Imaging perfusione Doppler laser nell'hindlimb del mouse

Riepilogo

Qui presentiamo un protocollo che dimostra la tecnica e i controlli necessari per l'imaging perfusione Laser Doppler per misurare il flusso sanguigno nell'arto posteriore del topo.

Abstract

Il recupero del flusso sanguigno è una misura critica del risultato dopo ischemia hindlimb sperimentale o ischemia-riperfusione. L'imaging perfusione Laser Doppler (LDPI) è un metodo comune, non invasivo e ripetibile per valutare il recupero del flusso sanguigno. La tecnica calcola il flusso sanguigno complessivo nel tessuto campionato dallo spostamento doppler della frequenza causato quando un laser colpisce i globuli rossi in movimento. Le misurazioni sono espresse in unità di perfusione arbitrarie, quindi il controfilettale non intervenuto sulla gamba viene solitamente utilizzato per aiutare a controllare le misurazioni. La profondità di misura è dell'intervallo di 0,3-1 mm; per l'ischemia dell'arto posteriore, ciò significa che viene valutata la perfusione dermica. La perfusione dermica dipende da diversi fattori, in particolare la temperatura cutanea e l'agente anestetico, che devono essere attentamente controllati per ottenere letture affidabili. Inoltre, la pigmentazione dei capelli e della pelle può alterare la capacità del laser di raggiungere o penetrare nel derma. In questo articolo viene illustrata la tecnica dell'LDPI nell'hindlimb del mouse.

Introduzione

L'ulcerazione cutanea con una guarigione inadeguata delle ferite è una delle principali cause di amputazioni nei pazienti umani¹. Un'adeguata guarigione delle ferite richiede livelli di perfusione arteriosa più elevati di quelli necessari per mantenere intatta la pelle, che è compromessa nei pazienti con malattia arteriosa periferica^2,3,4. Molte altre condizioni reumatologiche e diabete possono anche portare a microcircolo cutaneo disturbato e inadeguato per guarire le^{ferite 5,6}. Molti pazienti diabetici hanno una concomitante malattia arteriosa periferica, mettendoli a rischio particolarmente elevato di amputazione. L'imaging perfusione Laser Doppler (LDPI) viene utilizzato in situazioni cliniche per valutare il microcircolo cutaneo, nonché in situazioni di ricerca per valutare il flusso sanguigno e il recupero del flusso sanguigno dopo ischemia hindlimb sperimentale, ischemia-riperfusione e lembi microchirurgici⁷.

Il sistema LDPI proietta un raggio laser a bassa potenza che viene deviato da uno specchio di scansione per muoversi su una regione di interesse. Questo differisce dalla fluidmetria Laser Doppler, che fornisce una misurazione perfusione per la piccola area del tessuto a diretto contatto con la sonda di^{flussometria 8}. Quando il raggio laser interagisce con il sangue in movimento nella microvascolarizzazione, subisce uno spostamento di frequenza Doppler, che viene fotodetratto dallo scanner e convertito in unità di perfusione arbitrarie. Poiché l'LDPI è una tecnica leggera, è limitata in termini di profondità di penetrazione a 0,3-1 mm, il che significa che per la maggior parte la perfusione dermica viene^{valutata 7}. Il flusso dermico può essere alterato dalla temperatura della pelle e dal sistema nervoso simpatico, che può essere influenzato da vari agenti anestetici⁹. Le misurazioni dal laser ottico sono influenzate anche dalle condizioni di illuminazione ambientale, dalla pigmentazione della pelle e possono essere bloccate sovrascriendo pelliccia o capelli⁷.

LDPI è la tecnica di ricerca più comunemente utilizzata per monitorare il recupero della perfusione dopo l'ischemia perché non invasiva, non richiede la somministrazione del contrasto e ha tempi di scansione rapidi che consentono la raccolta dei dati su più animali. Questo lo rende ideale per aiutare a determinare se i trattamenti mirati all'arteriogenesi terapeutica o all'angiogenesi sono efficaci nei piccoli modelli animali. Il recupero del flusso sanguigno dopo l'ischemia dell'arto posteriore misurato dall'LDPI è ben correlato con lo sviluppo collaterale dell'arteria se valutato con altri mezzi come la fusione di Microfil o la micro-TC^10,11. L'obiettivo di questo protocollo è dimostrare la valutazione della perfusione dell'ostacolo utilizzando l'LDPI.

