Imágenes de perfusión doppler láser en el hindlimb del ratón

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo que demuestra la técnica y los controles necesarios para las imágenes de perfusión de Laser Doppler para medir el flujo sanguíneo en el retroigrama del ratón.

Resumen

La recuperación del flujo sanguíneo es una medida de resultado crítico después de la isquemia hindlimb experimental o la reperfusión de isquemia. Las imágenes de perfusión doppler láser (LDPI) es un método común, no invasivo y repetible para evaluar la recuperación del flujo sanguíneo. La técnica calcula el flujo sanguíneo general en el tejido muestreado a partir del cambio de frecuencia de Doppler causado cuando un láser golpea los glóbulos rojos en movimiento. Las mediciones se expresan en unidades de perfusión arbitrarias, por lo que el contralateral no intervenido en la pierna se utiliza generalmente para ayudar a controlar las mediciones. La profundidad de medición está en el rango de 0,3-1 mm; para la isquemia hindlimb, esto significa que se evalúa la perfusión dérmica. La perfusión dérmica depende de varios factores, sobre todo la temperatura de la piel y el agente anestésico, que deben controlarse cuidadosamente para dar lugar a lecturas fiables. Además, la pigmentación del cabello y la piel puede alterar la capacidad del láser para alcanzar o penetrar en la dermis. Este artículo muestra la técnica de LDPI en el hindlimb del ratón.

Introducción

Ulceración cutánea con cicatrización inadecuada de heridas es una de las principales causas de amputación en pacientes humanos^1. La cicatrización adecuada de heridas requiere mayores niveles de perfusión arterial de los necesarios para mantener la piel intacta, que se ve comprometida en pacientes con enfermedad arterial periférica^2,3,4. Varias otras afecciones reumatológicas y la diabetes también pueden conducir a microcirculación cutánea perturbada e inadecuada para curar heridas^5,6. Muchos pacientes diabéticos tienen una enfermedad arterial periférica concomitante, lo que los coloca en un riesgo especialmente alto de amputación. Las imágenes de perfusión de Doppler láser (LDPI) se utilizan en situaciones clínicas para evaluar la microcirculación de la piel, así como en situaciones de investigación para evaluar el flujo sanguíneo y la recuperación del flujo sanguíneo después de la isquemia hindlimb experimental, isquemia-reperfusión y aletas microquirúrgicas^7.

El sistema LDPI proyecta un rayo láser de baja potencia que es desviado por un espejo de escaneo para moverse sobre una región de interés. Esto difiere de la caudalmetría Laser Doppler, que proporciona una medición de perfusión para el área pequeña del tejido en contacto directo con la sonda de diagrama⁸. Cuando el rayo láser interactúa con la sangre en movimiento en la microvasculatura, se somete a un cambio de frecuencia Doppler, que es fotodetectado por el escáner y convertido en unidades de perfusión arbitrarias. Dado que el LDPI es una técnica basada en la luz, se limita en términos de profundidad de penetración a 0,3-1 mm, lo que significa que en su mayor parte la perfusión dérmica se evalúa⁷. El flujo dérmico puede ser alterado por la temperatura de la piel y el sistema nervioso simpático, que puede verse afectado por varios agentes anestésicos^9. Las mediciones del láser óptico también se ven afectadas por las condiciones de iluminación ambiental, pigmentación de la piel, y pueden ser bloqueadas por el exceso de piel o el cabello^7.

LDPI es la técnica de investigación más utilizada para monitorear la recuperación de perfusión después de la isquemia porque no es invasiva, no requiere administración de contrastes y tiene tiempos de escaneo rápidos que permiten la recolección de datos en varios animales. Esto hace que sea ideal para ayudar a determinar si los tratamientos dirigidos a la arteriogénesis terapéutica o la angiogénesis son eficaces en modelos animales pequeños. La recuperación del flujo sanguíneo después de la isquemia del hindlimb medida por el LDPI se correlaciona bien con el desarrollo de arterias colaterales cuando se evalúa por otros medios como la fundición microfil o micro-CT^10,11. El objetivo de este protocolo es demostrar la evaluación de la perfusión de hindlimb utilizando LDPI.

