Laser Doppler Perfusion Imaging in der Maus Hindlimb

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Protokoll vor, das die Technik und die notwendigen Kontrollen für die Laser Doppler-Perfusionsbildgebung demonstriert, um den Blutfluss im Maushinterglied zu messen.

Zusammenfassung

Die Blutflussrückgewinnung ist eine kritische Ergebnismaßnahme nach experimenteller Hindlimb Ischämie oder Ischämie-Reperfusion. Laser Doppler Perfusionsbildgebung (LDPI) ist eine häufige, nichtinvasive, wiederholbare Methode zur Beurteilung der Blutflussrückgewinnung. Die Technik berechnet den gesamten Blutfluss im entnommenen Gewebe aus der Doppler-Frequenzverschiebung, die verursacht wird, wenn ein Laser auf bewegte rote Blutkörperchen trifft. Die Messungen werden in beliebigen Perfusionseinheiten ausgedrückt, so dass die kontralateralen nicht eingegriffenen am Bein in der Regel zur Kontrolle von Messungen verwendet werden. Die Messtiefe liegt im Bereich von 0,3-1 mm; für Hinterlimbischämie bedeutet dies, dass die dermale Perfusion bewertet wird. Die Dermale Perfusion ist von mehreren Faktoren abhängig – vor allem von der Hauttemperatur und dem Anästhetikum, die sorgfältig kontrolliert werden müssen, um zu zuverlässigen Messwerten zu führen. Darüber hinaus kann die Haar- und Hautpigmentierung die Fähigkeit des Lasers verändern, die Dermis entweder zu erreichen oder zu durchdringen. Dieser Artikel zeigt die Technik von LDPI im Maus-Hinterglied.

Einleitung

Hautgeschwüre mit unzureichender Wundheilung ist eine der Hauptursachen für Amputationen bei menschlichen Patienten¹. Eine adäquate Wundheilung erfordert ein höheres Maß an arterieller Perfusion, als erforderlich ist, um intakte Haut zu erhalten, die bei Patienten mit peripherer arterieller Erkrankung^2,3,4beeinträchtigt wird. Mehrere andere rheumatologische Erkrankungen und Diabetes können auch zu einer gestörten und unzureichenden Mikrozirkulation der Haut führen, um Wunden zu heilen^5,6. Viele Diabetiker haben eine begleite periphere arterielle Erkrankung, wodurch sie einem besonders hohen Risiko für eine Amputation ausgesetzt sind. Laser Doppler Perfusionsbildgebung (LDPI) wird in klinischen Situationen verwendet, um die Mikrozirkulation der Haut zu bewerten, sowie in Forschungssituationen, um den Blutfluss und die Blutflussrückgewinnung nach experimenteller Hindlimb Ischämie, Ischämie-Reperfusion und mikrochirurgischen Klappen⁷zu bewerten.

Das LDPI-System projiziert einen Low-Power-Laserstrahl, der von einem Scanspiegel abgelenkt wird, um sich über einen Bereich von Interesse zu bewegen. Dies unterscheidet sich von der Laser-Doppler-Flowmetrie, die eine Perfusionsmessung für den kleinen Gewebebereich in direktem Kontakt mit der Fließsonde⁸ermöglicht. Wenn der Laserstrahl mit bewegtem Blut in der Mikrovaskulatur interagiert, durchläuft er eine Doppler-Frequenzverschiebung, die vom Scanner fotografiert und in beliebige Perfusionseinheiten umgewandelt wird. Da LDPI eine lichtbasierte Technik ist, ist sie in Bezug auf die Penetrationstiefe auf 0,3-1 mm begrenzt, was bedeutet, dass die dermale Perfusion zum größten Teil⁷bewertet wird. Dermaler Durchfluss kann durch die Hauttemperatur und das sympathische Nervensystem verändert werden, das durch verschiedene Anästhetika beeinflusst werden kann⁹. Messungen des optischen Lasers werden auch durch Umgebungslichtbedingungen, Hautpigmentierung beeinflusst und können durch überlagerndes Fell oder Haar blockiert werden⁷.

