Лазерная доплеровский перфузионной визуализации в мыши Hindlimb

Резюме

Здесь мы представляем протокол, который демонстрирует технику и необходимые элементы управления для лазерной доплеровой визуализации перфузии для измерения кровотока в задней части мыши.

Аннотация

Восстановление кровотока является критическим показателем исхода после экспериментальной ишемии хиндлимбой или ишемии-реперфузии. Лазерная доплеровая перфузия (LDPI) является распространенным, неинвазивным, повторяемым методом оценки восстановления кровотока. Техника вычисляет общий кровоток в отобранной ткани из доплеровского сдвига частоты, вызванного лазерными попаданиями движущихся красных кровяных телец. Измерения выражаются в произвольных перфузионых единицах, поэтому контралатеральные невмешательные на ногу, как правило, используются для управления измерениями. Глубина измерения находится в диапазоне 0,3-1 мм; для ишемии хиндлимбой, это означает, что дермальная перфузия оценивается. Дермальная перфузия зависит от нескольких факторов – самое главное температуры кожи и обезболивающее средство, которое должно быть тщательно контролируется, чтобы привести к надежным показаниям. Кроме того, пигментация волос и кожи может изменить способность лазера либо достичь или проникнуть в дерму. Эта статья демонстрирует технику LDPI в задней части мыши.

Введение

Язва кожи с недостаточным заживлением ран является основной причиной ампутаций у пациентов¹. Адекватное заживление ран требует более высоких уровней артериальной перфузии, чем это необходимо для поддержания нетронутой кожи, которая скомпрометирована у пациентов^{с периферической артериальной болезнью 2,3,4.} Несколько других ревматологических состояний и диабета также может привести к нарушенной и неадекватной микроциркуляции кожи, чтобы^{залечить раны 5,6}. Многие больные сахарным диабетом имеют сопутствующие периферические артериальные заболевания, что ставит их на особенно высокий риск ампутации. Лазерная перфузионная визуализация Доплера (LDPI) используется в клинических ситуациях для оценки микроциркуляции кожи, а также в исследовательских ситуациях для оценки кровотока и восстановления кровотока после экспериментальной ишемии хиндлимбо, ишемии-реперфузии и микрохирургических^{закрылков 7}.

Система LDPI проецирует малоэнездкую лазерный луч, который отклоняется сканирующее зеркало для перемещения по области, представляющие интерес. Это отличается от лазерной доплеровского потокаметрии, которая обеспечивает измерение перфузии для небольшой площади ткани в непосредственном контакте с зондом^{flowmetry 8}. Когда лазерный луч взаимодействует с двигающейся кровью в микроваскулатуре, он подвергается сдвигу частоты Доплера, который фотодехтируется сканером и преобразуется в произвольные единицы перфузии. Поскольку LDPI является световой техникой, он ограничен с точки зрения глубины проникновения до 0,3-1 мм, а это означает, что по большей части дермальная перфузия оценивается⁷. Кожный поток может быть изменен температурой кожи и симпатической нервной системы, которые могут быть затронуты различными анестезией⁹. Измерения от оптического лазера также повлияны на окружающими условиями освещения, пигментацией кожи, и могут быть прегражены overlying мехом или^{волосами 7.}

LDPI является наиболее часто используемым методом исследования для мониторинга восстановления перфузии после ишемии, потому что он неинвазивный, не требует контрастного введения, и имеет быстрое время сканирования, позволяющее сбор данных о нескольких животных. Это делает его идеальным, чтобы помочь определить, являются ли методы лечения, направленные на терапевтический артериогенез или ангиогенез являются эффективными в малых животных моделей. Восстановление кровотока после ишемии хиндлимбой, измеряемой LDPI, хорошо коррелирует с развитием сопутствующих артерий при оценке другими средствами, такими как литье микрофила или микро-КТ^10,11. Цель этого протокола состоит в том, чтобы продемонстрировать оценку перфузии хиндлимба с помощью LDPI.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Эксперименты на животных проводились в соответствии с протоколом, утвержденным Комитетом по институциональному уходу и использованию животных Университета Вашингтона.

1. Подготовка сканера

1. Отрегулируйте высоту сканера так, чтобы расстояние до отсканированного предмета составило около 30 см.
2. Включите изображение и запустите связанное с ним программное обеспечение.
3. Откройте программу измерения. Если программное обеспечение правильно общается со сканером, появится инфракрасный лазерный поворот на предупреждение.
4. Калибровка машины с производителем предусмотрены стандартами (не показано на видео и будет зависеть от конкретной модели используемой машины).
5. Отрегулируйте настройки сканера, чтобы быть подходящими для фонового материала и установки освещения в комнате.
   1. Установите уровни усиления DC FLUX и CONC, в соответствии с инструкциями производителя (не показано на видео).
   2. Установите фоновый порог, указывая лазерный луч на черный фоновый материал, и нажмите Auto BK Set.

