Laser Doppler Perfusion Imaging dans l’hindlimb souris

Résumé

Ici, nous présentons un protocole qui démontre la technique et les contrôles nécessaires pour l’imagerie par perfusion Laser Doppler pour mesurer le flux sanguin dans l’arrière-point de la souris.

Résumé

La récupération de flux sanguin est une mesure critique de résultats après ischémie postérieuse expérimentale ou ischémie-reperfusion. La formation image de perfusion de Doppler de laser (LDPI) est une méthode commune, non invasive, reproductible pour évaluer la récupération de flux sanguin. La technique calcule le flux sanguin global dans le tissu échantillonné à partir du changement de fréquence Doppler causé lorsqu’un laser frappe les globules rouges en mouvement. Les mesures sont exprimées en unités de perfusion arbitraires, de sorte que la non-intervention contralatérale sur la jambe est généralement utilisée pour aider à contrôler les mesures. La profondeur de mesure est de l’ampleur de 0,3 à 1 mm; pour l’ischémie postérieures, cela signifie que la perfusion cutanée est évaluée. La perfusion cutanée dépend de plusieurs facteurs, notamment la température de la peau et l’agent anesthésique, qui doivent être soigneusement contrôlés pour aboutir à des lectures fiables. En outre, la pigmentation des cheveux et de la peau peut modifier la capacité du laser à atteindre ou pénétrer dans le derme. Cet article démontre la technique de LDPI dans l’arrière-point de souris.

Introduction

L’ulcération de peau avec la guérison inadéquate de blessure est une cause principale des amputations dans les patients^{humains 1.} La guérison adéquate de blessure exige des niveaux plus élevés de perfusion artérielle que sont nécessaires pour maintenir la peau intacte, qui est compromise dans les patients présentant la maladie artérielle périphérique^2,3,4. Plusieurs autres affections rhumatismologiques et le diabète peuvent également conduire à une microcirculation cutanée perturbée et inadéquate pour guérir les^{plaies 5,6}. Beaucoup de patients diabétiques ont la maladie artérielle périphérique concomitante, les plaçant à un risque particulièrement élevé pour l’amputation. La formation image de perfusion de Doppler de laser (LDPI) est employée dans des situations cliniques pour évaluer la microcirculation de peau, aussi bien que dans des situations de recherche pour évaluer le flux sanguin et la récupération de flux sanguin après ischémie expérimentale d’arrière-mot, ischémie-reperfusion, et ailerons microchirurgical^7.

Le système LDPI projette un faisceau laser de faible puissance qui est dévié par un miroir à balayage pour se déplacer sur une région d’intérêt. Cela diffère de la flowmétrie Laser Doppler, qui fournit une mesure de perfusion pour la petite zone de tissu en contact direct avec la sonde flowmetry⁸. Lorsque le faisceau laser interagit avec le sang en mouvement dans la microvasculature, il subit un changement de fréquence Doppler, qui est photodétecté par le scanner et converti en unités de perfusion arbitraires. Parce que LDPI est une technique basée sur la lumière, elle est limitée en termes de profondeur de pénétration à 0,3-1 mm, ce qui signifie que pour la plupart la perfusion cutanée est évaluée⁷. Le débit cutané peut être modifié par la température de la peau et le système nerveux sympathique, qui peut être affecté par divers agents anesthésiques⁹. Les mesures du laser optique sont également affectées par les conditions d’éclairage ambiant, la pigmentation de la peau, et peuvent être bloquées par la fourrure ou les cheveux^7.

LDPI est la technique de recherche la plus couramment utilisée pour surveiller la récupération de perfusion après ischémie parce qu’elle n’est pas invasive, ne nécessite pas d’administration de contraste, et a des temps d’analyse rapide permettant la collecte de données sur plusieurs animaux. Il est donc idéal d’aider à déterminer si les traitements destinés à l’artériogenèse thérapeutique ou à l’angiogenèse sont efficaces dans les modèles de petits animaux. La récupération du flux sanguin après ischémie postérieure mesurée par LDPI est bien corrélée avec le développement des artères collatérales lorsqu’elle est évaluée par d’autres moyens tels que la coulée de microfil ou le micro-CT^10,11. L’objectif de ce protocole est de démontrer l’évaluation de la perfusion postérieur à l’aide de LDPI.