LDPI ist die am häufigsten verwendete Forschungstechnik zur Überwachung der Perfusionsrückgewinnung nach Ischämie, da sie nicht invasiv ist, keine Kontrastverabreichung erfordert und schnelle Scanzeiten hat, die die Datenerfassung bei mehreren Tieren ermöglichen. Dies macht es ideal zu bestimmen, ob Behandlungen auf therapeutische Arteriogenese oder Angiogenese sind wirksam in kleinen Tiermodellen. Die Durchblutungsrückgewinnung nach Hinterlimbischämie, gemessen mit LDPI, korreliert gut mit der Entwicklung der Kollateralarterie, wenn sie mit anderen Mitteln wie Microfil-Guss oder Mikro-CT^10,11bewertet wird. Das Ziel dieses Protokolls ist es, die Beurteilung der Hinterbeinerperfusion mit LDPI zu demonstrieren.

Protokoll

Tierversuche wurden nach einem Protokoll durchgeführt, das vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of Washington genehmigt wurde.

1. Scanner-Vorbereitung

1. Passen Sie die Scannerhöhe so an, dass der Abstand zum gescannten Motiv ca. 30 cm beträgt.
2. Schalten Sie den Imager ein und starten Sie die zugehörige Software.
3. Öffnen Sie das Messprogramm. Wenn die Software korrekt mit dem Scanner kommuniziert, wird die Warnung zum Einschalten des Infrarotlasers angezeigt.
4. Kalibrieren Sie die Maschine mit vom Hersteller bereitgestellten Standards (nicht im Video dargestellt und hängen vom spezifischen Modell der verwendeten Maschine ab).
5. Passen Sie die Scannereinstellungen so an, dass sie für das Hintergrundmaterial und die Beleuchtungseinrichtung im Raum geeignet sind.
   1. Stellen Sie die Verstärkungsstufen DC FLUX und CONCgemäß den Anweisungen des Herstellers ein (nicht im Video gezeigt).
   2. Legen Sie den Hintergrundschwellenwert fest, indem Sie den Laserstrahl auf das schwarze Hintergrundmaterial zeigen, und drücken Sie Auto BK Set.