Protocolo

Los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con un protocolo aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Washington.

1. Preparación del escáner

1. Ajuste la altura del escáner para que la distancia al sujeto escaneado sea de aproximadamente 30 cm.
2. Encienda el imager e inicie el software asociado.
3. Abra el programa de medición. Si el software se comunica correctamente con el escáner, aparecerá la advertencia de encendido láser infrarrojo.
4. Calibrar la máquina con estándares proporcionados por el fabricante (no se muestra en el video y dependerá del modelo específico de máquina que se utilice).
5. Ajuste la configuración del escáner para que sea adecuada para el material de fondo y la configuración de iluminación de la habitación.
   1. Establezca los niveles de ganancia DC FLUX y CONC,según las instrucciones del fabricante (no se muestran en el vídeo).
   2. Establezca el umbral de fondo apuntando el rayo láser al material de fondo negro y pulse Auto BK Set.

2. Preparación previa al escaneo del ratón

1. Configure la cámara de inducción isoflurano con la limpieza adecuada del gas residual.
   NOTA: Colocar la cámara de inducción en una almohadilla de calentamiento ayudará a prevenir la pérdida de temperatura del ratón durante la inducción por anestesia.
2. Encienda la manta homeotérmica, que se coloca en el área de escaneo debajo de una superficie noreflectiva (en este caso un tejido negro de neopreno). Ajuste la manta homeotérmica para mantener una temperatura corporal de 37 °C.
3. Coloque la sonda de temperatura para la manta homeotérmica y el lubricante para que estén listos para su inserción.
4. Coloque la máscara de anestesia y el sistema de barrido en el área de escaneo.
5. Anestesia el ratón con un vaporizador isoflurano. Ajuste la velocidad de oxígeno a 1 L/min de flujo y ajuste el isoflurano al 4% para la inducción por anestesia. Encienda el flujo a la cámara de inducción de anestesia y la frecuencia respiratoria del ratón se ralentizará. La anestesia adecuada se logra cuando el ratón pierde su reflejo corrector.
6. Transfiera el ratón a una máscara anestésica/cono nasal con carroñero de gas residual conectado y ajuste el isoflurano al 1,5%.
   NOTA: Este nivel de anestesia es generalmente adecuado para mantener el ratón tendido relativamente quieto durante la exploración, pero no está destinado a proporcionar niveles quirúrgicos de anestesia, por lo que no se comprueba la profundidad de la anestesia. Cambiar el nivel de isoflurano provoca cambios en los latidos del corazón, la respiración y la perfusión dérmica, por lo que se debe utilizar un porcentaje consistente a lo largo de cualquier experimento de curso de tiempo y para todos los sujetos experimentales. También se pueden utilizar técnicas anestésicas alternativas como la inyección de IP de ketamina xylazina, pero la misma técnica anestésica debe utilizarse a lo largo de cualquier momento del estudio del curso, ya que diferentes anestésicos afectan la perfusión dérmica de manera diferente.
7. (Opcional dependiendo del área de escaneo) Si la región de interés prevista para ser escaneada está cubierta por piel, utilice una pequeña recortadora eléctrica o crema depilatoria para eliminar el cabello de la región de interés.
   NOTA: La crema depilatoria debe eliminarse por completo, y la piel del ratón se seca antes de escanear.
8. Coloque el ratón en la posición de escaneo adecuada en la superficie negra noreflectiva que cubre la manta homeotérmica, confirmando que ambas extremidades posteriores permanecen en la fuente de calor durante el equilibrio y el escaneo(Figura 1).
   NOTA: Es importante mantener ambos pies en la manta homeotérmica para evitar la variación regional de la temperatura.
9. Inserte la sonda de temperatura rectal lubricada asociada con la manta homeotérmica.
10. Eequilibrar la temperatura del ratón a la temperatura de escaneo deseada (37 °C); aproximadamente 5-10 minutos.
11. Seleccione Configuración del escáner,a la que se puede acceder desde el menú superior o desde el icono de configuración del escáner. Ajuste el área de escaneado cambiando las coordenadas X-Y para adaptarse a la región de interés. La velocidad de escaneo dependerá de la resolución del escaneo. Una resolución más alta dará lugar a tiempos de escaneo más largos. Para el escaneo repetido centrado en la perfusión global, en lugar de una resolución más alta centrada en la perfusión anatómica, una velocidad de escaneo de 4 ms/pixel es adecuada.
    NOTA: Se debe considerar una resolución más alta y una sola exploración si el investigador está tratando de estudiar directamente la circulación colateral en desarrollo (mejor imagen en el muslo ventral y la pantorrilla donde está más cerca de la piel). La exploración repetida a menor resolución/velocidad (por ejemplo, 4 ms/píxel) es adecuada al evaluar la perfusión global al órgano final de la almohadilla del ratón. El software que se muestra en el vídeo carga automáticamente la plantilla utilizada anteriormente para escanear el área, la velocidad y la resolución cuando se reinicia, o se puede recuperar de un archivo almacenado si se utilizan diferentes regiones de interés para varios experimentos.
12. Si realiza análisis repetidos, seleccione la pestaña Repetir y Analizar línea. El número de escaneos se puede cambiar (en este caso 3 escaneos) así como el intervalo de repetición. El tiempo mínimo para el intervalo de repetición sería el tiempo de escaneo estimado, que se muestra en el área atenuada a la derecha de la caja determinada por el área de escaneo y la resolución de escaneo. Agregar unos segundos permite al usuario pausar y potencialmente cambiar la posición del ratón si es necesario entre escaneos.