Protocole

Les expériences sur les animaux ont été réalisées selon un protocole approuvé par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université de Washington.

1. Préparation du scanner

1. Ajustez la hauteur du scanner de sorte que la distance avec le sujet numérisé est d’environ 30 cm.
2. Allumez l’imageur et lancez le logiciel associé.
3. Ouvrez le programme de mesure. Si le logiciel communique correctement avec le scanner, le laser infrarouge allume l’avertissement apparaîtra.
4. Calibrer la machine avec des normes fournies par le fabricant (non indiquées dans la vidéo et dépendra du modèle spécifique de machine utilisée).
5. Ajustez les paramètres du scanner pour qu’ils conviennent au matériau de fond et à la configuration de l’éclairage dans la pièce.
   1. Définissez les niveaux de gain DC FLUX et CONC, selon les instructions du fabricant (non indiquées dans la vidéo).
   2. Définissez le seuil d’arrière-plan en pointant le faisceau laser vers le matériau de fond noir, et appuyez sur Auto BK Set.

2. Préparation de pré-balayage de souris

1. Mettre en place la chambre d’induction isoflurane avec le collecte approprié du gaz de déchets.
   REMARQUE : Placer la chambre d’induction sur un coussin chauffant aidera à prévenir la perte de température de la souris pendant l’induction de l’anesthésie.
2. Allumez la couverture homéothermique, qui est placée dans la zone de balayage sous une surface non réflexive (dans ce cas un tissu en néoprène noir). Réglez la couverture homéothermique pour maintenir une température corporelle de 37 °C.
3. Placez la sonde de température pour la couverture homéothermique et le lubrifiant afin qu’ils soient prêts pour l’insertion.
4. Placez le masque d’anesthésie et le système de balayage dans la zone de balayage.
5. Anesthésier la souris à l’aide d’un vaporisateur d’isoflurane. Réglez le taux d’oxygène à 1 L/min de débit et ajustez l’isoflurane à 4% pour l’induction d’anesthésie. Allumez le flux vers la chambre d’induction de l’anesthésie, et le taux de respiration de la souris ralentira. Une anesthésie adéquate est obtenue lorsque la souris perd son réflexe de droitage.
6. Transférer la souris dans un masque anesthésique/cône nasal avec un charognard à gaz de déchets attaché et ajuster l’isoflurane à 1,5 %.
   REMARQUE: Ce niveau d’anesthésie est généralement suffisant pour garder la souris couchée relativement immobile pendant le balayage, mais n’est pas destiné à fournir des niveaux chirurgicaux d’anesthésie, de sorte que la profondeur de l’anesthésie n’est pas vérifiée. Changer le niveau d’isoflurane provoque des changements dans le rythme cardiaque, la respiration et la perfusion cutanée, de sorte qu’un pourcentage constant doit être utilisé tout au long de toute expérience de cours de temps et pour tous les sujets expérimentaux. D’autres techniques anesthésiques telles que l’injection IP de kétamine xylazine peuvent également être utilisées, mais la même technique anesthésique doit être utilisée tout au long de n’importe quelle étude de cours de temps que différents anesthésiques affectent la perfusion cutanée différemment.
7. (Facultatif selon la zone de numérisation) Si la région d’intérêt prévue à numériser est couverte de fourrure, utilisez une petite tondeuse électrique ou une crème depilatory pour enlever les cheveux de la région d’intérêt.
   REMARQUE : La crème depilatory doit être complètement enlevée, et la peau de souris séchée avant balayage.
8. Placez la souris dans la position de balayage appropriée sur la surface noire non réflective qui recouvre la couverture homéothermique, confirmant que les deux limites postérieures demeurent sur la source de chaleur tout au long de l’équilibrage et de la numérisation (figure 1).
   REMARQUE : Il est important de maintenir les deux pieds sur la couverture homéothermique afin d’éviter les variations régionales de température.
9. Insérez la sonde de température rectale lubrifiée associée à la couverture homéothermique.
10. Equilibrer la température de la souris à la température de balayage désirée (37 °C); environ 5-10 minutes.
11. Sélectionnez Configuration scanner, qui peut être consulté à partir du menu supérieur ou à partir de l’icône de configuration du scanner. Ajustez la zone d’analyse en modifiant les coordonnées X-Y pour tenir compte de la région d’intérêt. La vitesse d’analyse dépendra de la résolution de l’analyse. Une résolution plus élevée se traduira par des temps d’analyse plus longs. Pour la numérisation répétée se concentrant sur la perfusion globale, par opposition à une résolution plus élevée se concentrant sur la perfusion anatomique, une vitesse de balayage de 4 ms/pixel est adéquate.
    REMARQUE : Une résolution plus élevée et un scan unique devraient être envisagés si le chercheur tente d’étudier directement la circulation collatérale en développement (mieux ci-contre la cuisse ventrale et le mollet où elle est plus proche de la peau). L’analyse répétée à une résolution/vitesse inférieure (p. ex., 4 ms/pixel) est suffisante pour évaluer la perfusion globale jusqu’à l’organe final du tapis de souris. Le logiciel affiché dans la vidéo charge automatiquement le modèle précédemment utilisé pour la zone de numérisation, la vitesse et la résolution lors du redémarrage, ou il peut être récupéré à partir d’un fichier stocké si différentes régions d’intérêt sont utilisées pour diverses expériences.
12. Si vous effectuez des analyses répétées, sélectionnez l’onglet Répéter et line scan. Le nombre d’analyses peut être modifié (dans ce cas 3 scans) ainsi que l’intervalle de répétition. Le temps minimum pour l’intervalle de répétition serait le temps de numérisation estimé, qui est indiqué dans la zone grisée à droite de la boîte déterminée par la zone d’analyse et la résolution de balayage. L’ajout de quelques secondes permet à l’utilisateur de mettre en pause et potentiellement de repositionner la souris si nécessaire entre les analyses.

