Um modelo de murina síndico de endometriose usando ratos naturalmente ciclistas

Resumo

Muitos modelos de roedores de endometriose são limitados pela complexidade técnica, reprodutibilidade e/ou necessidade de animais imunocomprometidos ou ratos repórteres especiais. Apresentamos um sistema simplificado de indução de lesão utilizando qualquer camundongo experimental com um sistema de pontuação objetiva e independentemente verificável e sem necessidade de cirurgia de ovariectomia ou sobrevivência.

Resumo

A endometriose é uma das principais causas de dor pélvica e infertilidade. É definido pela presença de tecido endometrial em locais extrauterinos. O desenvolvimento de novas terapias e ferramentas de diagnóstico para endometriose tem sido limitado devido, em parte, aos desafios no estudo da doença. Fora dos primatas, poucos mamíferos menstruam, e nenhum desenvolve endometriose espontânea. Modelos de roedores são populares, mas requerem indução artificial da endometriose, com muitos utilizando camundongos imunocomprometidos ou doenças induzidas cirurgicamente. Recentemente, mais atenção tem sido dada aos modelos que envolvem injeção intraperitoneal. Apresentamos um modelo murino de endometriose que integra várias características dos modelos de endometriose existentes em um novo sistema simplificado que se baseia na quantificação microscópica em vez de classificação subjetiva. Neste modelo, realizamos estimulação hormonal de camundongos doadores, injeção intraperitoneal, levantamento abdominal sistemático e colheita de tecidos, e quantificação histológica que pode ser realizada e verificada a qualquer momento após a necropsia. Este modelo requer recursos mínimos e treinamento; não requer perícia por técnicos de laboratório em cirurgia de sobrevivência de murinas ou na identificação de lesões endometriotes brutas; pode ser usado em camundongos imunocomprometidos, imunocompetente e/ou mutantes; e cria lesões endometriotes que são histologicamente consistentes com a doença endometriotica humana.

Introdução

A endometriose é uma doença enigmática do trato reprodutivo feminino com cargas financeiras e de saúde significativas sobre as mulheres^1,2. A etiologia da endometriose não é completamente compreendida, e várias explicações foram propostas, incluindo metaplasia coelomicica, repouso mülleriano embrionário, recrutamento de células progenitoras derivadas da medula óssea e menstruação retrógrada³. Embora vários aspectos desses mecanismos propostos possam estar envolvidos, e nenhuma explicação única possa explicar todas as formas da doença, o modelo principal de patogênese endometriose é a menstruação retrógrada. Menstruação retrógrada é a passagem do efluente menstrual através dos tubos de falópio e para a cavidade peritoneal; estima-se que 90% das mulheres menstruadas passam regularmente por menstruação retrógrada^4,5. Dado esse fenômeno comum da menstruação retrógrada, por que a endometriose se desenvolve apenas em um subconjunto de mulheres não está claro⁵. Para entender melhor a etiologia dessa doença, estudos humanos diretos não são viáveis e estudos em animais são justificados.

A endometriose é um desafio tanto para tratar quanto para estudar. A prevalência da doença não é conhecida, mas estimada em 10%¹. Embora alguns tipos avançados de endometriose possam ser identificados com precisão por meio de imagens não invasivas, um diagnóstico definitivo só é obtido através da análise histopatológica de amostras de biópsia obtidas cirurgicamente; lesões que visualmente parecem estar doentes, podem de fato ser fibrose ou cicatrizes de outras causas⁶. A gravidade e a extensão da doença não se correlacionam com a sintomatologia⁷.

As lesões de endometriose consistem em tipos de células heterogêneas e populações que interagem de forma complexa dentro do microambiente, limitando, portanto, a utilidade dos modelos celulares^8,9. Existem modelos in vivo, mas estes têm desafios e limitações inerentes^10,11,12. Modelos de primatas são ideais, mas muitas vezes não são viáveis^13,14,15. Poucos mamíferos não primatas menstruam e desenvolvem endometriose espontaneamente¹⁶. Existem modelos de endometriose de roedores, mas cada um tem limitações¹⁷. Muitos desses modelos requerem cirurgia de sobrevivência para suturar ou implantar tecido endometrial na parede ou intestino receptor do doador, adicionando complexidade técnica, necessidade de anestesia e confundindo fatores imunológicos da própria cirurgia^18,19,20. Além disso, muitos modelos requerem ovaectomia e suplementação de estrogênio; ao mesmo tempo em que aumenta o rendimento da lesão, isso adiciona tempo, despesas e cirurgia de sobrevivência adicional. Modelos de injeção intraperitoneal (IP) não requerem anestesia ou cirurgia de sobrevivência, e esses modelos logicamente simulam a menstruação retrógrada melhor do que os modelos de sutura^21,22,23. A maioria dos modelos de IP, no entanto, estão sujeitos a maior variabilidade no local da lesão devido à dispersão aleatória de fragmentos endometrial após a injeção e, portanto, a mais viés na identificação e medição da lesão.

