הדמיית זלוף דופלר לייזר בעכבר הינדלימב

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול המדגים את הטכניקה ואת הפקדים הדרושים עבור הדמיית זלוף דופלר לייזר כדי למדוד את זרימת הדם בעכבר hindlimb.

Abstract

התאוששות זרימת הדם היא מדד תוצאה קריטי לאחר איסכמיה אחורית ניסיונית או איסכמיה-רפרופוזיה. הדמיית זלוף דופלר לייזר (LDPI) היא שיטה נפוצה, פולשנית, חוזרת להערכת התאוששות זרימת הדם. הטכניקה מחשבת את זרימת הדם הכוללת ברקמה שנדגמה משינוי דופלר בתדירות שנגרם כאשר לייזר פוגע בתאי דם אדומים נעים. המדידות באות לידי ביטוי ביחידות זלוף שרירותיות, כך שההתבטאות הנגדית שאינה מתערבת ברגל משמשת בדרך כלל כדי לסייע בשליטה על המדידות. עומק המדידה הוא בטווח של 0.3-1 מ"מ; עבור איסכמיה hindlimb, משמעות הדבר היא כי זלוף עורי מוערך. זלוף עורי תלוי במספר גורמים – והכי חשוב טמפרטורת העור וסוכן הרדמה, אשר חייב להיות נשלט בקפידה כדי לגרום קריאות אמינות. יתר על כן, פיגמנטציה שיער ועור יכול לשנות את היכולת של הלייזר להגיע או לחדור הדרמיס. מאמר זה מדגים את הטכניקה של LDPI בעכבר hindlimb.

Introduction

כיב העור עם ריפוי פצעים לקוי הוא הגורם המוביל של קטיעות בחולים אנושיים¹. ריפוי פצעים נאות דורש רמות גבוהות יותר של זלוף עורקים מהנדרש כדי לשמור על עור שלם, אשר נפגע בחולים עם מחלת עורקים היקפית^2,3,4. מספר מצבים ראומטולוגיים וסוכרת אחרים יכולים גם להוביל microcirculation העור מופרע ולא מספיק כדי לרפא פצעים^5,6. חולי סוכרת רבים סובלים ממחלת עורקים היקפית בו זמנית, מה שמציב אותם בסיכון גבוה במיוחד לקטיעה. הדמיית זלוף דופלר לייזר (LDPI) משמש במצבים קליניים כדי להעריך את microcirculation העור, כמו גם במצבי מחקר כדי להעריך את זרימת הדם ואת זרימת הדם התאוששות לאחר איסכמיה hindlimb ניסיוני, איסכמיה-reperfusion, דש מיקרוכירורגי⁷.

מערכת LDPI מקרינה קרן לייזר בהספק נמוך המוסטת על-ידי מראה סריקה כדי לנוע מעל אזור מעניין. זה שונה מזרימה של דופלר לייזר, המספק מדידת זלוף עבור האזור הקטן של הרקמה במגע ישיר עם בדיקה flowmetry⁸. כאשר קרן הלייזר מקיימת אינטראקציה עם דם נע במיקרו-וסקולטורה, היא עוברת שינוי בתדר דופלר, אשר מובלט על ידי הסורק ומומר ליחידות זלוף שרירותיות. מכיוון ש- LDPI היא טכניקה מבוססת אור, היא מוגבלת מבחינת עומק החדירה ל- 0.3-1 מ"מ, כלומר לרוב זלוף עורי מוערך⁷. זרימה עורית יכולה להשתנות על ידי טמפרטורת העור ומערכת העצבים הסימפתטית, אשר עשוי להיות מושפע סוכני הרדמה שונים⁹. מדידות מהלייזר האופטי מושפעות גם מתנאי תאורת הסביבה, פיגמנטציה בעור, וניתן לחסום אותן על ידי פרווה או שיער⁷.

LDPI היא טכניקת המחקר הנפוצה ביותר לניטור התאוששות זלוף לאחר איסכמיה מכיוון שהיא לא פולשנית, אינה דורשת ניהול ניגודיות, ויש לה זמני סריקה מהירים המאפשרים איסוף נתונים על בעלי חיים מרובים. זה עושה את זה אידיאלי כדי לעזור לקבוע אם טיפולים שמטרתם arteriogenesis טיפולית או אנגיוגנזה יעילים מודלים בעלי חיים קטנים. התאוששות זרימת הדם לאחר איסכמיה hindlimb כפי שנמדד על ידי LDPI בקורלציה היטב עם פיתוח עורק בטחונות כאשר מוערך באמצעים אחרים כגון יציקת Microfil או מיקרו CT^10,11. מטרת פרוטוקול זה היא להדגים את ההערכה של זלוף hindlimb באמצעות LDPI.

