Un modèle murin syngénique de l’endométriose utilisant des souris à cycle naturel

Résumé

De nombreux modèles de rongeurs de l’endométriose sont limités par la complexité technique, la reproductibilité et/ou le besoin d’animaux immunodéprimés ou de souris rapporteures spéciales. Nous présentons un système simplifié d’induction des lésions en utilisant n’importe quelle souris expérimentale avec un système de notation objectif vérifiable indépendamment et sans exigence d’ovariectomie ou de chirurgie de survie.

Résumé

L’endométriose est l’une des principales causes de douleur pelvienne et d’infertilité. Il est défini par la présence de tissu endométrial dans les endroits extra-utérins. Le développement de nouvelles thérapies et de nouveaux outils de diagnostic de l’endométriose a été limité en partie en raison des difficultés d’étude de la maladie. En dehors des primates, peu de mammifères ont leurs règles et aucun ne développe une endométriose spontanée. Les modèles de rongeurs sont populaires, mais nécessitent une induction artificielle de l’endométriose, beaucoup utilisant soit des souris immunodéprimées, soit des maladies induites chirurgicalement. Récemment, une plus grande attention a été accordée aux modèles impliquant l’injection intrapéritonéale. Nous présentons un modèle murin de l’endométriose qui intègre plusieurs caractéristiques des modèles d’endométriose existants dans un nouveau système simplifié qui repose sur une quantification microscopique au lieu d’un classement subjectif. Dans ce modèle, nous effectuons une stimulation hormonale de souris donneuses, une injection intrapéritonéale, une enquête abdominale systématique et une récolte de tissus, ainsi qu’une quantification histologique qui peut être effectuée et vérifiée à tout moment après l’autopsie. Ce modèle nécessite un minimum de ressources et de formation; ne nécessite pas d’expertise de la part de techniciens de laboratoire en chirurgie de survie murine ou dans l’identification des lésions endométriotiques grossières; peut être utilisé chez des souris immunodéprimées, immunocompétentes et/ou mutantes; et crée de manière fiable des lésions endométriotiques qui sont histologiquement compatibles avec la maladie endométriotique humaine.

Introduction

L’endométriose est une maladie énigmatique de l’appareil reproducteur féminin avec des charges financières et sanitaires importantes pour les femmes^1,2. L’étiologie de l’endométriose n’est pas complètement comprise, et de multiples explications ont été proposées, notamment la métaplasie coélomique, les repos müllériens embryonnaires, le recrutement de cellules progénitrices dérivées de la moelle osseuse et les menstruations rétrogrades³. Bien que de multiples aspects de ces mécanismes proposés puissent être impliqués, et qu’aucune explication unique ne puisse expliquer toutes les formes de la maladie, le modèle principal de la pathogenèse de l’endométriose est la menstruation rétrograde. La menstruation rétrograde est le passage des effluents menstruels à travers les trompes de Fallope et dans la cavité péritonéale; on estime que 90% des femmes menstruées subissent régulièrement des menstruations rétrogrades^4,5. Compte tenu de ce phénomène banal de menstruation rétrograde, la raison pour laquelle l’endométriose ne se développe que chez un sous-ensemble de femmes n’est pas claire⁵. Pour mieux comprendre l’étiologie de cette maladie, des études directes sur l’homme ne sont pas réalisables et des études sur les animaux sont justifiées.

L’endométriose est un défi à traiter et à étudier. La prévalence de la maladie n’est pas connue mais estimée à 10%¹. Bien que certains types avancés d’endométriose puissent être identifiés avec précision par imagerie non invasive, un diagnostic définitif n’est obtenu que par l’analyse histopathologique d’échantillons de biopsie obtenus chirurgicalement; les lésions qui semblent visuellement être malades, peuvent en fait être une fibrose ou des cicatrices d’autres causes⁶. La gravité et l’étendue de la maladie ne sont pas corrélées avec la symptomatologie⁷.