Protocollo

Gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti secondo un protocollo approvato dall'Institutional Animal Care and Use Committee dell'Università di Washington.

1. Preparazione dello scanner

1. Regolare l'altezza dello scanner in modo che la distanza dal soggetto scansionato sia di circa 30 cm.
2. Accendere l'imager e avviare il software associato.
3. Aprire il programma di misurazione. Se il software comunica correttamente con lo scanner, verrà visualizzato l'avviso di accendemento del laser a infrarossi.
4. Calibrare la macchina con gli standard forniti dal produttore (non mostrati nel video e dipenderanno dal modello specifico di macchina utilizzata).
5. Regolare le impostazioni dello scanner in modo che siano appropriate per il materiale di sfondo e la configurazione dell'illuminazione nella stanza.
   1. Impostare i livelli di guadagno DC FLUX e CONC, in base alle istruzioni del produttore (non visualizzate nel video).
   2. Impostate la soglia di sfondo puntando il raggio laser verso il materiale di sfondo nero e premete Auto BK Set.

2. Preparazione della pre-scansione del mouse

1. Impostare la camera di induzione dell'isoflurane con un'adeguata scavenging del gas di scarico.
   NOTA: Posizionare la camera di induzione su un tampone riscaldante aiuterà a prevenire la perdita di temperatura del mouse durante l'induzione dell'anestesia.
2. Accendere la coperta omeotermica, che viene posizionata nell'area di scansione sotto una superficie non riflettente (in questo caso un tessuto neoprene nero). Impostare la coperta omeotermica per mantenere una temperatura corporea di 37 °C.
3. Posizionare la sonda di temperatura per la coperta omeotermica e il lubrificante in modo che siano pronti per l'inserimento.
4. Posizionare la maschera di anestesia e il sistema di scavenging nell'area di scansione.
5. Anestetizzare il mouse con un vaporizzatore di isoflurane. Impostare la velocità dell'ossigeno su 1 L/min di flusso e regolare l'isoflurane al 4% per l'induzione dell'anestesia. Accendere il flusso alla camera di induzione dell'anestesia e la frequenza di respirazione del mouse rallenterà. Un'anestesia adeguata si ottiene quando il topo perde il riflesso di destro.
6. Trasferire il mouse su una maschera anestetica/cono del naso con spazzino di gas di scarico collegato e regolare l'isoflurane all'1,5%.
   NOTA: Questo livello di anestesia è generalmente adeguato per mantenere il topo relativamente fermo durante la scansione, ma non è destinato a fornire livelli chirurgici di anestesia, quindi la profondità dell'anestesia non viene controllata. La modifica del livello di isoflurane causa cambiamenti nel battito cardiaco, nella respirazione e nella perfusione dermica, quindi una percentuale costante dovrebbe essere utilizzata durante qualsiasi esperimento del corso di tempo e per tutte le materie sperimentali. Possono essere utilizzate anche tecniche anestetiche alternative come l'iniezione IP di chetamina xiazina, ma la stessa tecnica anestetica dovrebbe essere utilizzata durante qualsiasi studio del corso in qualsiasi momento poiché diversi anestetici influenzano la perfusione dermica in modo diverso.
7. (Facoltativo a seconda dell'area di scansione) Se la regione di interesse prevista da scansionare è coperta da pelliccia, utilizzare un piccolo trimmer elettrico o crema depilatoria per rimuovere i capelli dalla regione di interesse.
   NOTA: La crema depilatoria deve essere completamente rimossa e la pelle del mouse asciugata prima della scansione.
8. Posizionare il mouse nell'appropriata posizione di scansione sulla superficie nera non riflettente che copre la coperta omeotermica, confermando che entrambi gli arti posteriori rimangono sulla fonte di calore durante l'equilibrazione e la scansione (Figura 1).
   NOTA: È importante mantenere entrambi i piedi sulla coperta omeotermica per evitare variazioni regionali di temperatura.
9. Inserire la sonda di temperatura rettale lubrificata associata alla coperta omeotermica.
10. Equilibrare la temperatura del mouse alla temperatura di scansione desiderata (37 °C); circa 5-10 minuti.
11. Selezionare Configurazione scanner, a cui è possibile accedere dal menu in alto o dall'icona di configurazione dello scanner. Regolate l'area di scansione modificando le coordinate X-Y per adattarsi alla regione di interesse. La velocità di scansione dipenderà dalla risoluzione della scansione. Una risoluzione più elevata comporterà tempi di scansione più lunghi. Per la scansione ripetuta incentrata sulla perfusione globale, anziché su una risoluzione più elevata incentrata sulla perfusione anatomica, è adeguata una velocità di scansione di 4 ms/pixel.
    NOTA: Una risoluzione più elevata e una scansione singola dovrebbero essere prese in considerazione se il ricercatore sta tentando di studiare direttamente la circolazione collaterale in via di sviluppo (meglio immagine nella coscia ventrale e nel polpaccio dove è più vicina alla pelle). La scansione ripetuta a una risoluzione/velocità inferiore (ad esempio, 4 ms/pixel) è adeguata quando si valuta la perfusione globale all'organo finale del footpad del mouse. Il software mostrato nel video carica automaticamente il modello utilizzato in precedenza per l'area di scansione, la velocità e la risoluzione al riavvio oppure può essere recuperato da un file memorizzato se vengono utilizzate diverse regioni di interesse per vari esperimenti.
12. Se si eseguono scansioni ripetute, selezionare la scheda Ripeti e Scansione linea. Il numero di scansioni può essere modificato (in questo caso 3 scansioni) e l'intervallo di ripetizione. Il tempo minimo per l'intervallo di ripetizione sarebbe il tempo di scansione stimato, che viene visualizzato nell'area disattivata a destra della casella determinata dall'area di scansione e dalla risoluzione di scansione. L'aggiunta di alcuni secondi consente all'utente di mettere in pausa e potenzialmente riposizionare il mouse, se necessario, tra le scansioni.