Protocol

ניסויים בבעלי חיים בוצעו על פי פרוטוקול שאושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת וושינגטון.

1. הכנת סורק

1. כוונן את גובה הסורק כך שהמרחק לנושא הסרוק יהיה כ- 30 ס"מ.
2. הפעל את Imager ולהפעיל את התוכנה המשויכת.
3. פתח את תוכנית המדידה. אם התוכנה מקיימת תקשורת נכונה עם הסורק, תופיע אזהרת הפעלת לייזר אינפרא-אדום.
4. כייל את המכונה בתקנים שסופקו על-ידי היצרן (לא מוצג בסרטון ויהיה תלוי בדגם הספציפי של המכונה הנמצא בשימוש).
5. כוונן את הגדרות הסורק כך שיתאימו לחומר הרקע ולהגדרת התאורה בחדר.
   1. הגדר את רמות הרווח DC FLUX ו- CONC, לפי הוראות היצרן (לא מוצג בסרטון).
   2. הגדר את סף הרקע על-ידי הצבעה על קרן הלייזר בחומר הרקע השחור והקש על ערכת BK אוטומטית.

2. הכנת סריקה מראש של העכבר

1. הקם את תא האינדוקציה isoflurane עם ניקוי מתאים של גז הפסולת.
   הערה: הנחת תא האינדוקציה על משטח חימום תסייע במניעת אובדן טמפרטורת העכבר במהלך אינדוקציה להרדמה.
2. הפעל את השמיכה ההומאותרמית, הממוקמת באזור הסריקה מתחת למשטח לא רפלקטיבי (במקרה זה בד ניאופרן שחור). הגדר את השמיכה homeothermic כדי לשמור על טמפרטורת הגוף של 37 °C (69 °F).
3. מקם את גשוש הטמפרטורה עבור השמיכה ההומיותרמית וחומר הסיכה כך שהם מוכנים להכנסה.
4. מניחים את מסכת ההרדמה ומערכת הטיהור באזור הסריקה.
5. המשך את העכבר עם מאדה isoflurane. הגדר את קצב החמצן ל 1 L / min של זרימה ולהתאים את isoflurane ל 4% עבור אינדוקציה הרדמה. הפעל את הזרימה לתא האינדוקציה של ההרדמה, וקצב הנשימה של העכבר יאט. הרדמה נאותה מושגת כאשר העכבר מאבד את הרפלקס הימני שלה.
6. מעבירים את העכבר למסכת הרדמה/חרוט אף עם נבלות גז פסולת מחוברות ומתאימה את הישפולורן ל-1.5%.
   הערה: רמת הרדמה זו היא בדרך כלל מספיק כדי לשמור על העכבר שוכב בשקט יחסית במהלך הסריקה, אבל לא נועד לספק רמות כירורגיות של הרדמה, ולכן עומק ההרדמה אינו נבדק. שינוי רמת איזופלורן גורם לשינויים בקצב הלב, הנשימה והזלוף העורי, ולכן יש להשתמש באחוז עקבי לאורך כל ניסוי קורס הזמן ולכל הנבדקים הניסיוניים. טכניקות הרדמה חלופיות כגון הזרקת IP של קטמין xylazine ניתן להשתמש גם, אבל אותה טכניקת הרדמה יש להשתמש לאורך כל המחקר כמובן זמן כמו הרדמה שונים משפיעים על זלוף עורי באופן שונה.
7. (אופציונלי בהתאם לאזור הסריקה) אם האזור המתוכנן של עניין להיסרק מכוסה על ידי פרווה, להשתמש גוזם חשמלי קטן או קרם depilatory כדי להסיר את השיער מאזור העניין.
   הערה: יש להסיר לחלוטין את קרם הדפילטורי, ואת עור העכבר מיובש לפני הסריקה.
8. הנח את העכבר בתנוחת הסריקה המתאימה על המשטח השחור הלא רפטקטיבי המכסה את השמיכה הביתית, ותאשר ששני החלקים האחוריים נשארים על מקור החום לאורך שיווי המשקל והסריקה (איור 1).
   הערה: חשוב לשמור על שתי הרגליים על השמיכה homeothermic כדי למנוע וריאציה אזורית בטמפרטורה.
9. הכנס את בדיקת הטמפרטורה רקטלית משומנת הקשורים השמיכה הומאותרמית.
10. השווה את טמפרטורת העכבר לטמפרטורת הסריקה הרצויה (37 °C (67 °F); בערך 5-10 דקות.
11. בחר הגדרת סורק, שאליה ניתן לגשת מהתפריט העליון או מסמל הגדרת הסורק. התאם את אזור הסריקה על-ידי שינוי קואורדינטות X-Y כך שיתאימו לאזור העניין. מהירות הסריקה תהיה תלויה ברזולוציית הסריקה. רזולוציה גבוהה יותר תגרום לזמנים ארוכים יותר של סריקה. לסריקה חוזרת המתמקדת בזלוף גלובלי, בניגוד לרזולוציה גבוהה יותר המתמקדת בזלוף אנטומי, מהירות סריקה של 4 אלפיות השנייה/פיקסל מתאימה.
    הערה: יש לשקול רזולוציה גבוהה יותר וסריקה אחת אם החוקר מנסה לחקור ישירות את זרימת הערבות המתפתחת (התמונה הטובה ביותר בירך הגחון ובעגל שם הוא קרוב יותר לעור). סריקה חוזרת ונשנית ברזולוציה/מהירות נמוכה יותר (למשל, 4 אלפיות השנייה/פיקסל) מספיקה בעת הערכת זלוף גלובלי לאיבר הקצה של משטח הרגל של העכבר. התוכנה המוצגת בסרטון טוענת באופן אוטומטי את התבנית ששימשה בעבר לסריקת אזור, מהירות ורזולוציה בעת הפעלה מחדש, או שניתן לאחזר אותה מקובץ מאוחסן אם אזורים שונים של עניין משמשים לניסויים שונים.
12. בשעת ביצוע סריקות חוזרות, בחרו בכרטיסיה 'חזור' ו'סריקת קו'. ניתן לשנות את מספר הסריקות (במקרה זה 3 סריקות) כמו גם את מרווח הזמן לחזרה. הזמן המינימלי עבור מרווח הזמן לחזרה יהיה זמן הסריקה המשוער, המוצג באזור האפור שמימין לתיבה הנקבע על-ידי אזור הסריקה ורזולוציית הסריקה. הוספת מספר שניות מאפשרת למשתמש להשהות את העכבר ולמקם אותו מחדש במידת הצורך בין הסריקות.