Les lésions d’endométriose sont constituées de types et de populations cellulaires hétérogènes qui interagissent de manière complexe dans le microenvironnement, limitant ainsi l’utilité des modèles cellulaires^8,9. Des modèles in vivo existent, mais ceux-ci ont des défis et des limites inhérents^10,11,12. Les modèles de primates sont idéaux mais ne sont souvent pas^{réalisables13},^14,15. Peu de mammifères non primates ont leurs règles et développent spontanément l’endométriose¹⁶. Des modèles rongeurs d’endométriose existent mais chacun a des limites¹⁷. Beaucoup de ces modèles nécessitent une chirurgie de survie pour suturer ou implanter du tissu endométrial dans la paroi ou l’intestin du receveur du donneur, ce qui ajoute de la complexité technique, un besoin d’anesthésie et des facteurs immunitaires confondants de la chirurgie elle-même^18,19,20. En outre, de nombreux modèles nécessitent une ovariectomie et une supplémentation en œstrogènes; tout en augmentant le rendement des lésions, cela ajoute du temps, des dépenses et une chirurgie de survie supplémentaire. Les modèles d’injection intrapéritonéale (IP) ne nécessitent pas d’anesthésie ou de chirurgie de survie, et ces modèles simulent logiquement mieux les menstruations rétrogrades que les modèles de suture^21,22,23. La plupart des modèles IP, cependant, sont soumis à une plus grande variabilité dans l’emplacement des lésions en raison de la dispersion aléatoire des fragments de l’endomètre après l’injection et donc à plus de biais dans l’identification et la mesure des lésions.

Nous présentons ici un modèle murin de l’endométriose qui intègre plusieurs caractéristiques des modèles d’endométriose existants dans un système nouveau, simplifié et efficace qui repose sur une quantification microscopique au lieu d’un classement subjectif.

Protocole

REMARQUE: L’utilisation d’animaux dans cette étude a été approuvée par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) du Cleveland Clinic Lerner Research Institute. Toutes les normes de soins et d’utilisation des animaux accessibles au public ont été effectuées conformément aux directives des National Institutes of Health. Cette procédure utilise des techniques aseptiques. La boîte de Petri est stérile. Le PBS/solution saline utilisé est stérile. Les instruments chirurgicaux pour la nécropsie et la dissection tissulaire sont stérilisés par autoclave. Nous utilisons 70% d’EtOH sur les instruments entre les cas d’animaux (si plus d’un par session) pour réduire la contamination.

