Imagem de perfusão doppler laser no hindlimb mouse

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo que demonstra a técnica e os controles necessários para a imagem de perfusão do Doppler laser para medir o fluxo sanguíneo na linha traseira do rato.

Resumo

A recuperação do fluxo sanguíneo é uma medida crítica após isquemia de subida experimental ou reperfusão de isquemia. A imagem de perfusão do doppler laser (LDPI) é um método comum, não invasivo e repetitivo para avaliar a recuperação do fluxo sanguíneo. A técnica calcula o fluxo sanguíneo geral no tecido amostrado da mudança do Doppler na frequência causada quando um laser atinge glóbulos vermelhos em movimento. As medidas são expressas em unidades arbitrárias de perfusão, de modo que o contralateral não intervindo sobre a perna é geralmente usado para ajudar a controlar as medidas. A profundidade de medição está na faixa de 0,3-1 mm; para isquemia de cetam hind, isso significa que a perfusão dérmica é avaliada. A perfusão dérmica depende de vários fatores — o mais importante é a temperatura da pele e o agente anestésico, que deve ser cuidadosamente controlado para resultar em leituras confiáveis. Além disso, a pigmentação do cabelo e da pele pode alterar a capacidade do laser de alcançar ou penetrar na dermis. Este artigo demonstra a técnica de LDPI no bloco traseiro do mouse.

Introdução

A ulceração da pele com cicatrização inadequada da ferida é uma das principais causas de amputações em pacientes humanos¹. A cicatrização adequada da ferida requer níveis mais elevados de perfusão arterial do que os necessários para manter a pele intacta, que está comprometida em pacientes com doença arterial periférica^2,3,4. Várias outras condições reumatológicas e diabetes também podem levar a microcirculação de pele perturbada e inadequada para curar feridas^5,6. Muitos pacientes diabéticos têm doença arterial periférica concomitante, colocando-os em risco especialmente alto de amputação. A imagem de perfusão do doppler laser (LDPI) é utilizada em situações clínicas para avaliar a microcirculação da pele, bem como em situações de pesquisa para avaliar o fluxo sanguíneo e a recuperação do fluxo sanguíneo após isquemia experimental de retalhos, isquemia-reperfusão e retalhos microcirúrgicos⁷.

O sistema LDPI projeta um raio laser de baixa potência que é desviado por um espelho de varredura para se mover sobre uma região de interesse. Isso difere da escoamento do Laser Doppler, que fornece uma medição de perfusão para a pequena área do tecido em contato direto com a sonda de esvoaçamento⁸. Quando o raio laser interage com o sangue em movimento na microvasculatura, ele sofre uma mudança de frequência Doppler, que é fotodesensificada pelo scanner e convertida em unidades arbitrárias de perfusão. Como o LDPI é uma técnica baseada na luz, é limitado em termos de profundidade de penetração a 0,3-1 mm, o que significa que na maior parte a perfusão dérmica é avaliada⁷. O fluxo dérmico pode ser alterado pela temperatura da pele e pelo sistema nervoso simpático, que pode ser afetado por vários agentes anestésicos⁹. As medidas do laser óptico também são afetadas por condições de iluminação ambiente, pigmentação da pele, e podem ser bloqueadas por peles ou^{cabelos excessivos 7}.

O LDPI é a técnica de pesquisa mais usada para monitorar a recuperação da perfusão após a isquemia porque não é invasiva, não requer administração de contraste, e tem tempos de varredura rápidos permitindo a coleta de dados em vários animais. Isso torna ideal ajudar a determinar se tratamentos voltados para arteriogênese terapêutica ou angiogênese são eficazes em pequenos modelos animais. A recuperação do fluxo sanguíneo após a isquemia de subida traseira medida medida pelo LDPI correlaciona-se bem com o desenvolvimento colateral da artéria quando avaliada por outros meios como fundição de Microfil ou micro-CT^10,11. O objetivo deste protocolo é demonstrar a avaliação da perfusão de liminar por meio do LDPI.

Protocolo

Os experimentos em animais foram realizados de acordo com um protocolo aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Washington.

1. Preparação do scanner

1. Ajuste a altura do scanner de modo que a distância até o sujeito digitalizado seja de aproximadamente 30 cm.
2. Ligue o imager e inicie o software associado.
3. Abra o programa de medição. Se o software estiver se comunicando corretamente com o scanner, o laser infravermelho liga o aviso será.
4. Calibrar a máquina com padrões fornecidos pelo fabricante (não mostrado no vídeo e dependerá do modelo específico da máquina que está sendo usada).
5. Ajuste as configurações do scanner para ser apropriado para o material de fundo e a configuração de iluminação na sala.
   1. Defina os níveis de ganho DC FLUX e CONC, de acordo com as instruções do fabricante (não mostradas no vídeo).
   2. Defina o limiar de fundo apontando o feixe de laser para o material de fundo preto e pressione o conjunto Auto BK.