Aqui apresentamos um modelo murino de endometriose que integra várias características dos modelos de endometriose existentes em um sistema novo, simplificado e eficiente que se baseia na quantificação microscópica em vez de classificação subjetiva.

Protocolo

NOTA: O uso de animais neste estudo foi aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) do Cleveland Clinic Lerner Research Institute. Todas as normas de cuidados e uso de animais disponíveis publicamente foram realizadas seguindo orientações dos Institutos Nacionais de Saúde. Este procedimento está utilizando técnicas assépticas. A placa de Petri é estéril. O PBS/soro fisiológico utilizado é estéril. Os instrumentos cirúrgicos para necropsia e dissecção tecidual são esterilizados via autoclave. Utilizamos 70% de EtOH nos instrumentos entre os casos de animais (se mais de um por sessão) para diminuir a contaminação.

1. Preparação de camundongos doadores e receptores (ver Figura 1)

1. Certifique-se de que a aprovação apropriada está em vigor para trabalhar com animais de laboratório.
2. Determine a tensão do rato. Nesses experimentos, foram utilizados camundongos selvagens e mutantes com fundo C57BL/6J, mas pesquisadores usando modelos semelhantes relatam sucesso com outras cepas de camundongos, como os ratos BALB/c¹⁰. Além disso, ratos doadores e/ou receptores podem utilizar sistemas de repórteres, como ratos GFP ou RFP (ver Figura 2 e Figura 3).
3. Para o tempo do transplante de tecido endometrial, certifique-se de que os camundongos doadores têm entre 22 e 24 dias de idade no momento da injeção de gonadotropina. Isso garante que eles sejam reprodutivamente ingênuos, por exemplo, ainda não começaram a pedalar.
4. Certifique-se de que os camundongos receptores estão reprodutivamente intactos (sem ovaectomia prévia) entre 2 e 4 meses de idade. Embora não seja necessário, recomenda-se colocar a roupa de cama encharcada de urina de uma gaiola de ratos machos periodicamente na gaiola do receptor para facilitar o ciclismo estrous contínuo e novamente às 72 horas antes do transplante de tecido endometrial.
   NOTA: Isso não garantirá a sincronização do ciclo estrous dos receptores, uma vez que a cama encharcada de urina de colocação é altamente dependente da quantidade de roupa de cama masculina utilizada e tem resultados variáveis. Se a sincronização do ciclo estrous for desejada, três injeções subcutâneas consecutivas de 100 ng/100 μL estradiol levarão todos os animais à fase estrous. Embora não tenhamos encontrado diferença na indução de lesões com base na fase do ciclo estrous, outros grupos descobriram que a fase do ciclo é importante¹⁰.
5. Injete subcutâneamente a Gonadotropina de Soro de Mare Grávida (PMSG, 2 UI diluída em 200 μL) em camundongos doadores subcutâneamente usando uma agulha fina (25-27 G recomendado). Não dê PMSG para camundongos receptores, pois desencadeará a ovulação e o subsequente ambiente de alta progesterona, que é menos receptivo à formação de endometriose.
   NOTA: Modelos anteriores de camundongos utilizaram PMSG ou estrogênio para estimular a proliferação endometrial nos camundongos doadores antes da colheita endometrial²³. O PMSG é recomendado pelas seguintes razões: A meia-vida do PMSG é de 40 h, enquanto a meia-vida de 17-beta-estradiol é de apenas 2 h. A utilização de uma única injeção subcutânea de PMSG nos doadores 40 h antes da aquisição de tecido endometrial proporciona uma duração sustentada de exposição à estimulação da gonadotropina, que atua para estimular o estrogênio endógeno. Muitas preparações de estrogênio exógeno requerem múltiplas injeções para preparar adequadamente o endométrio.
6. Após a injeção do PMSG, agende necropsia, aquisição e transplante no receptor entre 38-42 h. Cronometre a colheita do tecido endometrial após a injeção de gonadotropina para garantir a coleta de tecido antes da ovulação, que ocorre a 42h após a injeção. A ovulação produz um ambiente de alta progesterona (P4), o que reduziria o estabelecimento da lesão.

