endometriumgewebe bietet eine anhaltende Expositionsdauer bei gonadotropinstimulierender Stimulation, die endogenes Östrogen stimuliert. Viele Präparate von exogenem Östrogen erfordern mehrere Injektionen, um das Endometrium ausreichend zu grundierungen.
6. Planen Sie nach der PMSG-Injektion nekropsisch, beschaffung und transplantieren Sie den Empfänger zwischen 38-42 h. Zeit der Endometriumgewebeernte nach Gonadotropin-Injektion, um die Entnahme von Gewebe vor dem Eisprung sicherzustellen, der um 42 Stunden nach der Injektion auftritt. Der Eisprung erzeugt eine Umgebung mit hohem Progesteron (P4), die die Läsionsansiedlung reduzieren würde.

2. Beschaffung von Endometriumgewebe der Spendermaus

1. Nach der Euthanasie der Spendermaus (mit CO_2-Kammer, gefolgt von zervikaler Luxation), besprühen Sie den Bauch mit 70% ige Ethanollösung; dies dient dazu, die Kontamination des beschafften Gewebes aus der Hautflora und aus gelösten Haaren zu reduzieren. Machen Sie mit einer Sezierenschnappe eine flache Querschnipsel an der Mittellinie durch die Haut und das Unterhautgewebe. Greifen Sie dann jede Seite des Hautschnitts und verwenden Sie stumpfe Traktion, um den Bauch zu öffnen.
2. Identifizieren Sie die Gebärmutter. Bevor Sie die Gebärmutter entfernen, schneiden Sie angrenzendes Bindegewebe ab. Transektieren Sie jedes Uterushorn direkt unter dem jeweiligen Eileiter und transektieren Sie dann den Gebärmutterhals, um den gesamten Uterus en bloc zu entfernen.
3. Nach der Entfernung aus der Bauchhöhle die Gebärmutter sorgfältig untersuchen und zusätzliches peripheres Fett oder Bindegewebe entfernen. Legen Sie die Gebärmutter in einen Tropfen kaltes PBS auf einer Petrischale. Bestimmen und dokumentieren Sie die kombinierte Masse der gesamten Gebärmutter.
4. Transektieren Sie jedes Horn aus dem Uterusfundus und machen Sie die Transektion so nah wie möglich am Fundus, um die Länge jedes Horns zu maximieren. Legen Sie mit Hilfe eines Seziermikroskops eine Klinge der Sezierschere in das Lumen des ersten Horns und schneiden Sie dann entlang der Hauptachse des Rohrs. Öffnen Sie vorsichtig die Röhre und denken Sie daran, welche Seite die Serosa und welche Seite das Epithel ist.
5. 500 cc Kochsalzlösung oder PBS auf eine neue Petrischale geben; die Flüssigkeit bleibt aufgrund der Oberflächenspannung zusammen.
6. Führen Sie dann eine Fragmentierung der Gebärmutter auf gleichmäßige Weise durch. Es ist besser, weniger größere Läsionen zu haben als viele kleinere Läsionen. Beginnen Sie, indem Sie das Epithel vom Myometrium trennen, indem Sie die Endometriumschicht greifen und abziehen.
   1. Alternativ fragmentieren Sie einfach das Gewebe, ohne das Myometrium abzutrennen (solange die Epithelseite vollständig exponiert ist), aber die Beibehaltung des Myometriums verringert die physiologische Relevanz dieses Modells für menschliche Krankheiten. Stellen Sie sicher, dass die Fragmente so groß wie möglich sind, aber klein genug, um eine 18-G-Nadel zu passieren. (1 mm x 1 mm wird empfohlen).
   2. Sammeln Sie 10-12 dieser 1 mm x 1 mm Fragmente aus dem ersten Horn (was ungefähr 40 mg Gewebe bei den C57BL/ 6J-Mäusen entspricht). Legen Sie gesammelte Fragmente in die Flüssigkeitssammlung.
7. Führen Sie die gleichen Schritte für das andere Uterushorn für insgesamt etwa 24 Fragmente pro Maus durch. Dokumentieren Sie die Gesamtzahl der Fragmente.