2. Preparação de pré-digitalização do mouse

1. Configure a câmara de indução de isoflurane com a retirada adequada do gás residuais.
   NOTA: Colocar a câmara de indução em uma almofada de aquecimento ajudará a evitar a perda de temperatura do rato durante a indução da anestesia.
2. Ligue a manta homeotérmica, que é colocada na área de varredura sob uma superfície não refletida (neste caso um tecido de neoprene preto). Coloque a manta homeotémica para manter uma temperatura corporal de 37 °C.
3. Posicione a sonda de temperatura para a manta homeômica e lubrificante para que estejam prontos para inserção.
4. Coloque a máscara de anestesia e o sistema de limpeza na área de digitalização.
5. Anestesiar o rato com um vaporizador de isoflurano. Ajuste a taxa de oxigênio para 1 L/min de fluxo e ajuste o isoflurane para 4% para indução de anestesia. Ligue o fluxo para a câmara de indução da anestesia, e a taxa de respiração do rato diminuirá. A anestesia adequada é alcançada quando o rato perde o reflexo de redomamento.
6. Transfira o mouse para uma máscara anestésico/cone de nariz com carniceiro de gás de resíduo ligado e ajuste o isoflurane para 1,5%.
   NOTA: Este nível de anestesia é geralmente adequado para manter o rato relativamente parado durante a varredura, mas não se destina a fornecer níveis cirúrgicos de anestesia, de modo que a profundidade da anestesia não é verificada. A mudança do nível isoflurane causa alterações nos batimentos cardíacos, respiração e perfusão dérmica, de modo que uma porcentagem consistente deve ser usada durante qualquer experimento de curso de tempo e para todos os sujeitos experimentais. Técnicas anestésicas alternativas, como a injeção de IP de xilazina de cetamina também podem ser usadas, mas a mesma técnica anestésica deve ser usada ao longo de qualquer estudo de curso de tempo, pois diferentes anestésicos afetam a perfusão dérmica de forma diferente.
7. (Opcional dependendo da área de digitalização) Se a região planejada de interesse a ser escaneada for coberta por peles, use um pequeno aparador elétrico ou creme depilatório para remover os cabelos da região de interesse.
   NOTA: O creme depilatório deve ser completamente removido, e a pele do rato seca antes da digitalização.
8. Coloque o mouse na posição de varredura apropriada na superfície nãoreflectiva preta que cobre a manta homeotérmica, confirmando que ambos os blocos traseiros permanecem na fonte de calor durante todo o equilíbrio e varredura(Figura 1).
   NOTA: É importante manter os dois pés na manta homeotérmica para evitar a variação regional da temperatura.
9. Insira a sonda de temperatura retal lubrificada associada à manta homeotérmica.
10. Equilibre a temperatura do mouse à temperatura de varredura desejada (37 °C); aproximadamente 5-10 minutos.
11. Selecione Configuração do scanner, que pode ser acessada no menu superior ou no ícone de configuração do scanner. Ajuste a área de varredura alterando as coordenadas X-Y para acomodar a região de interesse. A velocidade do scan dependerá da resolução do scan. Uma resolução mais alta resultará em tempos de varredura mais longos. Para a repetição da varredura com foco na perfusão global, em oposição à maior resolução com foco na perfusão anatômica, uma velocidade de varredura de 4 ms/pixel é adequada.
    NOTA: Deve-se considerar maior resolução e tomografia única se o pesquisador estiver tentando estudar diretamente a circulação colateral em desenvolvimento (melhor imagem na coxa ventral e na panturrilha onde está mais próxima da pele). A varredura repetida em menor resolução/velocidade (por exemplo, 4 ms/pixel) é adequada ao avaliar a perfusão global ao órgão final do footpad do mouse. O software mostrado no vídeo carrega automaticamente o modelo usado anteriormente para área de digitalização, velocidade e resolução quando reiniciado, ou pode ser recuperado de um arquivo armazenado se diferentes regiões de interesse estiverem sendo usadas para vários experimentos.
12. Se realizar varreduras repetidas, selecione a guia 'Verificar repetição e de linha'. O número de varreduras pode ser alterado (neste caso 3 varreduras) bem como o intervalo de repetição. O tempo mínimo para o intervalo de repetição seria o tempo estimado de varredura, que é mostrado na área acinzentado à direita da caixa determinada pela área de varredura e resolução de varredura. Adicionar alguns segundos permite ao usuário pausar e potencialmente reposicionar o mouse se necessário entre as varreduras.