1. Préparation des souris donneuses et receveuses (voir Figure 1)

1. S’assurer qu’une approbation appropriée est en place pour travailler avec les animaux de laboratoire.
2. Déterminez la souche de la souris. Dans ces expériences, des souris sauvages et mutantes ayant un fond C57BL / 6J ont été utilisées, mais les chercheurs utilisant des modèles similaires rapportent des succès avec d’autres souches de souris telles que les souris BALB / c¹⁰. En outre, les souris donneuses et/ou receveuses peuvent utiliser des systèmes rapporteurs, tels que les souris GFP ou RFP (voir Figure 2 et Figure 3).
3. Pour le moment de la greffe de tissu endométrial, assurez-vous que les souris donneuses ont entre 22 et 24 jours au moment de l’injection de gonadotrophine. Cela garantit qu’ils sont naïfs sur le plan de la reproduction, par exemple, qu’ils n’ont pas encore commencé le cycle œstrous.
4. Assurez-vous que les souris receveuses sont intactes sur le plan de la reproduction (pas d’ovariectomie préalable) entre l’âge de 2 et 4 mois. Bien que cela ne soit pas nécessaire, il est recommandé de placer périodiquement dans la cage d’une souris mâle la litière imbibée d’urine dans la cage du receveur pour faciliter le cycle œstro-sérique continu et à nouveau à 72 h avant la greffe de tissu endométrial.
   REMARQUE: Cela n’assurera pas la synchronisation du cycle œstre des receveurs, car la litière imbibée d’urine dépend fortement de la quantité de litière masculine utilisée et a des résultats variables. Si la synchronisation du cycle œstrueux est souhaitée, trois injections sous-cutanées consécutives de 100 ng/100 μL d’œstradiol amèneront tous les animaux à la phase œstrueuse. Bien que nous n’ayons trouvé aucune différence dans l’induction des lésions en fonction de la phase du cycle œstrous, d’autres groupes ont trouvé que la phase du cycle était importante¹⁰.
5. Injecter par voie sous-cutanée la gonadotrophine sérique de jument enceinte (PMSG, 2 UI diluée en 200 μL) à des souris donneuses par voie sous-cutanée à l’aide d’une aiguille fine (25-27 Grecommandé). Ne donnez pas de PMSG aux souris receveuses, car cela déclenchera l’ovulation et un environnement de progestérone élevé, qui est moins réceptif à la formation d’endométriose.
   REMARQUE: Des modèles murins antérieurs ont utilisé pmSG ou œstrogène pour stimuler la prolifération de l’endomètre chez les souris donneuses avant la récolte de l’endomètre²³. Le PMSG est recommandé pour les raisons suivantes : La demi-vie du PMSG est de 40 h alors que la demi-vie du 17-bêta-estradiol n’est que de 2 h. L’utilisation d’une seule injection sous-cutanée de PMSG chez les donneurs 40 h avant l’obtention du tissu endométrial fournit une durée prolongée d’exposition à la stimulation des gonadotrophines, qui agit pour stimuler l’œstrogène endogène. De nombreuses préparations d’œstrogène exogène nécessitent plusieurs injections pour amorcer adéquatement l’endomètre.
6. Après l’injection de PMSG, planifier la nécropsie, l’obtention et la transplantation dans le receveur entre 38 et 42 h. Chronométre la récolte du tissu endométrial après l’injection de gonadotrophine pour assurer la collecte du tissu avant l’ovulation, qui se produit 42 h après l’injection. L’ovulation produit un environnement à haute progestérone (P4), ce qui réduirait l’établissement de la lésion.

2. Obtention de tissu endométrial de souris donneuse

1. Après l’euthanasie de la souris donneuse (en utilisant la chambre_co-2 suivie d’une luxation cervicale), vaporiser l’abdomen avec une solution d’éthanol à 70%; cela sert à réduire la contamination des tissus obtenus par la flore cutanée et les poils délogés. Avec des ciseaux disséquants, faites une coupure transversale peu profonde à mi-ligne à travers la peau et le tissu sous-cutané. Ensuite, en saisissant chaque côté de l’incision cutanée, utilisez une traction émoussée pour ouvrir l’abdomen.
2. Identifiez l’utérus. Avant d’enlever l’utérus, coupez le tissu conjonctif adjacent. Transectez chaque corne utérine juste en dessous de leur trompe de Fallope respective, puis transectez le col de l’utérus pour enlever tout l’utérus en bloc.
3. Après le retrait de la cavité abdominale, inspectez soigneusement l’utérus et retirez toute graisse périphérique ou tissu conjonctif supplémentaire. Placez l’utérus dans une gouttelette de PBS froid sur une boîte de Pétri. Déterminez et documentez la masse combinée de l’utérus entier.
4. Transectez chaque corne du fond d’utérus, en rendant la transsection aussi proche que possible du fond d’fonds afin de maximiser la longueur de chaque corne. À l’aide d’un microscope à dissection, placez une lame des ciseaux disséquants à l’intérieur de la lumière de la première corne, puis coupez le long de l’axe principal du tube. Ouvrez soigneusement le tube, en gardant à l’esprit de quel côté se trouve la séreuse et de quel côté se trouve l’épithélium.
5. Mettez 500 cc de solution saline ou pbs sur une nouvelle boîte de Pétri; le liquide restera ensemble en raison de la tension superficielle.
6. Ensuite, effectuez la fragmentation de l’utérus de manière uniforme. Il est préférable d’avoir moins de lésions plus grosses que de nombreuses lésions plus petites. Commencez par séparer l’épithélium du myomètre en saisissant la couche de l’endomètre et en la décollant.
   1. Alternativement, il suffit de fragmenter le tissu sans séparer le myomètre (tant que la face épithéliale est complètement exposée), mais la rétention du myomètre diminue la pertinence physiologique de ce modèle pour la maladie humaine. S’assurer que les fragments sont aussi grands que possible, mais assez petits pour passer à travers une aiguille de 18 G; (1 mm x 1 mm est recommandé).
   2. Prélever 10 à 12 de ces fragments de 1 mm x 1 mm de la première corne (ce qui correspond à peu près à 40 mg de tissu chez les souris C57BL/6J). Placez les fragments collectés dans la collection de liquide.
7. Effectuez les mêmes étapes pour l’autre corne utérine pour un total d’environ 24 fragments par souris. Documentez le nombre total de fragments.