2. Aquisição de tecido endometrial do rato doador

1. Após a eutanásia do rato doador (utilizando câmara de CO₂ seguida de luxação cervical), pulverize o abdômen com solução de 70% de etanol; isso serve para reduzir a contaminação do tecido adquirido da flora da pele e dos cabelos desalojados. Com a tesoura dissecando, faça um corte transversal raso na linha média através da pele e tecido subcutâneo. Em seguida, agarrando cada lado da incisão da pele, use tração contundente para abrir o abdômen.
2. Identifique o útero. Antes de remover o útero, corte o tecido conjuntivo adjacente. Transect cada chifre uterino logo abaixo de seu respectivo tubo falópio e, em seguida, transectar o colo do útero para remover todo o útero em bloco.
3. Após a remoção da cavidade abdominal, inspecione o útero cuidadosamente e remova qualquer gordura periférica adicional ou tecido conjuntivo. Coloque o útero em uma gota de PBS frio em uma placa de Petri. Determine e documente a massa combinada de todo o útero.
4. Transecte cada chifre do fundo do útero, tornando a transeção o mais próxima possível do fundus para maximizar o comprimento de cada chifre. Usando o auxílio de um microscópio dissecando, coloque uma lâmina da tesoura dissecando dentro do lúmen do primeiro chifre, depois corte ao longo do eixo principal do tubo. Abra cuidadosamente o tubo, tendo em mente qual lado é o serosa e qual lado é o epitélio.
5. Coloque 500 cc de soro fisiológico ou PBS em uma nova placa de Petri; o líquido permanecerá junto devido à tensão superficial.
6. Em seguida, realize a fragmentação do útero de forma uniforme. É melhor ter menos lesões maiores do que muitas lesões menores. Comece separando o epitélio do miométrio, agarrando a camada endometrial e descascando-a.
   1. Alternativamente, simplesmente fragmentar o tecido sem separar o miométrio (desde que o lado epitelial esteja totalmente exposto), mas manter o miomério diminui a relevância fisiológica deste modelo para a doença humana. Certifique-se de que os fragmentos são tão grandes quanto possível, mas pequenos o suficiente para passar por uma agulha de 18 G; (Recomenda-se 1 mm x 1 mm).
   2. Colete 10-12 destes fragmentos de 1 mm x 1 mm do primeiro chifre (que corresponde aproximadamente a 40 mg de tecido nos camundongos C57BL/6J). Coloque fragmentos coletados na coleta de líquidos.
7. Execute os mesmos passos para o outro chifre uterino para um total de cerca de 24 fragmentos por mouse. Documente o número total de fragmentos.

3. Injeção peritoneal de fragmentos de tecido em camundongos receptores

1. Aspirar os fragmentos suspensos de 1 mm x 1 mm utilizando a extremidade contundente de uma seringa de 1 cc; o volume total deve ser de 1 mL.
2. Coloque uma agulha de 18 G na seringa completa e carregue o fluido na agulha. Considere uma injeção simulada de volta na placa de Petri para garantir que todo o tecido passe pela agulha.
3. Pegue o rato receptor. Antes ou depois da injeção ip, obtenha uma mancha vaginal do mouse receptor para documentação do ciclo estrous (10 μL de soro fisiológico usando a seringa da lâmpada no orifício vaginal e banhada na lâmina de vidro com o deslizamento de tampa).
4. Realize a injeção intraperitoneal dos fragmentos com a seringa em um ângulo de 45 graus, tomando o cuidado de não injetar subcutânea.
5. Se os fragmentos permanecerem após a injeção, desenhe mais 200 μL do fluido para a seringa para injeção para garantir que todos os fragmentos sejam injetados com sucesso intraperitoneally.
6. Uma vez assegurado de nenhum sangramento ou complicações, coloque os camundongos receptores de volta em suas gaiolas e alimente uma dieta normal.

4. Colheita de lesões endométriticas

1. Eutanize camundongos receptores em aproximadamente 21 dias após a injeção de fragmento pós-transplante.
   NOTA: A partir da experiência e da discussão com colaboradores utilizando modelos semelhantes, o tamanho máximo da lesão e o número ocorrem em aproximadamente 3 semanas após o transplante; após 3 semanas, as lesões começam a regredir em tamanho. Utiliza-se o método aprovado pela IACUC de eutanásia.
2. Após a eutanásia e a luxação cervical, pulverize o abdômen do animal com 70% de etanol e tenda a pele para cortar superficialmente com tesoura dissecando. Inciso a pele e o espaço subcutâneo com uma tesoura para abrir o abdômen sem rodeios.
3. Antes de qualquer dissecção adicional, é realizado um levantamento completo das lesões brutas, com tamanho medido por pinças e documentado quanto à sua região anatômica (veja abaixo).
4. Realizar a coleta completa de três regiões anatômicas distintas em bloco (independentemente de as lesões podem ou não ser apreciadas grosseiramente). Se as lesões forem observadas em outras regiões (por exemplo, intestinos), estas devem ser ignoradas e não coletadas a menos que a lesão atravesse uma das três áreas abaixo.
   1. A = parede abdominal/peritônio (pode ser achatado em um ou enrolado, desde que consistente entre as amostras).
   2. B = pâncreas e gordura mesentórica.
   3. C = tecido conjuntivo parauterino e gordura (tecido branco brilhante que envolve o útero, mas não envolve nenhum órgão que não seja a bexiga; tome cuidado para não confundir a bexiga com uma lesão).
5. Coloque cada área dissecada em um, apropriadamente rotulado, e coloque-o em formalina e processo conforme protocolo de laboratório para seção histológica.
6. Blocos de formalina de seção em dois slides (D1 e D2) por área de tecido em duas profundidades uniformes.