3. Digitalização

1. Selecione a guia Varredura de imagens e selecione o botão Marcar. O laser se moverá para delinear a área de varredura. Ajuste a posição do mouse para que o alvo a ser escaneado esteja dentro da área marcada.
   NOTA: Para o footpad ou footpad e a varredura da panturrilha, o posicionamento propenso com as plataformas traseiras estendidas fornece uma região de interesse mais consistente do que o posicionamento supino. A artéria femoral e artéria safena e as colaterais estão muito próximas da superfície ventral da coxa e da panturrilha, por isso o posicionamento supino é preferido se usar essas regiões de interesse.
2. Inicie a medição repetida selecionando o ícone "Repetindo" e pressione o botão Reproduzir para iniciar a varredura.
3. Confirme a distância de digitalização na janela pop-up e clique em OK para iniciar a digitalização.
4. Monitorar o mouse durante a varredura para o movimento do mouse; se o mouse se mover o suficiente para que as patas traseiras não estejam mais na região de digitalização no meio de uma varredura, reinicie a varredura. Pequenas variações na posição de pata traseira do mouse podem ser acomodadas no software de análise.
5. Monitore a temperatura do mouse durante o processo de varredura, pois ele pode flutuar mesmo com o uso da manta homeotérmica. Se houver muita variação na temperatura do mouse, isso pode resultar em uma variação significativa entre os scans. Geralmente, uma faixa de temperatura de 36,8-37,2 °C resultará em dados aceitáveis.
6. Salve a varredura capturada sob a janela Salvar como um nome de arquivo que inclui identificador de mouse e ponto de tempo para uma análise de dados mais fácil. Digite os detalhes do mouse e do ponto de tempo, se desejar na janela de detalhes do assunto.
7. Desligue o isoflurane e remova a sonda de temperatura retal.
8. Desinfete a sonda de temperatura retal com 70% de etanol para que esteja pronta para uso no próximo mouse.
9. Deixe que o mouse se recupere da anestesia até o ponto em que exibe um reflexo de direita, invertendo da posição supina para a posição propensa antes de devolvê-lo à gaiola.
   NOTA: A recuperação pode ser realizada em um cobertor de aquecimento para isoflurane, uma vez que a recuperação é muito rápida ou em uma gaiola de recuperação aquecida para cetamina/xilazina.

4. Captura de dados LDPI(Figura 3)

1. Abra o programa de software de revisão de imagens.
2. Vá para o menu do arquivo, abra e localize o arquivo salvo.
3. Selecione o ícone ROI na barra de ferramentas.
4. Selecione o botão Adicionar polígono.
5. Rastreie a região de interesse (ROI) para a montagem traseira de controle usando o mouse. O rastreamento do polígono não precisa ser exato, pois o fundo cinza não será incluído nas médias calculadas.
6. Repita as etapas 4.3-4.5 para a etapa posterior cirúrgica.
7. Escolha o ícone Estatísticas para abrir a janela RESULTADOS ESTATÍSTICAS de ESTATÍSTICAS (PU) da Imagem ROIs.
8. Exporte os resultados para Polygon 1 (controle hindlimb) e Polygon 2 (hindlimb cirúrgico) para uma planilha de coleta de dados via cópia/pasta.

5. Análise

1. Capture os dados como relação Cirúrgica/Controle para cada varredura.
2. Use a média cirúrgica/controle para todas as três varreduras para o ponto de dados para esse mouse em particular nesse ponto de tempo. Devido à variabilidade biológica na resposta à isquemia de subida traseira, em geral são necessários 8-10 camundongos por ponto de tempo para alcançar resultados reprodutíveis com ~10% de erro padrão.
   NOTA: Antes de permitir que o mouse se recupere da anestesia, vale a pena realizar uma análise rápida das varreduras repetidas para verificar se os dados são muito variáveis (por exemplo, mais de 100-150 unidades de perfusão diferentes entre as varreduras 1-3). A alta variação entre as varreduras repetidas sugere que o mouse não foi completamente equilibrado durante a varredura(Figura 2), e uma varredura repetida pode ser realizada sem perder um datapoint, o que ocorreria se as imagens não fossem analisadas até uma data posterior. Alterar a paleta de cores para otimizar a gama dinâmica de valores de fluxo exibidos pode ser necessário para exibir melhor a variação de varredura(Figura 2).

Resultados

O LDPI bem-sucedido deve resultar em medidas repetidas consistentes, com variação de unidade de perfusão de 100-150 (correspondente a cerca de 10% da perfusão média usual para o footpad do mouse) entre as três varreduras(Figura 2). Como demonstrado na Figura 2,as repetições ajudam a determinar que o camundongo foi adequadamente equilibrado de modo que a razão isquêmica/controle reflete melhor o fluxo sanguíneo subjacente em oposição à variação da...

Discussão

A técnica consistente é fundamental para obter resultados confiáveis com LDPI. O mesmo anestésico, as configurações de temperatura, a posição do mouse e a região de interesse devem ser usadas durante todo o curso de tempo. Diferentes agentes anestésicos resultarão em valores de perfusão maiores ou menores⁹. A anestesia isoflurane é conveniente devido ao seu rápido início e emergência, bem como à segurança geral. Uma porcentagem consistente de isoflurane deve ser usada como profun...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Black nonreflective material			Fabric store, black neoprene recommended by company
F/air cannister	A.M. Bickford Inc	80120
Homeothermic blanket with rigid metal probe	Harvard Apparatus		Also comes with flexible probe, but this is less durable
Isoflurane Anesthesia machine	Drager		Multiple manufacturers
Isoflurane induction chamber	VetEquip	941444	2 L chamber
Moor laser Doppler perfusion imager	Moor Instruments	MoorLDI2-IR	Higher resolution imager (MoorLDI2-HIR)
Mouse Anesthesia nose cone			Multiple manufacturers
Nair	Nair
Oxygen tank			Multiple manufacturers
Surgilube	Multiple distributors