2. Подготовка к предварительному сканированию мыши

1. Настройка изофлюрановой индукционной камеры с соответствующей очисткой ототголого газа.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Размещение индукционной камеры на нагревание площадку поможет предотвратить потерю температуры мыши во время индукции анестезии.
2. Включите гомеотермическое одеяло, которое помещается в зону сканирования под неотражающей поверхностью (в данном случае черная неопреновая ткань). Установите гомеотермическое одеяло для поддержания температуры тела 37 градусов по Цельсию.
3. Распоитите температурный зонд для гомеотермического одеяла и смазки, чтобы они были готовы к вставке.
4. Поместите анестезию маску и очистки системы в области сканирования.
5. Обезболивать мышь испарителем изофлюрана. Установите скорость кислорода до 1 л/мин потока и отрегулируйте изофлюран до 4% для индукции анестезии. Включите поток в индукционной камере анестезии, и скорость дыхания мыши замедлится. Адекватная анестезия достигается, когда мышь теряет свой правильный рефлекс.
6. Перенесите мышь в анестезиатичную маску/носовой конус с прикрепленным мусорщиком отвеченного газа и отрегулируйте изофлюран до 1,5%.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот уровень анестезии, как правило, достаточно, чтобы держать мышь лежала относительно еще во время сканирования, но не предназначен для обеспечения хирургического уровня анестезии, так что глубина анестезии не проверяется. Изменение уровня изофлорана вызывает изменения в сердцебиении, дыхании и дермальной перфузии, поэтому последовательный процент следует использовать на протяжении всего эксперимента в любое время курса и для всех экспериментальных субъектов. Альтернативные анестетические методы, такие как инъекция ИС кетамина ксилазина также могут быть использованы, но тот же анестетический метод должен быть использован на протяжении любого исследования курса времени, как различные анестетики влияют на кожные перфузии по-разному.
7. (Необязательно в зависимости от области сканирования) Если планируемый регион, представляющий интерес для сканирования, покрыт мехом, используйте небольшой электрический триммер или крем для удаления волос из области интереса.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Крем для депиляния должен быть полностью удален, а кожа мыши высушена перед сканированием.
8. Поместите мышь в соответствующее сканирующее положение на черной неотражающей поверхности, покрывающей гомеотермическое одеяло, подтверждая, что обе задние конечности остаются на источнике тепла на протяжении всего эквилибрациии сканирования (рисунок 1).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Важно поддерживать обе ноги на гомеотермическом одеяле, чтобы предотвратить региональные колебания температуры.
9. Вставьте смазаны ректальной температуры зонда, связанные с гомеотермическим одеялом.
10. Равноденствие температуры мыши до желаемой температуры сканирования (37 градусов по Цельсию); примерно 5-10 минут.
11. Выберите настройкусканера, доступ к которой можно получить из верхнего меню или из значка настройки сканера. Отрегулируйте область сканирования, изменив координаты X-Y с учетом области интересов. Скорость сканирования будет зависеть от разрешения сканирования. Более высокое разрешение приведет к более длительное время сканирования. Для повторного сканирования упором на глобальную перфузию, в отличие от более высокого разрешения упором на анатомические перфузии, скорость сканирования 4 мс / пиксель является адекватным.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Более высокое разрешение и одно сканирование следует рассматривать, если исследователь пытается непосредственно изучить развивающихся залоговой циркуляции (лучше всего изображены в брюшной бедра и теленка, где она ближе к коже). Повторное сканирование при более низком разрешении/скорости (например, 4 мс/пиксель) является адекватным при оценке глобальной перфузии до конечного органа подножки мыши. Программное обеспечение, показанное в видео, автоматически загружает ранее используемый шаблон для области сканирования, скорости и разрешения при перезагрузке, или его можно извлечь из сохраненного файла, если для различных экспериментов используются различные области интереса.
12. При выполнении повторных сканирований выберите вкладку Repeat and Line Scan. Количество сканирований может быть изменено (в данном случае 3 сканирования), а также интервал повторения. Минимальным временем для интервала повторения будет предполагаемое время сканирования, которое отображается в серой области справа от коробки, определяемой областью сканирования и разрешением сканирования. Добавление нескольких секунд позволяет пользователю приостановить и потенциально переместить мышь, если это необходимо между сканированием.