3. Peritoneale Injektion von Gewebefragmenten in die Empfängermaus

1. Die aufgehängten 1 mm x 1 mm fragmentierten Fragmente mit dem stumpfen Ende einer 1-cm³-Spritze absaugen; das Gesamtvolumen sollte 1 ml sein.
2. Befestigen Sie eine 18 G Nadel an der Vollspritze und laden Sie die Flüssigkeit in die Nadel. Erwägen Sie eine simulierte Injektion zurück in die Petrischale, um sicherzustellen, dass das gesamte Gewebe durch die Nadel gelangt.
3. Nehmen Sie die Empfängermaus. Entweder vor oder nach der IP-Injektion erhalten Sie einen vaginalen Abstrich der Empfängermaus zur Dokumentation des Östrogenzyklus (10 μL Kochsalzlösung mit der Zwiebelspritze an der Vaginalöffnung und auf dem Glasträger mit dem Coverlip plattiert).
4. Führen Sie die intraperitoneale Injektion der Fragmente mit der Spritze in einem Winkel von 45 Grad durch und achten Sie darauf, nicht subkutan zu injizieren.
5. Wenn nach der Injektion Fragmente übrig bleiben, ziehen Sie zusätzliche 200 μL der Flüssigkeit zur Injektion in die Spritze, um sicherzustellen, dass alle Fragmente intraperitoneal erfolgreich injiziert werden.
6. Sobald sie sich ihrer Blutungen oder Komplikationen sicher sind, legen Sie die Empfängermäuse wieder in ihre Käfige und ernähren Sie sich normal.

4. Ernte endometriotischer Läsionen

1. Euthanasier-Empfängermäuse etwa 21 Tage nach der Fragmentinjektion nach der Transplantation.
   HINWEIS: Aus Erfahrung und aus Diskussionen mit Mitarbeitern, die ähnliche Modelle verwenden, treten die maximale Läsionsgröße und -anzahl etwa 3 Wochen nach der Transplantation auf; Nach 3 Wochen beginnen sich die Läsionen in der Größe zurückzubilden. Die von der IACUC zugelassene Methode der Euthanasie wird verwendet.
2. Nach Euthanasie und zervikaler Luxation den Bauch des Tieres mit 70% Ethanol besprühen und die Haut oberflächlich mit einer Schere schneiden. Schneiden Sie die Haut und den subkutanen Raum mit einer Schere ein, um den Bauch stumpf zu öffnen.
3. Bevor eine weitere Dissektion durchgeführt wird, wird eine vollständige Untersuchung der groben Läsionen durchgeführt, wobei die Größe mit Bremssätteln gemessen und ihre anatomische Region dokumentiert wird (siehe unten).
4. Führen Sie eine vollständige Sammlung von drei verschiedenen anatomischen Regionen en bloc durch (unabhängig davon, ob Läsionen grob geschätzt werden können oder nicht). Wenn Läsionen in anderen Regionen (z. B. Darm) beobachtet werden, sollten diese ignoriert und nicht gesammelt werden, es sei denn, die Läsion durchquert einen der drei folgenden Bereiche.
   1. A = Bauchdecke/Peritoneum (kann entweder zu einer Kassette abgeflacht oder aufgerollt werden, solange zwischen den Proben konsistent ist).
   2. B = Bauchspeicheldrüse und Mesenterikum.
   3. C = Parauterines Bindegewebe und Fett (weiß glitzerndes Gewebe, das die Gebärmutter umgibt, aber keine anderen Organe als die Blase betrifft; achten Sie darauf, die Blase nicht mit einer Läsion zu verwechseln).
5. Legen Sie jeden sezierten Bereich in eine Kassette, die entsprechend beschriftet ist, und legen Sie ihn in Formalin und Prozess gemäß Laborprotokoll für histologische Schnitte.
6. Schnittformalinblöcke in zwei Objektträgern (D1 und D2) pro Gewebebereich in zwei gleichmäßigen Tiefen.