2. Maus-Vor-Scan-Vorbereitung

1. Richten Sie die isoflurane Induktionskammer mit entsprechender Aufräumarbeiten des Abgases ein.
   HINWEIS: Das Platzieren der Induktionskammer auf einem Wärmepolster hilft, den Temperaturverlust der Maus während der Anästhesieinduktion zu verhindern.
2. Schalten Sie die homöotherme Decke ein, die im Scanbereich unter einer nicht reflektierenden Oberfläche (in diesem Fall einem schwarzen Neoprengewebe) platziert wird. Stellen Sie die homeothermische Decke ein, um eine Körpertemperatur von 37 °C beizubehalten.
3. Positionieren Sie den Temperaturfühler für die hausotherme Decke und das Schmiermittel so, dass sie zum Einführen bereit sind.
4. Legen Sie die Anästhesiemaske und das Aufräumsystem im Scanbereich.
5. Anästhetisieren Sie die Maus mit einem Isofluran-Verdampfer. Stellen Sie die Sauerstoffrate auf 1 L/min des Durchflusses ein und stellen Sie das Isofluran e.V. auf 4% für die Anästhesieinduktion ein. Schalten Sie den Fluss in die Anästhesie-Induktionskammer ein, und die Atemfrequenz der Maus verlangsamt sich. Eine angemessene Anästhesie wird erreicht, wenn die Maus ihren Rechtenreflex verliert.
6. Die Maus mit angeschlossenem Abgasfänger auf eine Anästhesiemaske/Nasenkegel geben und das Isofluran auf 1,5% einstellen.
   HINWEIS: Dieser Anästhesiespiegel ist in der Regel ausreichend, um die Maus während des Scannens relativ still liegen zu halten, ist aber nicht dazu gedacht, chirurgische Anästhesieniveaus zu bieten, so dass die Tiefe der Anästhesie nicht überprüft wird. Die Änderung des Isofluranspiegels bewirkt Veränderungen des Herzschlags, der Atmung und dermaler Perfusion, so dass ein konsistenter Prozentsatz während jedes Zeitverlaufsexperiments und für alle Versuchspersonen verwendet werden sollte. Alternative Anästhesie-Techniken wie IP-Injektion von Ketamin Xylazin kann auch verwendet werden, aber die gleiche Anästhesie-Technik sollte während jeder Zeit-Kurs-Studie verwendet werden, da verschiedene Anästhetika dermal perfusion unterschiedlich beeinflussen.
7. (Optional je nach Scanbereich) Wenn die geplante Region von Interesse gescannt werden, durch Pelz bedeckt ist, verwenden Sie einen kleinen elektrischen Trimmer oder Enthaarungscreme, um das Haar aus dem Bereich des Interesses zu entfernen.
   HINWEIS: Die Enthaarungscreme sollte vollständig entfernt und die Maushaut vor dem Scannen getrocknet werden.
8. Platzieren Sie die Maus in der entsprechenden Scanposition auf der schwarzen, nicht reflektierenden Oberfläche, die die homöitome Decke bedeckt, und bestätigen Sie, dass beide Hinterbeine während des Ausgleichs und des Scannens auf der Wärmequelle verbleiben (Abbildung 1).
   HINWEIS: Es ist wichtig, beide Füße auf der homöothermen Decke zu halten, um regionale Temperaturschwankungen zu verhindern.
9. Setzen Sie den geschmierten rektalen Temperaturfühler ein, der mit der homeothermischen Decke verbunden ist.
10. Die Maustemperatur auf die gewünschte Scantemperatur (37 °C) ausdemieren; ca. 5-10 Minuten.
11. Wählen Sie Scanner-Setup aus,auf das über das obere Menü oder über das Scanner-Setup-Symbol zugegriffen werden kann. Passen Sie den Scanbereich an, indem Sie die X-Y-Koordinaten ändern, um den Interessenbereich zu berücksichtigen. Die Scangeschwindigkeit hängt von der Scanauflösung ab. Eine höhere Auflösung führt zu längeren Scanzeiten. Für wiederholtes Scannen mit Fokus auf globale Perfusion, im Gegensatz zu einer höheren Auflösung, die sich auf anatomische Perfusion konzentriert, ist eine Scangeschwindigkeit von 4 ms/Pixel ausreichend.
    HINWEIS: Höhere Auflösung und Einzelscan sollten in Betracht gezogen werden, wenn der Forscher versucht, die sich entwickelnde Kollateralzirkulation direkt zu untersuchen (am besten im ventralen Oberschenkel und Kalb abgebildet, wo es näher an der Haut ist). Wiederholter Scan mit niedrigerer Auflösung/Geschwindigkeit (z. B. 4 ms/Pixel) ist ausreichend, wenn die globale Perfusion bis zum Endorgan des Mausfußpads bewertet wird. Die im Video gezeigte Software lädt automatisch die zuvor verwendete Vorlage für Scanbereich, Geschwindigkeit und Auflösung beim Neustart, oder sie kann aus einer gespeicherten Datei abgerufen werden, wenn verschiedene Bereiche von Interesse für verschiedene Experimente verwendet werden.
12. Wenn Sie Wiederholungsscans durchführen, wählen Sie die Registerkarte Wiederholen und Zeilenscannen aus. Die Anzahl der Scans kann geändert werden (in diesem Fall 3 Scans) sowie das Wiederholungsintervall. Die Mindestzeit für das Wiederholungsintervall wäre die geschätzte Scanzeit, die im abgeblendeten Bereich auf der rechten Seite des Feldes angezeigt wird, der durch Scanbereich und Scanauflösung bestimmt wird. Wenn Sie einige Sekunden hinzufügen, kann der Benutzer die Maus zwischen den Scans anhalten und ggf. neu positionieren.