3. Injection péritonéale de fragments de tissu dans la souris receveuse

1. Aspirer les fragments suspendus de 1 mm x 1 mm à l’aide de l’extrémité émoussée d’une seringue de 1 cc; le volume total doit être de 1 mL.
2. Fixez une aiguille de 18 G à la seringue pleine et chargez le liquide dans l’aiguille. Envisagez une fausse injection dans la boîte de Pétri pour vous assurer que tout le tissu passera à travers l’aiguille.
3. Prenez la souris du destinataire. Avant ou après l’injection IP, obtenir un frottis vaginal de la souris receveuse pour la documentation du cycle œstré (10 μL de solution saline à l’aide de la seringue à bulbe à l’orifice vaginal et plaqué sur la lame de verre avec le couvercle).
4. Effectuer l’injection intrapéritonéale des fragments avec la seringue à un angle de 45 degrés, en prenant soin de ne pas injecter par voie sous-cutanée.
5. S’il reste des fragments après l’injection, prélever 200 μL supplémentaires de liquide dans la seringue pour injection afin de s’assurer que tous les fragments sont injectés avec succès par voie intrapéritonéale.
6. Une fois assurés qu’il n’y a pas de saignement ou de complications, replacez les souris receveuses dans leurs cages et nourrissez-les avec un régime alimentaire normal.

4. Récolte des lésions endométriotiques

1. Euthanasier les souris receveuses environ 21 jours après l’injection de fragments après la greffe.
   REMARQUE : D’après l’expérience et les discussions avec des collaborateurs utilisant des modèles similaires, la taille et le nombre maximaux de lésions se produisent environ 3 semaines après la greffe; après 3 semaines, les lésions commencent à régresser en taille. La méthode d’euthanasie approuvée par l’IACUC est utilisée.
2. Après l’euthanasie et la luxation cervicale, vaporisez l’abdomen de l’animal avec de l’éthanol à 70% et tentez la peau pour couper superficiellement avec des ciseaux disséquants. Inciser la peau et l’espace sous-cutané avec des ciseaux pour ouvrir brutalement l’abdomen.
3. Avant toute autre dissection, une enquête complète sur les lésions grossières est effectuée, avec une taille mesurée par des étriers et documentée quant à leur région anatomique (voir ci-dessous).
4. Effectuer une collecte complète de trois régions anatomiques distinctes en bloc (que les lésions puissent ou non être appréciées de manière grossière). Si des lésions sont observées dans d’autres régions (p. ex., les intestins), celles-ci doivent être ignorées et non recueillies à moins que la lésion ne traverse l’une des trois zones ci-dessous.
   1. A = paroi abdominale/péritoine (peut être aplati dans une cassette ou enroulé, à condition qu’il soit cohérent entre les échantillons).
   2. B = pancréas et graisse mésentérique.
   3. C = tissu conjonctif parutéine et graisse (tissu blanc scintillant qui entoure l’utérus mais n’implique aucun organe autre que la vessie; prenez soin de ne pas confondre la vessie avec une lésion).
5. Placez chaque zone disséquée dans une cassette, étiquetée de manière appropriée, et placez-la dans le for formel et le processus conformément au protocole de laboratoire pour la section histologique.
6. Blocs de forme de section en deux lames (D1 et D2) par zone tissulaire à deux profondeurs uniformes.