3. Numérisation

1. Sélectionnez l’onglet Analyse d’image et sélectionnez le bouton Marque. Le laser se déplacera pour décrire la zone de balayage. Ajustez la position de la souris de sorte que la cible à numériser se trouve dans la zone marquée.
   REMARQUE : Pour le footpad ou le footpad et le calf scanning, le positionnement couché avec les limites postérieures étendues fournit une région d’intérêt plus cohérente que le positionnement supiné. L’artère fémorale et l’artère et les collatéraux saphenous sont très proches de la surface ventrale de la cuisse et du veau, ainsi le positionnement de supine est préféré si utilisant ces régions d’intérêt.
2. Commencez la mesure répétée en sélectionnant l’icône De numérisation répétée et appuyez sur le bouton Lecture pour lancer l’analyse.
3. Confirmez la distance de numérisation dans la fenêtre contexturée et cliquez sur OK pour commencer à numériser.
4. Surveillez la souris pendant la numérisation du mouvement de la souris; si la souris se déplace suffisamment pour que les pattes postérieures ne soient plus dans la région de balayage au milieu d’une analyse, redémarrez l’analyse. De petites variations de la position du hindpaw de souris peuvent être prises en compte dans le logiciel d’analyse.
5. Surveillez la température de la souris pendant le processus de balayage car elle peut fluctuer même avec l’utilisation de la couverture homéothermique. S’il y a trop de variation dans la température de la souris, cela peut entraîner des variations significatives entre les scans. En général, une plage de température de 36,8-37,2 °C donnera lieu à des données acceptables.
6. Enregistrez l’analyse capturée sous l’enregistrer comme fenêtre avec un nom de fichier qui inclut l’identificateur de souris et le point de temps pour faciliter l’analyse des données. Entrez les détails de la souris et du point de temps si désiré dans la fenêtre de détails du sujet.
7. Éteignez l’isoflurane et retirez la sonde de température rectale.
8. Désinfectez la sonde de température rectale avec 70% d’éthanol afin qu’elle soit prête à être utilisé chez la souris suivante.
9. Laissez la souris se remettre de l’anesthésie au point où elle affiche un réflexe de redressage en retournant de la position supine à la position couchée avant de la retourner à la cage.
   REMARQUE : La récupération peut être effectuée soit sur une couverture chauffante pour l’isoflurane puisque la récupération est très rapide, soit dans une cage de récupération réchauffée pour la kétamine/xylazine.

