Doğal Bisiklet Fareleri Kullanarak Endometriozis Bir Syngeneic Murine Modeli

Özet

Endometriozisin birçok kemirgen modeli teknik karmaşıklık, tekrarlanabilirlik ve / veya bağışıklığı baskılanmış hayvanlara veya özel muhabir farelere ihtiyaç duyma ile sınırlıdır. Bağımsız olarak doğrulanabilir, objektif puanlama sistemine sahip ve ovaerektomi veya sağkalım ameliyatı için gereklilik olmayan herhangi bir deneysel fare kullanarak basitleştirilmiş bir lezyon indüksiyon sistemi sunuyoruz.

Özet

Endometriozis pelvik ağrı ve kısırlığın önde gelen bir nedenidir. Ekstrauterin yerlerde endometriyal dokunun varlığı ile tanımlanır. Endometriozis için yeni tedavilerin ve tanı araçlarının geliştirilmesi, kısmen hastalığın incelenmesindeki zorluklar nedeniyle sınırlı olmuştur. Primatların dışında, az sayıda memeli adet gösterir ve hiçbiri spontan endometriozis geliştirmez. Kemirgen modelleri popülerdir, ancak endometriozis yapay indüksiyonu gerektirir, birçoğu immün sistemi baskılanmış fareler veya cerrahi olarak indüklenen hastalık kullanır. Son zamanlarda intraperitoneal enjeksiyon içeren modellere daha fazla dikkat edilmiştir. Mevcut endometriozis modellerinin çeşitli özelliklerini öznel derecelendirme yerine mikroskobik niceleme dayanan yeni, basitleştirilmiş bir sisteme entegre eden bir endometriozis modeli sunuyoruz. Bu modelde donör farelerin hormonal stimülasyonu, intraperitoneal enjeksiyon, sistematik abdominal etüt ve doku hasadı ve nekropsi sonrası her an yapılabilen ve doğrulanabilen histolojik niceleme gerçekleştiriyoruz. Bu model minimum kaynak ve eğitim gerektirir; murine sağkalım cerrahisinde veya brüt endometriotik lezyonların tanımlanmasında laboratuvar teknisyenleri tarafından uzmanlık gerektirmez; bağışıklık sistemi baskılanmış, immün yetecekli ve/veya mutant farelerde kullanılabilir; ve güvenilir bir şekilde insan endometriotik hastalığı ile histolojik olarak tutarlı endometriotik lezyonlar oluşturur.

Giriş

Endometriozis, kadınlar üzerinde önemli finansal ve sağlık yükleri olan kadın üreme sisteminin esrarengiz bir hastalığıdır^1,2. Endometriozis etiyolojisi tam olarak anlaşılamamıştır ve koelomik metaplazi, embriyonik Müllerian restleri, kemik iliği türevli progenitör hücrelerin işe alınması ve retrograd adet³dahil olmak üzere birden fazla açıklama önerilmiştir. Önerilen bu mekanizmaların birden fazla yönü söz konusu olsa da ve hastalığın tüm formlarını tek bir açıklama açıklayamasa da, endometriozis patogenezinin önde gelen modeli retrograd adettir. Retrograd adet, adet atıklarının fallop tüplerinden ve periton boşluğuna geçişidir; adet gören kadınların% 90'ının düzenli olarak retrograd adet gördüğü tahmin edilmektedir^4,5. Retrograd adet görmenin bu yaygın fenomeni göz önüne alındığında, endometriozisin neden sadece kadınların bir alt kümesinde geliştiği belirsizdir⁵. Bu hastalığın etiyolojisini daha iyi anlamak için doğrudan insan çalışmaları mümkün değildir ve hayvan çalışmaları garanti edilir.

Endometriozis hem tedavi etmek hem de çalışmak için bir zorluktur. Hastalığın prevalansı bilinmemekle birlikte %10¹olarak tahmin edilmektedir. Bazı ileri endometriozis türleri noninvaziv görüntüleme ile doğru bir şekilde tanımlanabilirken, kesin tanı ancak cerrahi olarak elde edilen biyopsi örneklerinin histopatolojik analizi ile elde edilir; görsel olarak hastalıklı gibi görünen lezyonlar, aslında fibrozis veya diğer nedenlerden yara izi olabilir⁶. Hastalığın şiddeti ve kapsamı semptomatoloji ile ilişkili değildir⁷.