3. סריקה

1. בחרו בכרטיסייה 'סריקת תמונות' ובחרו בלחצן 'סמן'. הלייזר יעבור כדי להתוות את אזור הסריקה. התאם את מיקום העכבר כך שהיעד לסריקה נמצא בתוך האזור המסומן.
   הערה: עבור פנקס רגליים או משטח רגל וסריקת עגל, מיקום נוטה עם hindlimbs המורחבת מספק אזור עקבי יותר של עניין מאשר מיקום סופי. עורק הירך ועורק saphenous ו בטחונות קרובים מאוד לפני השטח הגחוניים של הירך והעגל, ולכן מיקום סופי הוא המועדף אם משתמשים באזורים אלה של עניין.
2. התחל מדידה חוזרת על-ידי בחירה בסמל סריקה חוזרת ולחץ על לחצן 'הפעל' כדי ליזום את הסריקה.
3. אשר את מרחק הסריקה בחלון המוקפץ ולחץ על אישור כדי להתחיל בסריקה.
4. נטר את העכבר במהלך הסריקה לאיתור תנועת עכבר; אם העכבר זז מספיק כדי שהעכבות האחוריות לא יהיו עוד באזור הסריקה באמצע סריקה, הפעל מחדש את הסריקה. וריאציות קטנות בעמדת העכבר האחורי ניתן לאכלס בתוכנת הניתוח.
5. לפקח על טמפרטורת העכבר במהלך תהליך הסריקה כפי שהוא עשוי להשתנות אפילו עם השימוש בשמיכה הומאותרמית. אם יש שונות רבה מדי בטמפרטורת העכבר, הדבר עלול לגרום לשינוי משמעותי בין הסריקות. בדרך כלל, טווח טמפרטורות של 36.8-37.2 מעלות צלזיוס יגרום לנתונים מקובלים.
6. שמור את הסריקה שנלכדה תחת החלון שמירה בשם עם שם קובץ הכולל מזהה עכבר ונקודת זמן לניתוח נתונים קל יותר. הזן פרטי עכבר ונקודת זמן אם תרצה בחלון פרטי הנושא.
7. כבה את isoflurane ולהסיר את גשוש הטמפרטורה רקטלית.
8. לחטא את הבדיקה טמפרטורת רקטלית עם 70% אתנול כך שהוא מוכן לשימוש בעכבר הבא.
9. אפשר לעכבר להתאושש מהרדמה עד לנקודה שבה הוא מציג רפלקס ימני על ידי היפוך מהמיקום supine למצב נוטה לפני החזרתו לכלוב.
   הערה: התאוששות יכולה להתבצע גם על שמיכת התחממות עבור isoflurane מאז ההתאוששות היא מהירה מאוד או בכלוב התאוששות מחומם קטמין / xylazine.