3. Escaneo

1. Seleccione la pestaña Escaneo de imagen y seleccione el botón Marcar. El láser se moverá para delinear el área de escaneo. Ajuste la posición del ratón para que el destino a escanear esté dentro del área marcada.
   NOTA: Para el escaneo de footpad o footpad y pantorrilla, el posicionamiento propenso con las extremidades posteriores extendidas proporciona una región de interés más consistente que el posicionamiento supino. La arteria femoral y la arteria sapenosa y las garantías están muy cerca de la superficie ventral del muslo y la pantorrilla, por lo que se prefiere el posicionamiento supino si se utilizan estas regiones de interés.
2. Inicie la medición repetida seleccionando el icono Repetir escaneado y pulse el botón Reproducir para iniciar el análisis.
3. Confirme la distancia de escaneado en la ventana emergente y haga clic en Aceptar para comenzar a escanear.
4. Monitoree el ratón durante la exploración del movimiento del ratón; si el ratón se mueve lo suficiente como para que los archivos traseros ya no estén en la región de escaneado en medio de un análisis, reinicie el análisis. Pequeñas variaciones en la posición del papel trasero del ratón se pueden acomodar en el software de análisis.
5. Monitoree la temperatura del ratón durante el proceso de escaneo, ya que puede fluctuar incluso con el uso de la manta homeotérmica. Si hay demasiada variación en la temperatura del ratón, esto puede resultar en variaciones significativas entre las exploraciones. Generalmente, un rango de temperatura de 36.8-37.2 ° C dará lugar a datos aceptables.
6. Guarde el análisis capturado en la ventana Guardar como con un nombre de archivo que incluya el identificador del mouse y el punto de tiempo para facilitar el análisis de datos. Introduzca los detalles del ratón y del punto de tiempo si lo desea en la ventana de detalles del asunto.
7. Apague el isoflurano y retire la sonda de temperatura rectal.
8. Desinfectar la sonda de temperatura rectal con 70% de etanol por lo que está listo para su uso en el siguiente ratón.
9. Permita que el ratón se recupere de la anestesia hasta el punto en que muestra un reflejo corrector volteando desde la posición supina a la posición propensa antes de devolverlo a la jaula.
   NOTA: La recuperación se puede llevar a cabo ya sea en una manta de calentamiento para isofluranos ya que la recuperación es muy rápida o en una jaula de recuperación calentada para ketamina/xilazina.