5. Bewertung endometriotischer Läsionen

1. Scannen (bei 40-facher Vergrößerung) und Archivieren von Dias.
2. Verwenden Sie eine digitale Dialesesoftware, definieren Sie den längsten Abstand (X) zwischen den Kanten einer endometriotischen Läsion - unabhängig davon, ob der Rand aus Drüsen oder Stroma besteht - und markieren Sie ihn. Eine kontinuierliche Läsion wird durch Drüsen definiert, die von Stroma umgeben sind; die Linie durchquert nicht notwendigerweise nur endometriotisches Gewebe (wie bei der Bestimmung von Endpunkten an einem unregelmäßig geformten oder wellenförmigen Fokus der Endometriose), sondern die beiden Endpunkte müssen durch kontinuierliches Stroma und/oder Drüsen verbunden sein (siehe Abbildung 4).
3. Machen Sie eine zweite Zeile (Y) 90 Grad über die erste Zeile, wobei die Länge der zweiten Zeile nach den oben genannten Regeln bestimmt wird.
4. Wenn mehrere nicht zusammenhängende Läsionen auftreten, geben Sie jeweils ihre eigenen X- und Y-Messungen an.
5. Berechnen Sie die endgültige Punktzahl für jede Folie als Summierung der Bereiche (X * Y) jeder Läsion.
6. Nehmen Sie die größere Punktzahl aus den beiden Folien (D1 vs D2) als Endergebnis für diese Region (A, B, C).
7. Summieren Sie die Punktzahlen aus jeder Region, um die endgültige mikroskopische Punktzahl für dieses Tier zu erhalten.

Ergebnisse

Für ein erstes Proof-of-Concept-Experiment wurde Spenderendometrium von RFP-Mäusen in Wildtyp-Empfängermäuse injiziert. H & E-Färbung zeigte histopathologische Bestätigung der klassischen Architektur der Endometrioseläsion (Abbildung 3A). Die Fluoreszenzmikroskopie bestätigte, dass die beobachtete Läsion vom Spender stammte (Abbildung 3B).

Das zweite Experiment wurde mit 10 Wildtyp C57BL/6J-Spendern und 10 Empfängern durchge...

Diskussion

Unsere Studie zeigt, dass Endometriose bei Mäusen zuverlässig induziert werden kann, ohne dass eine Ovariektomie und / oder überlebenschirurgisch erforderlich ist, und dass ektopische Endometriumläsionen mithilfe einer standardisierten Untersuchung des Abdomens und einer histologischen Analyse identifiziert und quantifiziert werden können.

Viele murine Studien zur Endometriose verwenden chirurgi...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Supplies for injecting PMSG into donor mouse
1 mL Tuberculin syringe with 27G needle	Fisher Scientific	14-826-87
Pregnant mare serum gonadotropin	Sigma-Aldrich	9002-70-4
Supplies for necropsy of donor mouse and tissue processing
6” serrated forceps, curved tip	Electron Microscopy Sciences	72993-6C
70% ethanol solution	Pharmco	33000HPLCCS4L	70% solution dilute ethyl acetate 200 proof
Analytical balance	Mettler Toledo	ME54TE
Carbon dioxide	TriGas Supplier
Dissecting tray	Fisher Scientific	S14000
No. 10 disposable scalpel	Fisher Scientific	NC9999403
Scissors, curved	Electron Microscopy Sciences	72941
Scissors, straight	Electron Microscopy Sciences	72940
Stereo microscope	Leica Microsystems	Leica SE 4	For tissue dissection
Sterile phosphate buffered saline (PBS)	Institutional core facility supplies
Surgical instrument sterilization tray	Electron Microscopy Sciences	66112-02
Tissue culture dishes	Fisher Scientific	08-772E
Weighing dishes	Fisher Scientific	02-202-103
Supplies for injecting into recipient mouse
1 cc syringe	BD Biosciences	301025
18 G needle	Fisher Scientific	148265d
200 uL pipette tip	Fisher Scientific	02-707-422
Double distilled water	Institutional core facility supplies
Latex bulb	Fisher Scientific	03-448-21
Micro cover glass slip	VWR	48366-067
Microscope slide	Fisher Scientific	12-544-7
Standard light microscope	Leica Microsystems	DM IL	For evaluating vaginal cytology smears
Supplies for harvesting tissue from recipient mouse
10% Buffered formalin	Fisher Scientific	SF100-4
Biopsy foam pads	Fisher Scientific	22-038-222
Precision Digital Calipers	Electron Microscopy Sciences	62065-40
Processing/embedding cassettes	Fisher Scientific	22-272416