3. Scansione

1. Selezionare la scheda Analisi immagine e selezionare il pulsante Segna. Il laser si muoverà per delineare l'area di scansione. Regolare la posizione del mouse in modo che la destinazione da scansionare si trova all'interno dell'area contrassegnata.
   NOTA: Per la scansione del pedante o del piede e del polpaccio, il posizionamento incline con gli arti posteriori estesi fornisce una regione di interesse più coerente rispetto al posizionamento supino. L'arteria femorale e l'arteria safenosa e i collaterali sono molto vicini alla superficie ventrale della coscia e del polpaccio, quindi il posizionamento supina è preferito se si utilizzano queste regioni di interesse.
2. Iniziare la misurazione ripetuta selezionando l'icona Ripeti scansione e premere il pulsante Riproduci per avviare la scansione.
3. Verificare la distanza di scansione nella finestra popup e fare clic su OK per iniziare la scansione.
4. Monitorare il mouse durante la scansione per il movimento del mouse; se il mouse si muove in modo sufficiente che le zampe posteriori non si trovano più nell'area di scansione nel mezzo di una scansione, riavviare la scansione. Piccole variazioni nella posizione della penna posteriore del mouse possono essere ospitate nel software di analisi.
5. Monitorare la temperatura del mouse durante il processo di scansione in quanto può fluttuare anche con l'uso della coperta omeotermica. Se c'è troppa variazione nella temperatura del mouse, ciò può comportare variazioni significative tra le scansioni. Generalmente, un intervallo di temperatura di 36,8-37,2 °C si tradurrà in dati accettabili.
6. Salvare l'analisi acquisita nella finestra Salva con nome con un nome di file che include l'identificatore del mouse e il punto di tempo per facilitare l'analisi dei dati. Immettere i dettagli del mouse e del punto di tempo, se lo si desidera, nella finestra dei dettagli dell'oggetto.
7. Spegnere l'isoflurane e rimuovere la sonda di temperatura rettale.
8. Disinfettare la sonda a temperatura rettale con il 70% di etanolo in modo che sia pronta per l'uso nel mouse successivo.
9. Lasciare che il mouse si riprenda dall'anestesia al punto in cui mostra un riflesso di destro lanciandosi dalla posizione supina alla posizione prona prima di restituirlo alla gabbia.
   NOTA: Il recupero può essere effettuato su una coperta riscaldante per isoflurane poiché il recupero è molto rapido o in una gabbia di recupero riscaldata per ketamina / xiloazina.