4. Captura de datos LDPI (Figura 3)

1. Abra el programa de software de revisión de imágenes.
2. Vaya al menú de archivos, abra y busque el archivo guardado.
3. Seleccione el icono roi en la barra de herramientas.
4. Seleccione el botón Agregar polígono.
5. Trace la región de interés (ROI) para el control hindlimb utilizando el ratón. El seguimiento poligonal no tiene que ser exacto, ya que el fondo gris no se incluirá en los promedios calculados.
6. Repita los pasos 4.3-4.5 para el retrocamb quirúrgico.
7. Elija el icono Estadísticas para abrir la ventana Resultados de estadísticas (PU) de ROIs de imagen.
8. Exporte los resultados para el Polígono 1 (control hindlimb) y el Polígono 2 (hindlimb quirúrgico) a una hoja de trabajo de recopilación de datos a través de copiar/pegar.

5. Análisis

1. Capture los datos como proporción quirúrgica/de control para cada escaneo.
2. Utilice el control/cirugía promediado para las tres exploraciones para el punto de datos de ese ratón en particular en ese momento. Debido a la variabilidad biológica en la respuesta a la isquemia hindlimb, en general se requieren 8-10 ratones por punto de tiempo para lograr resultados reproducibles con ~ 10% error estándar.
   NOTA: Antes de permitir que el ratón se recupere de la anestesia, vale la pena realizar un análisis rápido de las exploraciones repetidas para comprobar si los datos son demasiado variables (por ejemplo, más de 100-150 unidades de perfusión diferentes entre las exploraciones 1-3). La alta variación entre los escaneos repetidos sugiere que el ratón no se ha equilibrado completamente durante el análisis(figura 2),y se puede realizar una exploración repetida sin perder un punto de datos, lo que ocurriría si las imágenes no se analizan hasta una fecha posterior. Es posible que sea necesario cambiar la paleta de colores para optimizar el rango dinámico de valores de flujo mostrados para mostrar mejor la variación del escaneo (Figura 2).

Resultados

El LDPI exitoso debe dar lugar a exploraciones constantes de medidas repetidas, con no más de 100-150 de variación de la unidad de perfusión (correspondiente a aproximadamente el 10% de la perfusión media habitual para el bloc de pies del ratón) entre las tres exploraciones(Figura 2). Como se muestra en la Figura 2,las exploraciones repetidas ayudan a determinar que el ratón se ha equilibrado adecuadamente para que la relación isquémica/de control reflej...

Discusión

La técnica consistente es fundamental para obtener resultados fiables con LDPI. El mismo anestésico, la configuración de temperatura, la posición del ratón y la región de interés deben utilizarse durante todo el curso de tiempo. Diferentes agentes anestésicos darán como resultado valores de perfusión superiores o inferiores^9. La anestesia isoflurano es conveniente debido a su rápida aparición y aparición, así como a la seguridad general. Un porcentaje constante de isoflurano debe uti...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Black nonreflective material			Fabric store, black neoprene recommended by company
F/air cannister	A.M. Bickford Inc	80120
Homeothermic blanket with rigid metal probe	Harvard Apparatus		Also comes with flexible probe, but this is less durable
Isoflurane Anesthesia machine	Drager		Multiple manufacturers
Isoflurane induction chamber	VetEquip	941444	2 L chamber
Moor laser Doppler perfusion imager	Moor Instruments	MoorLDI2-IR	Higher resolution imager (MoorLDI2-HIR)
Mouse Anesthesia nose cone			Multiple manufacturers
Nair	Nair
Oxygen tank			Multiple manufacturers
Surgilube	Multiple distributors