Endometriozis lezyonları, mikroçevrinde karmaşık şekillerde etkileşime giren heterojen hücre tiplerinden ve popülasyonlardan oluşur, bu nedenle hücresel modellerin yararlılığını sınırlar^8,9. In vivo modelleri vardır, ancak bunlar doğal zorluklara ve sınırlamalara sahiptir^10,11,12. Primat modelleri idealdir, ancak genellikle uygulanabilir değildir^13,14,15. Birkaç primat olmayan memeli adet gören ve kendiliğinden endometriozis geliştiren¹⁶. Kemirgen endometriozis modelleri vardır, ancak her birinin sınırlamaları vardır¹⁷. Bu modellerin çoğu, donör alıcı duvarına veya bağırsayasına endometriyal doku dikmek veya implante etmek için sağkalım ameliyatı gerektirir, teknik karmaşıklık, anestezi ihtiyacı ve ameliyatın kendisinden şaşırtıcı bağışıklık faktörleri ekler^18,19,20. Ek olarak, birçok model yumurtalık ve östrojen takviyesi gerektirir; lezyon verimini artırırken, bu zaman, masraf ve ek sağkalım cerrahisi ekler. Intraperitoneal (IP) enjeksiyon modelleri anestezi veya sağkalım ameliyatı gerektirmez ve bu modeller mantıksal olarak retrograd adeti dikiş modellerinden daha iyi simüle eder^21,22,23. Bununla birlikte, çoğu IP modeli, enjeksiyondan sonra endometriyal parçaların rastgele dağılımı ve dolayısıyla lezyon tanımlama ve ölçümünde daha fazla önyargı nedeniyle lezyon konumunda daha fazla değişkenliğe maruz kalmaktadır.

Burada, mevcut endometriozis modellerinin çeşitli özelliklerini öznel derecelendirme yerine mikroskobik niceleme dayanan yeni, basitleştirilmiş ve verimli bir sisteme entegre eden bir endometriozis murine modeli sunuyoruz.

Protokol

NOT: Bu çalışmada hayvanların kullanımı Cleveland Clinic Lerner Araştırma Enstitüsü Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır. Kamuya açık tüm hayvan bakım ve kullanım standartları, Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından kurallara uygun olarak gerçek gerçekleştirildi. Bu prosedür aseptik teknikler kullanmaktadır. Petri kabı sterildir. Kullanılan PBS/salin sterildir. Nekropsi ve doku diseksiyonu için cerrahi aletler otoklav ile sterilize edilir. Kontaminasyonu azaltmak için hayvan vakaları arasındaki aletlerde (seans başına birden fazla ise) %70 EtOH kullanıyoruz.