5. Notation des lésions endométriotiques

1. Numérisez (avec un grossissement de 40x) et archivez les diapositives.
2. Utilisez un logiciel de lecture numérique de diapositives, définissez la plus longue distance (X) entre les bords d’une lésion endométriotique - que le bord soit constitué de glandes ou de stroma - et marquez-le. Une lésion continue est définie par des glandes entourées de stroma; la ligne ne traverse pas nécessairement uniquement le tissu endométriosique (comme dans le cas de la détermination des paramètres sur un foyer d’endométriose de forme irrégulière ou ondulante), mais les deux points d’extrémité doivent être reliés par un stroma et/ou des glandes continus (voir la figure 4).
3. Faites une deuxième ligne (Y) de 90 degrés sur la première ligne, la longueur de la deuxième ligne 2 2 3 fois 2 33 30 degrés ainsi.
4. Si plusieurs lésions non contiguës sont rencontrées, donnez à chacune ses propres mesures X et Y.
5. Calculez le score final pour chaque diapositive comme la somme des zones (X * Y) de chaque lésion.
6. Prenez le plus grand des scores des deux diapositives (D1 vs D2) comme score final pour cette région (A, B, C).
7. Totalisez les scores de chaque région pour donner le score microscopique final pour cet animal.

Résultats

Pour une première expérience de preuve de concept, l’endomètre donneur de souris RFP a été injecté à des souris receveuses de type sauvage. La coloration H&E a révélé une confirmation histopathologique de l’architecture classique de la lésion de l’endométriose(Figure 3A). La microscopie fluorescente a confirmé que la lésion observée en question provenait du donneur(Figure 3B).

La deuxième expérience a été réa...

Discussion

Notre étude démontre que l’endométriose peut être induite de manière fiable chez la souris sans nécessiter l’utilisation d’une ovariectomie et / ou d’une chirurgie de survie, et que les lésions de l’endomètre extra-utérine peuvent être identifiées et quantifiées à l’aide d’une enquête standardisée de l’abdomen et d’une analyse histologique.

De nombreuses études murin...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Supplies for injecting PMSG into donor mouse
1 mL Tuberculin syringe with 27G needle	Fisher Scientific	14-826-87
Pregnant mare serum gonadotropin	Sigma-Aldrich	9002-70-4
Supplies for necropsy of donor mouse and tissue processing
6” serrated forceps, curved tip	Electron Microscopy Sciences	72993-6C
70% ethanol solution	Pharmco	33000HPLCCS4L	70% solution dilute ethyl acetate 200 proof
Analytical balance	Mettler Toledo	ME54TE
Carbon dioxide	TriGas Supplier
Dissecting tray	Fisher Scientific	S14000
No. 10 disposable scalpel	Fisher Scientific	NC9999403
Scissors, curved	Electron Microscopy Sciences	72941
Scissors, straight	Electron Microscopy Sciences	72940
Stereo microscope	Leica Microsystems	Leica SE 4	For tissue dissection
Sterile phosphate buffered saline (PBS)	Institutional core facility supplies
Surgical instrument sterilization tray	Electron Microscopy Sciences	66112-02
Tissue culture dishes	Fisher Scientific	08-772E
Weighing dishes	Fisher Scientific	02-202-103
Supplies for injecting into recipient mouse
1 cc syringe	BD Biosciences	301025
18 G needle	Fisher Scientific	148265d
200 uL pipette tip	Fisher Scientific	02-707-422
Double distilled water	Institutional core facility supplies
Latex bulb	Fisher Scientific	03-448-21
Micro cover glass slip	VWR	48366-067
Microscope slide	Fisher Scientific	12-544-7
Standard light microscope	Leica Microsystems	DM IL	For evaluating vaginal cytology smears
Supplies for harvesting tissue from recipient mouse
10% Buffered formalin	Fisher Scientific	SF100-4
Biopsy foam pads	Fisher Scientific	22-038-222
Precision Digital Calipers	Electron Microscopy Sciences	62065-40
Processing/embedding cassettes	Fisher Scientific	22-272416