4. Capture des données LDPI (Figure 3)

1. Ouvrez le logiciel d’examen d’imagerie.
2. Allez au menu du fichier, ouvrez et localisez le fichier enregistré.
3. Sélectionnez l’icône ROI à partir de la barre d’outils.
4. Sélectionnez le bouton Ajouter polygone.
5. Tracez la région d’intérêt (ROI) pour l’arrière-point de contrôle à l’aide de la souris. Le traçage du polygone n’a pas besoin d’être exact car le fond gris ne sera pas inclus dans les moyennes calculées.
6. Répétez les étapes 4.3-4.5 pour l’arrière-train chirurgical.
7. Choisissez l’icône Statistiques pour ouvrir la fenêtre Résultats statistiques des IA d’image (PU).
8. Exportez les résultats pour polygone 1 (limite postérieur de commande) et Polygone 2 (limite postérieur chirurgicale) à une feuille de travail de collecte de données par copie/pâte.

5. Analyse

1. Capturez les données sous forme de rapport chirurgie/contrôle pour chaque analyse.
2. Utilisez la moyenne chirurgicale / contrôle pour les trois scans pour le point de données pour cette souris particulière à ce moment-là. En raison de la variabilité biologique dans la réponse à l’ischémie postérieur, en général 8-10 souris sont nécessaires par point de temps pour atteindre des résultats reproductibles avec ~10% d’erreur standard.
   REMARQUE : Avant de permettre à la souris de se remettre d’une anesthésie, il est utile d’effectuer une analyse rapide des scans répétés pour vérifier si les données sont trop variables (p. ex., plus de 100 à 150 unités de perfusion différentes d’une analyse à l’autre 1-3). Une variation élevée entre les balayages répétés suggère que la souris n’a pas été complètement equilibrée pendant l’analyse (figure 2), et un balayage répété peut être effectué sans perdre un point de données, ce qui se produirait si les images ne sont pas analysées avant une date ultérieure. Il peut être nécessaire de modifier la palette de couleurs pour optimiser la plage dynamique des valeurs de flux affichées afin de mieux afficher la variation de balayage (figure 2).

Résultats

Le succès de l’IPV devrait donner lieu à des analyses répétées cohérentes des mesures, avec une variation de l’unité de perfusion ne pas plus de 100 à 150 (correspondant à environ 10 % de la perfusion moyenne habituelle pour le tapis de souris) entre les trois scans (figure 2). Comme l’indique la figure 2,les balayages répétés aident à déterminer que la souris a été convenablement équilibrée de sorte que le rapport ischémique/de contrôl...

Discussion

Une technique cohérente est essentielle pour obtenir des résultats fiables avec LDPI. Le même anesthésique, les mêmes réglages de température, la position de la souris et la même région d’intérêt doivent être utilisés tout au long du cours du temps. Différents agents anesthésiques se traduira par des valeurs de perfusion plus ou moins^{élevées 9}. L’anesthésie isoflurane est pratique en raison de son apparition et de son émergence rapides ainsi que de sa sécurité globale. Un ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Black nonreflective material			Fabric store, black neoprene recommended by company
F/air cannister	A.M. Bickford Inc	80120
Homeothermic blanket with rigid metal probe	Harvard Apparatus		Also comes with flexible probe, but this is less durable
Isoflurane Anesthesia machine	Drager		Multiple manufacturers
Isoflurane induction chamber	VetEquip	941444	2 L chamber
Moor laser Doppler perfusion imager	Moor Instruments	MoorLDI2-IR	Higher resolution imager (MoorLDI2-HIR)
Mouse Anesthesia nose cone			Multiple manufacturers
Nair	Nair
Oxygen tank			Multiple manufacturers
Surgilube	Multiple distributors