3. Scannen

1. Wählen Sie die Registerkarte Bildscan und die Schaltfläche Markieren aus. Der Laser wird bewegt, um den Scanbereich zu skizzieren. Passen Sie die Mausposition so an, dass sich das zu scannende Ziel innerhalb des markierten Bereichs befindet.
   HINWEIS: Beim Fußpolster- oder Fußpolster- und Wadenscannen bietet die anfällige Positionierung mit verlängerten Hinterbeinen einen konsistenteren Bereich von Interesse als die Supine-Positionierung. Die Femoralarterie und die halsbrecherische Arterie und die Kollateralen sind sehr nahe an der ventralen Oberfläche des Oberschenkels und des Kalbs, so dass die Supine-Positionierung bevorzugt wird, wenn diese Bereiche von Interesse verwendet werden.
2. Starten Sie die wiederholte Messung, indem Sie das Symbol Scannen wiederholen auswählen und die Wiedergabetaste drücken, um den Scan zu starten.
3. Bestätigen Sie den Scanabstand im Popup-Fenster, und klicken Sie auf OK, um mit dem Scannen zu beginnen.
4. Überwachen Sie die Maus beim Scannen auf Mausbewegung; Wenn sich die Maus so weit bewegt, dass sich die Hintermaus nicht mehr im Scanbereich in der Mitte eines Scans befindet, starten Sie den Scan neu. Kleine Variationen in der Maus-Hinterdpa-Position können in der Analysesoftware untergebracht werden.
5. Überwachen Sie die Maustemperatur während des Scanvorgangs, da sie auch bei Verwendung der homeothermischen Decke schwanken kann. Wenn die Maustemperatur zu stark variieren, kann dies zu erheblichen Abweichungen zwischen den Scans führen. Im Allgemeinen führt ein Temperaturbereich von 36,8-37,2 °C zu akzeptablen Daten.
6. Speichern Sie den erfassten Scan unter dem Fenster Speichern als mit einem Dateinamen, der Mausbezeichner und Zeitpunkt für eine einfachere Datenanalyse enthält. Geben Sie maus- und Zeitpunktdetails ein, falls gewünscht, im Fenster mit den Betreffdetails.
7. Schalten Sie das Isofluran aus und entfernen Sie die rektale Temperatursonde.
8. Desinfizieren Sie die rektale Temperatursonde mit 70% Ethanol, so dass sie für den Einsatz in der nächsten Maus bereit ist.
9. Lassen Sie die Maus von der Anästhesie bis zu dem Punkt erholen, an dem sie einen Rechtenreflex anzeigt, indem Sie von der Supine-Position in die anfällige Position kippen, bevor Sie sie in den Käfig zurückbringen.
   HINWEIS: Die Erholung kann entweder auf einer Wärmedecke für Isofluran durchgeführt werden, da die Erholung sehr schnell erfolgt, oder in einem erwärmten Rückgewinnungskäfig für Ketamin/Xylazin.

4. Erfassen von LDPI-Daten (Abbildung 3)

1. Öffnen Sie das Imaging Review-Softwareprogramm.
2. Wechseln Sie zum Dateimenü, öffnen Sie die gespeicherte Datei, und suchen Sie sie.
3. Wählen Sie das ROI-Symbol in der Symbolleiste aus.
4. Wählen Sie die Schaltfläche Polygon hinzufügen aus.
5. Verfolgen Sie den Bereich von Interesse (ROI) für die Steuerung hinterder Glied mit der Maus. Die Polygonablaufverfolgung muss nicht genau sein, da der graue Hintergrund nicht in die berechneten Durchschnittswerte einbezogen wird.
6. Wiederholen Sie die Schritte 4.3-4.5 für das chirurgische Hinterglied.
7. Wählen Sie das Symbol Statistik aus, um das Bild-ROIs-Statistikergebnisfenster (PU) zu öffnen.
8. Exportieren Sie die Ergebnisse für Polygon 1 (Control hindlimb) und Polygon 2 (chirurgisches Hinterglied) in ein Datenerfassungsarbeitsblatt per Kopie/Einfügen.