3. Сканирование

1. Выберите вкладку «Сканирование изображений» и выберите кнопку «Марк». Лазер будет двигаться, чтобы наметить область сканирования. Отрегулируйте положение мыши так, чтобы цель, которую нужно отсканировать, была в пределах отмеченной области.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для подножки или подножки для ног и сканирования теленка, склонные позиционирования с задними конечностями продлен обеспечивает более последовательную область интереса, чем положение на спине. Бедренная артерия и сафенозная артерия и коллатеры очень близки к брюшной поверхности бедра и теленка, поэтому позиционирование на спине предпочтительнее при использовании этих областей интереса.
2. Начните повторное измерение, выбрав значок повторного сканирования и нажмите кнопку воспроизведения, чтобы инициировать сканирование.
3. Подтвердите расстояние сканирования во всплывающем окне и нажмите OK, чтобы начать сканирование.
4. Мониторинг мыши во время сканирования движения мыши; если мышь движется достаточно, что задние лапы больше не находятся в области сканирования в середине сканирования, перезапустите сканирование. Небольшие изменения в положении заднего лапы мыши могут быть размещены в программном обеспечении анализа.
5. Мониторинг температуры мыши во время процесса сканирования, как это может колебаться даже с использованием гомеотермического одеяла. Если температура мыши слишком сильно разимелена, это может привести к значительным различиям между сканированием. Как правило, температурный диапазон 36,8-37,2 градуса по Цельсию приведет к приемлемым данным.
6. Сохраните захваченное сканирование под сохранением в качестве окна с именем файла, которое включает идентификатор мыши и временную точку для облегчения анализа данных. При желании введите данные мыши и точки времени в окне деталей темы.
7. Выключите изофлюран и удалите зонд прямой температуры.
8. Дезинфицировать ректальный зонд температуры с 70% этанола, поэтому он готов к использованию в следующей мыши.
9. Позвольте мыши оправиться от анестезии до точки, где она отображает правильный рефлекс, листая из положения на спине в положение лежа перед возвращением его в клетку.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Восстановление может быть осуществлено либо на потепление одеяло для изофлюрана, поскольку восстановление очень быстро или в разогретой клетке восстановления для кетамина / ксилазина.

4. Захват данных LDPI(рисунок 3)

1. Откройте программу обзора изображений.
2. Перейдите в меню файлов, откройте и найдите сохраненный файл.
3. Выберите значок roi из панели инструментов.
4. Выберите кнопку Добавить полигон.
5. Отслеживайте область интереса (ROI) для управления задняя часть с помощью мыши. Отслеживание полигонов не должно быть точным, так как серый фон не будет включен в расчетные средние показатели.
6. Повторите шаги 4.3-4.5 для хирургического заднего лапы.
7. Выберите значок Статистики, чтобы открыть окно результатов статистики ирисов изображений (PU).
8. Экспортируйте результаты для Polygon 1 (контроль hindlimb) и Polygon 2 (хирургический задний лист) на лист сбора данных через копию/вставка.

5. Анализ

1. Захват данных в качестве хирургического/ контрольного соотношения для каждого сканирования.
2. Используйте усреднивую хирургическую/контрольную для всех трех сканирований для точки данных для этой конкретной мыши в этот момент времени. Из-за биологической изменчивости в ответ на ишемию хиндлимба, в целом 8-10 мышей необходимы в точке времени для достижения воспроизводимых результатов со стандартной погрешностью в 10%.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Прежде чем позволить мыши оправиться от анестезии, стоит провести быстрый анализ повторных сканирований, чтобы проверить, если данные слишком изменчивы (например, более 100-150 единиц перфузии различных между сканирований 1-3). Высокая разница между повторными сканами позволяет предположить, что мышь не была полностью уравновешена во времясканирования (рисунок 2),и повторное сканирование может быть выполнено без потери точки данных, которая произойдет, если изображения не будут проанализированы до более поздней даты. Изменение цветовой палитры для оптимизации динамического диапазона отображаемых значений потока может быть необходимо для улучшения изменения сканирования дисплея(рисунок 2).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Успешное сканирование LDPI должно привести к последовательному повторному сканированию мер, при этом между тремя сканами (рисунок 2) должно быть не более 100-150 вариаций перфузииперфузии перфузии мыши. Как показано на рисунке 2, повторное сканирование помож?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Последовательный метод имеет решающее значение для получения надежных результатов с помощью LDPI. Один и тот же анестетик, настройки температуры, положение мыши и область интереса должны использоваться на протяжении всего курса времени. Различные анестетические средства приведут к бол...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Black nonreflective material			Fabric store, black neoprene recommended by company
F/air cannister	A.M. Bickford Inc	80120
Homeothermic blanket with rigid metal probe	Harvard Apparatus		Also comes with flexible probe, but this is less durable
Isoflurane Anesthesia machine	Drager		Multiple manufacturers
Isoflurane induction chamber	VetEquip	941444	2 L chamber
Moor laser Doppler perfusion imager	Moor Instruments	MoorLDI2-IR	Higher resolution imager (MoorLDI2-HIR)
Mouse Anesthesia nose cone			Multiple manufacturers
Nair	Nair
Oxygen tank			Multiple manufacturers
Surgilube	Multiple distributors