5. Pontuação de lesões endométriticas

1. Digitalizar (a 40x de ampliação) e arquivar slides.
2. Use o software de leitura de slides digital, defina a maior distância (X) entre bordas de uma lesão endometriotica - se a borda consiste em glândulas ou estroma-e marcá-la. Uma lesão contínua é definida por glândulas cercadas por estroma; a linha não necessariamente atravessa apenas tecido endometriotico (como no caso de determinar pontos finais em um foco irregularmente moldado ou ondulante da endometriose), mas os dois pontos finais precisam ser conectados por estroma e/ou glândulas contínuas (ver Figura 4).
3. Faça uma segunda linha (Y) 90 graus através da primeira linha, com o comprimento da segunda linha determinado seguindo as regras acima.
4. Se múltiplas lesões não contíguas forem encontradas, dê a cada uma as suas próprias medidas X e Y.
5. Calcule a pontuação final de cada slide como a soma das áreas (X*Y) de cada lesão.
6. Tome a maior pontuação dos dois slides (D1 vs D2) como a pontuação final para aquela região (A, B, C).
7. Totale as pontuações de cada região para dar a pontuação microscópica final para esse animal.

Resultados

Para uma prova inicial de experimento conceitual, o endométrio de doadores de camundongos RFP foi injetado em camundongos receptores de tipo selvagem. A coloração da H&E revelou confirmação histopatológica da arquitetura clássica da lesão da endometriose(Figura 3A). A microscopia fluorescente confirmou que a lesão observada em questão teve origem no doador (Figura 3B).

O segundo experimento foi realizado utilizando 10 doador...

Discussão

Nosso estudo demonstra que a endometriose pode ser induzida de forma confiável em camundongos sem exigir o uso de cirurgia de ovariectomia e/ou sobrevivência, e que lesões endometrial ectópicas podem ser identificadas e quantificadas por meio de um levantamento padronizado do abdômen e análise histológica.

Muitos estudos de endometriose de endometriose utilizam endometriose cirurgicamente indu...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Supplies for injecting PMSG into donor mouse
1 mL Tuberculin syringe with 27G needle	Fisher Scientific	14-826-87
Pregnant mare serum gonadotropin	Sigma-Aldrich	9002-70-4
Supplies for necropsy of donor mouse and tissue processing
6” serrated forceps, curved tip	Electron Microscopy Sciences	72993-6C
70% ethanol solution	Pharmco	33000HPLCCS4L	70% solution dilute ethyl acetate 200 proof
Analytical balance	Mettler Toledo	ME54TE
Carbon dioxide	TriGas Supplier
Dissecting tray	Fisher Scientific	S14000
No. 10 disposable scalpel	Fisher Scientific	NC9999403
Scissors, curved	Electron Microscopy Sciences	72941
Scissors, straight	Electron Microscopy Sciences	72940
Stereo microscope	Leica Microsystems	Leica SE 4	For tissue dissection
Sterile phosphate buffered saline (PBS)	Institutional core facility supplies
Surgical instrument sterilization tray	Electron Microscopy Sciences	66112-02
Tissue culture dishes	Fisher Scientific	08-772E
Weighing dishes	Fisher Scientific	02-202-103
Supplies for injecting into recipient mouse
1 cc syringe	BD Biosciences	301025
18 G needle	Fisher Scientific	148265d
200 uL pipette tip	Fisher Scientific	02-707-422
Double distilled water	Institutional core facility supplies
Latex bulb	Fisher Scientific	03-448-21
Micro cover glass slip	VWR	48366-067
Microscope slide	Fisher Scientific	12-544-7
Standard light microscope	Leica Microsystems	DM IL	For evaluating vaginal cytology smears
Supplies for harvesting tissue from recipient mouse
10% Buffered formalin	Fisher Scientific	SF100-4
Biopsy foam pads	Fisher Scientific	22-038-222
Precision Digital Calipers	Electron Microscopy Sciences	62065-40
Processing/embedding cassettes	Fisher Scientific	22-272416