1. Donör ve alıcı farelerin hazırlanması (bkz. Şekil 1)

1. Laboratuvar hayvanlarıyla çalışmak için uygun onayın yerinde olduğundan emin olun.
2. Farenin zorluğunu belirleyin. Bu deneylerde, C57BL / 6J arka planına sahip wildtype ve mutant fareler kullanılmıştır, ancak benzer modelleri kullanan araştırmacılar BALB / c fareler¹⁰gibi diğer fare suşları ile başarıyı bildirmektedir. Ek olarak, donör ve/veya alıcı fareler GFP veya RFP fareleri gibi muhabir sistemlerini kullanabilir (bkz. Şekil 2 ve Şekil 3).
3. Endometriyal doku naklinin zamanlaması için, donör farelerin gonadotropin enjeksiyonu sırasında 22-24 günlük olduğundan emin olun. Bu, üreme olarak naif olmalarını sağlar, örneğin henüz östrous bisiklet sürmeye başlamamıştır.
4. Alıcı farelerin 2 ila 4 ay arasında üreme bozulmadan (önceden yumurtalık ameliyatı yapılmaz) olduğundan emin olun. Gerekli olmasa da, devam eden östrous bisiklet sürmeyi kolaylaştırmak için ve endometriyal doku naklinden önce tekrar 72 saat içinde, bir erkek fare kafesinden idrarla ıslatılmış yatakların periyodik olarak alıcının kafesine yerleştirilmesi önerilir.
   NOT: Bu, alıcıların östrous döngüsünün senkronizasyonunu sağlamaz, çünkü idrarla ıslatılmış yataklar kullanılan erkek yatak miktarına oldukça bağlıdır ve değişken sonuçlara sahiptir. Östrous döngüsünün senkronizasyonu istenirse, 100 ng/100 μL estradiolden oluşan ardışık üç deri altı enjeksiyonu tüm hayvanları östrous faza getirecektir. Estrous döngüsünün evresine dayanan lezyon indüksiyonunda bir fark bulamasak da, diğer gruplar döngü fazını önemli buldu¹⁰.
5. Hamile Mare Serum Gonadotropin'i (PMSG, 200 μL'ye seyreltilmiş 2 IU) ince bir iğne kullanarak (25-27 Gönerilir)deri altından donör farelere deri altından enjekte edin. Endometriozis oluşumuna daha az duyarlı olan yumurtlamayı ve ardından gelen yüksek progesteron ortamını tetikleyeceği için alıcı farelere PMSG vermeyin.
   NOT: Önceki fare modelleri, endometriyal hasat^23'tenönce donör farelerde endometriyal çoğalması teşvik etmek için PMSG veya östrojen kullanmıştır. PMSG aşağıdaki nedenlerden dolayı önerilir: PMSG'nin yarı ömrü 40 saat, 17-beta-estradiol'un yarı ömrü ise sadece 2 saattir. Endometriyal doku tedariki öncesinde donörlerde 40 saat pmsg tek bir deri altı enjeksiyonu kullanılarak, endojen östrojen uyarmak için hareket gonadotropin stimülasyonuna sürekli bir maruz kalma süresi sağlar. Eksojen östrojenin birçok preparabı, endometriumu yeterince astarlamak için birden fazla enjeksiyon gerektirir.
6. PMSG enjeksiyonundan sonra, nekropsi, tedarik ve nakli 38-42 saat arasında alıcıya planlayın. Yumurtlamadan önce dokunun toplanmasını sağlamak için gonadotropin enjeksiyonunu takiben endometriyal doku hasadını zamanlayın, bu da enjeksiyon sonrası 42 saattir. Yumurtlama, lezyon indüksiyonunu azaltacak yüksek progesteron (P4) ortamı üretir.

2. Donör fare endometriyal dokusunun temini

1. Donör fare ötanaziden sonra (CO₂ odasını ve ardından servikal çıkığı kullanarak), karnı% 70 etanol çözeltisi ile püskürtün; bu, temin edilen dokunun cilt florasından ve yerinden edilmiş tüylerden kirlenmesini azaltmaya yarar. Diseksiyon makası ile cilt ve deri altı dokusundan orta çizgide sığ bir enine yudum yapın. Daha sonra cilt kesisinin her iki tarafını kavrayarak, karnı açmak için künt çekiş kullanın.
2. Rahmi tanımla. Uterusun çıkarılmasından önce, bitişik bağ dokusunu kesin. Her rahim boynuzu kendi fallop tüpünün hemen altında transekte edin ve daha sonra tüm uterus bloğunu çıkarmak için serviksi transekte edin.
3. Karın boşluğundan çıkarıldıktan sonra, uterusun dikkatlice incelenmesi ve ek periferik yağ veya bağ dokusunu çıkarın. Uterusun bir Petri kabına soğuk PBS damlacıklarına yerleştirin. Tüm uterusun birleşik kütlesini belirleyin ve belgeleyin.
4. Her boynuzu uterus fundusundan transeksiyon, her boynuzun uzunluğunu en üst düzeye çıkarmak için fundusa mümkün olduğunca yakın hale getirir. Bir diseksiyon mikroskobu yardımıyla, kesme makasının bir bıçağını ilk boynuzun lümeninin içine yerleştirin, ardından tüpün ana ekseni boyunca kesin. Tüpü dikkatlice açın, hangi tarafın serosa, hangi tarafın epitel olduğunu unutmayın.
5. Yeni bir Petri kabına 500 cc tuzlu su veya PBS koyun; yüzey gerilimi nedeniyle sıvı bir arada kalacaktır.
6. Daha sonra, uterusun parçalanmasını düzgün bir şekilde gerçekleştirin. Birçok küçük lezyona göre daha az büyük lezyona sahip olmak daha iyidir. Endometriyal tabakayı kavrayarak ve soyup çıkararak epitelleri miyometriyumdan ayırarak başlayın.
   1. Alternatif olarak, miyometriumu ayırmadan (epitel tarafı tamamen maruz kaldığı sürece) dokuyu parçalayın, ancak miyometriumu korumak bu modelin insan hastalığıyla fizyolojik ilgisini azaltır. Parçaların mümkün olduğunca büyük ancak 18 G iğneden geçecek kadar küçük olduğundan emin olun; (1 mm x 1 mm önerilir).
   2. Bu 1 mm x 1 mm parçalardan 10-12'sini ilk boynuzdan toplayın (bu da C57BL/ 6J farelerde kabaca 40 mg dokuya karşılık gelir). Toplanan parçaları sıvı koleksiyonuna yerleştirin.
7. Fare başına toplam yaklaşık 24 parça için diğer rahim boynuzu için aynı adımları uygulayın. Toplam parça sayısını belgele.