4. Acquisizione di dati LDPI (Figura 3)

1. Aprire il programma software di revisione dell'imaging.
2. Passare al menu file, aprire e individuare il file salvato.
3. Selezionare l'icona ROI dalla barra degli strumenti.
4. Selezionare il pulsante Aggiungi poligono.
5. Tracciare l'area di interesse (ROI) per l'ostacolo del controllo utilizzando il mouse. La traccia poligonale non deve essere esatta in quanto lo sfondo grigio non verrà incluso nelle medie calcolate.
6. Ripetere i passaggi 4.3-4.5 per l'arto posteriore chirurgico.
7. Scegliere l'icona Statistiche per aprire la finestra Risultati statistiche ROM immagine (PU).
8. Esportare i risultati per Poligono 1 (ostacolo di controllo) e Poligono 2 (ostacolo chirurgico) in un foglio di lavoro di raccolta dati tramite copia/incolla.

5. Analisi

1. Acquisire i dati come rapporto chirurgico/controllo per ogni scansione.
2. Utilizzare l'intervento/controllo medio per tutte e tre le scansioni per il punto dati per quel particolare mouse in quel punto di tempo. A causa della variabilità biologica nella risposta all'ischemia dell'arto posteriore, in generale sono necessari 8-10 topi per timepoint per ottenere risultati riproducibili con ~ 10% di errore standard.
   NOTA: Prima di consentire al mouse di riprendersi dall'anestesia, vale la pena eseguire una rapida analisi delle scansioni ripetute per verificare se i dati sono troppo variabili (ad esempio, più di 100-150 unità di perfusione diverse tra le scansioni 1-3). Variazioni elevate tra scansioni ripetute suggeriscono che il mouse non è stato completamente equilibrato durante la scansione (Figura 2) e una scansione ripetuta può essere eseguita senza perdere un punto dati, che si verificherebbe se le immagini non vengono analizzate fino a una data successiva. La modifica della tavolozza dei colori per ottimizzare l'intervallo dinamico di valori di flusso visualizzati potrebbe essere necessaria per visualizzare meglio la variazione della scansione (Figura 2).

Risultati

Il successo dell'LDPI dovrebbe comportare scansioni coerenti ripetute, con non più di 100-150 variazioni dell'unità di perfusione (corrispondenti a circa il 10% della perfusione media abituale per il pedano del mouse) tra le tre scansioni(Figura 2). Come illustrato nella figura 2, le scansioni ripetute aiutano a determinare che il mouse è stato opportunamente equilibrato in modo che il rapporto ischemico/controllo rifletta al meglio il flusso sanguigno sottos...

Discussione

Una tecnica coerente è fondamentale per ottenere risultati affidabili con LDPI. Lo stesso anestetico, le impostazioni di temperatura, la posizione del mouse e l'area di interesse devono essere utilizzati durante l'intero corso del tempo. Diversi agenti anestetici si tradurranno in valori di perfusione più o meno^{elevati 9}. L'anestesia isoflurana è conveniente a causa della sua rapida insorgenza ed emergenza, nonché della sicurezza generale. Una percentuale costante di isoflurane deve essere uti...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Black nonreflective material			Fabric store, black neoprene recommended by company
F/air cannister	A.M. Bickford Inc	80120
Homeothermic blanket with rigid metal probe	Harvard Apparatus		Also comes with flexible probe, but this is less durable
Isoflurane Anesthesia machine	Drager		Multiple manufacturers
Isoflurane induction chamber	VetEquip	941444	2 L chamber
Moor laser Doppler perfusion imager	Moor Instruments	MoorLDI2-IR	Higher resolution imager (MoorLDI2-HIR)
Mouse Anesthesia nose cone			Multiple manufacturers
Nair	Nair
Oxygen tank			Multiple manufacturers
Surgilube	Multiple distributors