4. לכידת נתוני LDPI (איור 3)

1. פתח את תוכנת סקירת ההדמיה.
2. עבור לתפריט הקובץ, פתח ואתר את הקובץ שנשמר.
3. בחר בסמל ההחזר על ההשקעה בסרגל הכלים.
4. בחרו בלחצן 'הוסף מצולע'.
5. עקוב אחר אזור העניין (ROI) עבור ה- hindlimb של הפקד באמצעות העכבר. מעקב מצולע אינו חייב להיות מדויק מכיוון שהרקע האפור לא ייכלל בממוצעים המחושבים.
6. חזור על שלבים 4.3-4.5 עבור hindlimb כירורגי.
7. בחר בסמל סטטיסטיקה כדי לפתוח את החלון תוצאות סטטיסטיקה של ROIs תמונה (PU).
8. יצא את התוצאות עבור מצולע 1 (בקרה hindlimb) ומצולע 2 (hindlimb כירורגי) לגליון עבודה איסוף נתונים באמצעות העתקה /הדבקה.

5. ניתוח

1. לכוד את הנתונים כיחס כירורגי/בקרה עבור כל סריקה.
2. השתמש בניתוח/בקרה בממוצע עבור כל שלוש הסריקות לאיתור נקודת הנתונים עבור עכבר מסוים זה בנקודת זמן זו. בגלל השונות הביולוגית בתגובה לאיסמיה hindlimb, באופן כללי 8-10 עכברים נדרשים בכל נקודת זמן כדי להשיג תוצאות לשחזור עם ~ 10% שגיאת תקן.
   הערה: לפני מתן אפשרות לעכבר להתאושש מהרדמה, כדאי לבצע ניתוח מהיר של הסריקות החוזרות ונשנות כדי לבדוק אם הנתונים משתנים מדי (למשל, יותר מ-100-150 יחידות זלוף שונות בין סריקות 1-3). שונות גבוהה בין סריקות חוזרות מצביעה על כך שהעכבר לא שוווה לחלוטין במהלך הסריקה (איור 2), וניתן לבצע סריקה חוזרת מבלי לאבד נקודת נתונים, שתתרחש אם התמונות לא ינותח עד למועד מאוחר יותר. ייתכן שיהיה צורך לשנות את לוח הצבעים כדי למטב את הטווח הדינמי של ערכי השטף המוצגים כדי להציג טוב יותר וריאציית סריקה (איור 2).

תוצאות

LDPI מוצלח אמור לגרום לסריקות חוזרות ונשנות עקביות, עם וריאציה של יחידת זלוף של לא יותר מ- 100-150 (המתאימה לכ- 10% מהזלוף הממוצע הרגיל עבור משטח הרגל של העכבר) בין שלוש הסריקות (איור 2). כפי שמודגם באיור 2, סריקות חוזרות מסייעות לקבוע שהעכבר שוווה כראוי כך שיחס איסכמי...

Discussion

טכניקה עקבית היא קריטית להשגת תוצאות אמינות עם LDPI. יש להשתמש באותם הרדמה, הגדרות טמפרטורה, מיקום העכבר ואזור העניין לאורך כל קורס הזמן. חומרי הרדמה שונים יגרמו לערכי זלוף גבוהים או נמוכים יותר⁹. הרדמה Isoflurane נוח בגלל הופעתה המהירה, כמו גם בטיחות כללית. אחוז עקבי של isoflurane יש להשתמ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Black nonreflective material			Fabric store, black neoprene recommended by company
F/air cannister	A.M. Bickford Inc	80120
Homeothermic blanket with rigid metal probe	Harvard Apparatus		Also comes with flexible probe, but this is less durable
Isoflurane Anesthesia machine	Drager		Multiple manufacturers
Isoflurane induction chamber	VetEquip	941444	2 L chamber
Moor laser Doppler perfusion imager	Moor Instruments	MoorLDI2-IR	Higher resolution imager (MoorLDI2-HIR)
Mouse Anesthesia nose cone			Multiple manufacturers
Nair	Nair
Oxygen tank			Multiple manufacturers
Surgilube	Multiple distributors