3. Alıcı fareye doku parçalarının periton enjeksiyonu

1. Askıya alınan 1 mm x 1 mm'lik parçaları 1 cc şırınnanın künt ucunun künt ucunun kullanılarak aspire edin; toplam hacim 1 mL olmalıdır.
2. Tam şırıngaya 18 G'lik bir iğne takın ve sıvıyı iğneye yükleyin. Tüm dokunun iğneden geçmesini sağlamak için Petri kabına sahte bir enjeksiyon düşünün.
3. Alıcı fareyi alın. IP enjeksiyonundan önce veya sonra, östrous döngüsü belgeleri için alıcı farenin vajinal bir lekesini elde edin (vajinal delikte ampul şırıngını kullanarak ve kapakla cam kaydırağa kaplanmış 10 μL salin).
4. Parçaların şırınd ile intraperitoneal enjeksiyonu 45 derecelik bir açıyla gerçekleştirin, deri altından enjekte etmemeye dikkat edin.
5. Parçalar enjeksiyondan sonra kalırsa, tüm parçaların intraperitoneal olarak başarıyla enjekte edildiğinden emin olmak için enjeksiyon için şırındağa ilave 200 μL sıvı çizin.
6. Kanama veya komplikasyon olmadığından emin olduktan sonra, alıcı fareleri kafeslerine geri yerleştirin ve normal bir diyetle besleyin.

4. Endometriotik lezyonların hasadı

1. Nakil sonrası parça enjeksiyonundan yaklaşık 21 gün sonra alıcı fareleri ötenazi yapın.
   NOT: Deneyimlerden ve benzer modelleri kullanan işbirlikçilerle tartışmadan, maksimum lezyon büyüklüğü ve sayısı nakil sonrası yaklaşık 3 haftada gerçekleşir; 3 hafta sonra lezyonlar boyut olarak gerilemeye başlar. IACUC onaylı ötanazi yöntemi kullanılmaktadır.
2. Ötenazi ve servikal çıkık sonrasında, hayvanın karnına% 70 etanol püskürtün ve cildi diseksiyon makası ile yüzeysel olarak kesmek için çadırlayın. Karnı açıkça açmak için cildi ve deri altı boşluğu makasla inzivaya çıkarın.
3. Daha fazla diseksiyon yapılmadan önce, brüt lezyonlar için tam bir anket yapılır, boyutu kaliperlerle ölçülür ve anatomik bölgelerine göre belgelenir (aşağıya bakın).
4. Blok olarak üç farklı anatomik bölgenin tam koleksiyonunu gerçekleştirin (lezyonların büyük ölçüde takdir edilip edilemeyeceğine bakılmaksızın). Lezyonlar diğer bölgelerde (örneğin bağırsaklar) görülüyorsa, lezyon aşağıdaki üç alandan birini geçmedikçe bunlar göz ardı edilmeli ve toplanmamalıdır.
   1. A = karın duvarı/periton (numuneler arasında tutarlı olduğu sürece bir kasete düzleştirilebilir veya yuvarlanabilir).
   2. B = pankreas ve mezenterik yağ.
   3. C = parauterin bağ dokusu ve yağ (uterusun etrafını saran ancak mesane dışında herhangi bir organ içermeyen beyaz ışıltılı doku; mesaneyi bir lezyonla karıştırmamaya özen gösterir).
5. Diseksiyon yapılan her alanı uygun şekilde etiketlenmiş bir kasete yerleştirin ve histolojik bölümleme için laboratuvar protokolüne göre formalin ve işleme yerleştirin.
6. Bölüm formalin blokları iki düzgün derinlikte doku alanı başına iki slaytta (D1 ve D2).