5. Analyse

1. Erfassen Sie die Daten als Chirurgisches/Kontrollverhältnis für jeden Scan.
2. Verwenden Sie die gemittelte Operation/Steuerung für alle drei Scans für den Datenpunkt für diese bestimmte Maus zu diesem Zeitpunkt. Aufgrund der biologischen Variabilität in der Reaktion auf Hinterlimb-Ischämie werden im Allgemeinen 8-10 Mäuse pro Zeitpunkt benötigt, um reproduzierbare Ergebnisse mit einem Standardfehler von 10 % zu erzielen.
   HINWEIS: Bevor die Maus von der Anästhesie erholt werden kann, lohnt es sich, eine schnelle Analyse der wiederholten Scans durchzuführen, um zu überprüfen, ob die Daten zu variabel sind (z. B. mehr als 100-150 Perfusionseinheiten zwischen den Scans 1-3). Eine hohe Streuung zwischen wiederholten Scans deutet darauf hin, dass die Maus während des Scans nicht vollständig ausgeglichen wurde (Abbildung 2), und ein Wiederholungsscan kann durchgeführt werden, ohne einen Datenpunkt zu verlieren, was auftreten würde, wenn die Bilder erst zu einem späteren Zeitpunkt analysiert werden. Das Ändern der Farbpalette zur Optimierung des dynamischen Bereichs der angezeigten Flusswerte kann erforderlich sein, um die Scanvariation besser anzuzeigen (Abbildung 2).

Ergebnisse

Erfolgreiche LDPI sollte zu konsistenten Wiederholungsmessungen führen, wobei nicht mehr als 100-150 Perfusionseinheiten variation (entsprechend etwa 10% der üblichen mittleren Perfusion für das Maus-Fußpad) zwischen den drei Scans(Abbildung 2) auftreten. Wie in Abbildung 2dargestellt, helfen Wiederholungsscans festzustellen, dass die Maus angemessen ausgeglichen wurde, so dass das ischämische/kontrollische Verhältnis den zugrunde liegenden Blutfluss am be...

Diskussion

Konsistente Technik ist entscheidend für die Erzielung zuverlässiger Ergebnisse mit LDPI. Die gleiche Anästhesie, Temperatureinstellungen, Mausposition und Interessenbereich sollten während des gesamten Zeitverlaufs verwendet werden. Verschiedene Anästhetika führen zu höheren oder niedrigeren Perfusionswerten⁹. Isoflurane Anästhesie ist bequem wegen seiner schnellen Beginn und Entstehung sowie allgemeine Sicherheit. Ein konsistenter Prozentsatz von Isofluran sollte als Tiefe der Anästhesi...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Black nonreflective material			Fabric store, black neoprene recommended by company
F/air cannister	A.M. Bickford Inc	80120
Homeothermic blanket with rigid metal probe	Harvard Apparatus		Also comes with flexible probe, but this is less durable
Isoflurane Anesthesia machine	Drager		Multiple manufacturers
Isoflurane induction chamber	VetEquip	941444	2 L chamber
Moor laser Doppler perfusion imager	Moor Instruments	MoorLDI2-IR	Higher resolution imager (MoorLDI2-HIR)
Mouse Anesthesia nose cone			Multiple manufacturers
Nair	Nair
Oxygen tank			Multiple manufacturers
Surgilube	Multiple distributors