5. Endometriotik lezyonların puanlatması

1. Tarama (40x büyütmede) ve arşiv slaytları.
2. Dijital slayt okuma yazılımını kullanın, endometriotik bir lezyonun kenarları arasındaki en uzun mesafeyi (X) tanımlayın - kenarın bezlerden mi yoksa stromadan mı oluştuğunu ve işaretleyin. Sürekli bir lezyon stroma ile çevrili bezlerle tanımlanır; çizgi mutlaka sadece endometriotik dokudan geçmez (düzensiz şekilli veya dalgalı bir endometriozis odağında uç noktaların belirlenmesinde olduğu gibi) ancak iki uç noktanın sürekli stroma ve/veya bezlerle bağlanması gerekir (bkz. Şekil 4).
3. yukarıdaki kurallara uyarak ikinci satırın uzunluğu belirlenecek şekilde, ilk satır boyunca 90 derecelik ikinci bir çizgi (Y) yapın.
4. Bitişik olmayan birden fazla lezyonla karşılaşılırsa, her bireye kendi X ve Y ölçümlerini verin.
5. Her slayt için son puanı, her lezyonun alanlarının (X * Y) toplamı olarak hesaplayın.
6. O bölgenin (A, B, C) son puanı olarak iki slayttan (D1 vs D2) daha büyük puanları alın.
7. Bu hayvan için son mikroskobik puanı vermek için her bölgeden puanları toplar.

Sonuçlar

Konsept deneyinin ilk kanıtı için, RFP farelerinden donör endometriyum wildtype alıcı farelere enjekte edildi. H&E lekeleme endometriozis lezyonunun klasik mimarisinin histopatolojik teyidini ortaya koydu (Şekil 3A). Floresan mikroskopi, söz konusu gözlenen lezyonun donörden kaynaklandığını doğruladı (Şekil 3B).

İkinci deney, 10 wildtype C57BL/6J bağışçısı ve 10 alıcı kullanılarak gerçekleştirildi. Ek 5 al...

Tartışmalar

Çalışmamız, endometriozisin farelerde ovaerektomi ve/veya sağkalım cerrahisi kullanılmadan güvenilir bir şekilde indüklenebileceğini ve ektopik endometriyal lezyonların karın ve histolojik analizlerin standart bir anketi kullanılarak tespit edilip nicelleştirilebileceğini göstermektedir.

Endometriozis ile ilgili birçok murine çalışması, donör endometriyumun bağırsak, karın d...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Supplies for injecting PMSG into donor mouse
1 mL Tuberculin syringe with 27G needle	Fisher Scientific	14-826-87
Pregnant mare serum gonadotropin	Sigma-Aldrich	9002-70-4
Supplies for necropsy of donor mouse and tissue processing
6” serrated forceps, curved tip	Electron Microscopy Sciences	72993-6C
70% ethanol solution	Pharmco	33000HPLCCS4L	70% solution dilute ethyl acetate 200 proof
Analytical balance	Mettler Toledo	ME54TE
Carbon dioxide	TriGas Supplier
Dissecting tray	Fisher Scientific	S14000
No. 10 disposable scalpel	Fisher Scientific	NC9999403
Scissors, curved	Electron Microscopy Sciences	72941
Scissors, straight	Electron Microscopy Sciences	72940
Stereo microscope	Leica Microsystems	Leica SE 4	For tissue dissection
Sterile phosphate buffered saline (PBS)	Institutional core facility supplies
Surgical instrument sterilization tray	Electron Microscopy Sciences	66112-02
Tissue culture dishes	Fisher Scientific	08-772E
Weighing dishes	Fisher Scientific	02-202-103
Supplies for injecting into recipient mouse
1 cc syringe	BD Biosciences	301025
18 G needle	Fisher Scientific	148265d
200 uL pipette tip	Fisher Scientific	02-707-422
Double distilled water	Institutional core facility supplies
Latex bulb	Fisher Scientific	03-448-21
Micro cover glass slip	VWR	48366-067
Microscope slide	Fisher Scientific	12-544-7
Standard light microscope	Leica Microsystems	DM IL	For evaluating vaginal cytology smears
Supplies for harvesting tissue from recipient mouse
10% Buffered formalin	Fisher Scientific	SF100-4
Biopsy foam pads	Fisher Scientific	22-038-222
Precision Digital Calipers	Electron Microscopy Sciences	62065-40
Processing/embedding cassettes	Fisher Scientific	22-272416